關(guān)鍵詞：紫花苜蓿;低溫脅迫;甜菜堿;種子萌發(fā);呼吸電子傳遞

紫花苜蓿（Medicagosativa L.）是多年生豆科牧草（以下簡(jiǎn)稱苜蓿），在新疆廣泛栽培。由于新疆地區(qū)氣候條件特殊，春季“倒春寒”引起的低溫頻發(fā)，苜蓿在春季播種時(shí)常常遭受低溫的影響，萌發(fā)率降低，嚴(yán)重影響了后期苜蓿的生長(zhǎng)及產(chǎn)量，限制了苜蓿產(chǎn)業(yè)在新疆的發(fā)展。

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要階段，在吸脹期若遇0℃～12℃低溫，常發(fā)生吸脹冷害，延遲種子吸水膨脹及萌動(dòng)過(guò)程的進(jìn)行[1]，抑制淀粉分解酶活性，阻礙貯藏物質(zhì)的分解[2]，進(jìn)而嚴(yán)重影響作物苗期的生長(zhǎng)及后期產(chǎn)量形成[3]。種子吸水后的呼吸作用是種子萌發(fā)生長(zhǎng)為幼苗的前提，呼吸作用通過(guò)對(duì)種子內(nèi)貯藏物質(zhì)進(jìn)行氧化分解為種子萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)保證和能量供應(yīng)[4]。種子萌發(fā)過(guò)程中ATP 的產(chǎn)生主要依賴于線粒體呼吸電子傳遞和氧化磷酸化。電子傳遞主要是通過(guò)耦聯(lián)ATP 合成的細(xì)胞色素C 氧化酶（Cytochromecoxidase，COX）途徑進(jìn)行，但當(dāng)電子過(guò)剩時(shí)便會(huì)有大量電子外滲產(chǎn)生活性氧，此時(shí)植物細(xì)胞特有的交替氧化酶（Alternativeoxidase，AOX）途徑能夠有效的分流電子減少活性氧的產(chǎn)生。線粒體電子傳遞和氧化磷酸化完全依賴于線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。研究表明，低溫破壞了種子下胚軸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)尤其是線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性[5]，進(jìn)而影響種子呼吸作用最終影響種子的萌發(fā)。

甘氨酸甜菜堿（Glycinebetaine，GB）是一種季銨型水溶生物堿，是一種重要的滲透保護(hù)劑[6]，有效提高植物的抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)施加適量外源甜菜堿可以增強(qiáng)低溫脅迫下葉片葉綠素含量，光合作用能力以及植物細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)活性和抗氧化物質(zhì)積累，穩(wěn)定植物細(xì)胞膜進(jìn)而維持植物的抗寒性[7-8]。此外，姜秀梅等研究表明一定低濃度的外源甜菜堿顯著增加了低溫下辣椒（Capsicumannuum L.）種子的萌發(fā)指標(biāo)，而高濃度的甜菜堿則抑制其萌發(fā)[9]。目前外源甜菜堿對(duì)于紫花苜?？购缘难芯恐饕杏诙嘀孛{迫[10-12]以及對(duì)于植物幼苗根莖、葉片影響的研究[13-16]，施加外源甜菜堿在低溫脅迫下對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程尤其是萌發(fā)過(guò)程中的呼吸作用的影響鮮有報(bào)道。

因此本研究選取新疆廣泛種植的苜蓿品種‘新牧4號(hào)’為材料，研究外源甜菜堿對(duì)不同低溫（5℃，10℃和15℃）脅迫下苜蓿種子呼吸、萌發(fā)等相關(guān)生理指標(biāo)的影響，旨在為甜菜堿在苜蓿抗寒性的研究與應(yīng)用中提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為‘新牧4 號(hào)’紫花苜蓿（Medicagosativa L.‘XinmuNo.4’），供試種子于2022年從新疆烏魯木齊新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)陸港校區(qū)三坪基地采集。甜菜堿購(gòu)于上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同溫度下種子萌發(fā)試驗(yàn) 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)在5℃的溫度下外施5，10，15，20mmol·L-1的甜菜堿開(kāi)展種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，從而確定15mmol·L-1的甜菜堿能提高種子的萌發(fā)指標(biāo)，以此濃度的甜菜堿為后期實(shí)驗(yàn)的指定濃度。

選取顆粒飽滿，大小均勻的種子，用75%的乙醇消毒30s，再用蒸餾水沖洗三次，將種子整齊的置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿100粒種子。每個(gè)培養(yǎng)皿用移液槍加入3mL15mmol·L-1的甜菜堿，以加等量蒸餾水為對(duì)照。而后將其分別放置在5℃，10℃，15℃，20℃的培養(yǎng)箱中（光照/黑暗條件為12h/12h）進(jìn)行培養(yǎng)，從第二天開(kāi)始，每天同一時(shí)間觀察并記錄種子萌發(fā)情況，以胚根突破種皮2mm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)[17]。發(fā)芽過(guò)程中根據(jù)培養(yǎng)皿中平鋪的雙層濾紙的干濕程度，每天補(bǔ)充適量的蒸餾水，以防止水分被種子吸收或蒸發(fā)后導(dǎo)致甜菜堿濃度增加。

為研究低溫對(duì)種子萌發(fā)的影響機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩種種子萌發(fā)終止時(shí)間，其一以20℃種子萌發(fā)結(jié)束為萌發(fā)終止時(shí)間，其二以5℃種子萌發(fā)結(jié)束為萌發(fā)終止時(shí)間。

種子萌發(fā)按如下公式：

平均發(fā)芽時(shí)間（Meantimetogermination，MGT）=Σ（nt×t）/n;

式中：nt為第t天發(fā)芽數(shù)，n 為最終發(fā)芽數(shù)[18]。

1.2.2 不同溫度下種子呼吸速率的測(cè)定 各處理發(fā)芽結(jié)束后，選取在不同溫度下萌發(fā)的種子，分別在相應(yīng)下萌發(fā)溫度下測(cè)定種子的呼吸速率，以此來(lái)反映不同溫度下種子呼吸變化。根據(jù)Zhang等[19-20]的方法，利用OXYTHERM 氧電極（Hansatech，英國(guó)），在各自的處理溫度下測(cè)定不同呼吸途徑的呼吸速率。反應(yīng)室溫度由OXYTHERM 氧電極的控溫裝置自動(dòng)控制。于反應(yīng)杯中添加2.6mLPBS緩沖液，加入8粒提前稱好質(zhì)量、形態(tài)大小發(fā)芽狀態(tài)相似的種子，在黑暗中測(cè)定種子的耗氧速率，當(dāng)耗氧速率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，根據(jù)氧氣濃度的下降斜率計(jì)算種子總呼吸速率（Rtotal，μmol·m-2·s-1）。當(dāng)加入工作濃度為20mmol·L-1的SHAM 溶液后，測(cè)得種子COX呼吸的耗氧速率（RCox，μmol·m-2·s-1），AOX途徑呼吸速率為：RAox=Rtotal-RCox。根據(jù)上述方法分別測(cè)定不同溫度萌發(fā)條件下種子的不同呼吸途徑的呼吸速率。

1.2.3 不同溫度下種子生理指標(biāo)測(cè)定 將萌發(fā)結(jié)束后的種子進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)三次。超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD），過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD），過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性，過(guò)氧化氫（H2O2）均由相對(duì)應(yīng)的試劑盒（源于山東格銳思公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MicrosoftExcel2017 軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS26.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，采用軟件MicrosoftExcel2017，Origin2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源甜菜堿對(duì)不同處理下苜蓿種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，隨著溫度降低，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均會(huì)呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)，而平均發(fā)芽天數(shù)呈上升趨勢(shì)。在5℃，10℃下GB處理的苜蓿種子發(fā)芽率均顯著高于CK（Plt;0.05），在5℃，10℃下GB處理下的苜蓿種子發(fā)芽勢(shì)均高于CK 處理，5℃ 下GB 對(duì)提高種子發(fā)芽率的作用最顯著，10℃下GB 對(duì)提高種子發(fā)芽勢(shì)的作用最顯著（圖1A，1B）。在10℃下施用GB對(duì)減少種子發(fā)芽天數(shù)，種子發(fā)芽高峰期的提前效果顯著，在15℃，20℃下無(wú)顯著效果（圖1C，1D）。

2.2 外源甜菜堿對(duì)不同處理下苜蓿種子總呼吸、呼吸電子傳遞途徑的影響

由圖2可知，隨著溫度降低，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均會(huì)呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)，而平均發(fā)芽天數(shù)呈上升趨勢(shì)。在5℃，10℃，15℃下GB處理的苜蓿種子發(fā)芽率均顯著高于CK（Plt;0.05），在5℃，10℃下GB處理下的苜蓿種子發(fā)芽勢(shì)均高于CK 處理，5℃下甜菜堿對(duì)提高種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的作用最顯著（圖2A，2B）。在5℃，10℃下施用甜菜堿對(duì)減少種子發(fā)芽天數(shù)，提前種子發(fā)芽高峰期效果顯著，在其他溫度下無(wú)顯著效果（圖2C，2D）。

上述結(jié)果表明，低溫會(huì)顯著影響種子萌發(fā)進(jìn)程，但只是減緩種子萌發(fā)速率，并未終止種子萌發(fā)進(jìn)程，而施加甜菜堿有效促進(jìn)了低溫下苜蓿種子萌發(fā)速率，緩解了低溫對(duì)種子萌發(fā)進(jìn)程的抑制作用。

由圖3A 可知，隨著溫度的降低，總呼吸呼吸速率呈下降趨勢(shì)。在5℃，10℃，15℃，20℃下GB處理下種子總呼吸速率均顯著高于CK，隨著溫度的降低，GB對(duì)苜蓿種子的呼吸的提升作用逐漸增加，在5℃下的提升作用最為顯著（Plt;0.05）。這表明低溫顯著抑制了萌發(fā)種子的呼吸速率，甜菜堿能有效增強(qiáng)種子在低溫下的總呼吸速率，緩解低溫對(duì)種子的傷害。

COX呼吸途徑是呼吸過(guò)程中產(chǎn)生ATP的最主要電子傳遞途徑。由圖3B可發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低COX呼吸速率逐漸下降。在不同處理溫度下，GB處理的種子COX 呼吸速率均顯著高于CK，且隨著溫度的下降，GB對(duì)萌發(fā)種子COX 呼吸速率的提升程度逐漸增加，且在5℃下作用增加最大（Plt;0.05）。這表明，低溫顯著抑制了萌發(fā)種子COX 呼吸電子傳遞速率，從而減少了ATP 的產(chǎn)生。甜菜堿有效提升了低溫下COX呼吸從而維持了低溫下用于種子萌發(fā)的ATP的產(chǎn)生。

AOX呼吸途徑是非磷酸化途徑，由圖3C可發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低AOX 呼吸速率呈逐漸降低后趨于穩(wěn)定趨勢(shì)，在5℃，10℃，15℃下施加甜菜堿較CK處理提高種子AOX呼吸速率作用顯著，20℃下無(wú)顯著影響。這表明，低溫顯著抑制了電子傳遞，隨著溫度的增加，通過(guò)AOX 耗散電子的速率逐漸增加。甜菜堿對(duì)AOX呼吸電子傳遞的促進(jìn)隨著溫度的增加而逐漸減弱。上述結(jié)果表明，甜菜堿對(duì)萌發(fā)種子內(nèi)COX和AOX 途徑的呼吸速率的促進(jìn)作用隨著溫度的不同而不同。

不同途徑的呼吸占總呼吸的比率反映了線粒體電子傳遞的能量分配。如圖4A 所示，隨著溫度降低，COX呼吸途徑在總呼吸中的占比呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。GB處理對(duì)種子COX 呼吸在總呼吸中的占比的影響隨著溫度的增加逐漸減小。這表明，5℃低溫顯著抑制了萌發(fā)種子線粒體電子向COX呼吸途徑的傳遞，從而影響了ATP的產(chǎn)生，甜菜堿有效緩解了低溫對(duì)此過(guò)程的抑制作用。而隨著溫度的增加，電子向COX的分配逐漸增加并趨于正常，甜菜堿的作用逐漸減小。如圖4B所示，在5℃下，AOX呼吸占總呼吸的比率較高，10℃下最低，并且隨著溫度增加，AOX呼吸途徑在總呼吸中的占比呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。GB處理增加了AOX 呼吸途徑在總呼吸中的占比。這表明，5℃低溫對(duì)種子產(chǎn)生低溫傷害，并且產(chǎn)生過(guò)剩的電子需要通過(guò)AOX 消耗，甜菜堿處理減少了低溫對(duì)種子的傷害從而降低了AOX的占比。10℃開(kāi)始，低溫傷害減弱，隨著溫度的增加，總的電子流增加，產(chǎn)生的電子泄露增加，需要通過(guò)AOX耗散的能量也逐漸增加。甜菜堿處理提高了AOX呼吸的占比以此減少活性氧的產(chǎn)生。

綜上所述甜菜堿在不同溫度下對(duì)于不同呼吸途徑起到的作用不同，但在低溫脅迫下起到了一定的保護(hù)作用。在5℃低溫下，甜菜堿主要上調(diào)電子向COX的分配以產(chǎn)生ATP，隨著溫度的增加，甜菜堿對(duì)呼吸的上調(diào)作用主要表現(xiàn)在對(duì)AOX 呼吸途徑的影響。

2.3 外源甜菜堿對(duì)不同溫度下種子氧化還原平衡的影響

由圖5A 可知，苜蓿種子SOD活性隨溫度降低呈上升趨勢(shì)。在5℃下，GB處理顯著提升SOD 活性，在剩余溫度處理下提升效果不顯著。由圖5B可知，苜蓿種子POD 活性隨溫度降低呈上升趨勢(shì)。與CK相比，浸種15mmol·L-1的GB處理均提高了低溫脅迫下種子內(nèi)POD活性，在5℃，10℃，15℃下提升效果顯著，其中在5℃下效果最佳。由圖5C可知，苜蓿種子CAT 活性隨萌發(fā)溫度降低呈上升趨勢(shì)，而GB處理下的種子CAT活性均高于CK 處理下，在5℃，10℃，15℃提升效果顯著。由圖5D可知，隨溫度的降低種子內(nèi)H2O2 含量逐漸上升，在GB處理下H2O2 含量均低于CK 處理下，其中在5℃下降低顯著，其余溫度下GB處理有提高H2O2含量作用，但不顯著。

綜上所述，SOD，POD，CAT活性均隨萌發(fā)溫度上升逐漸降低，而甜菜堿處理下上述抗氧化酶活性均有提升，其中在5℃下提升作用最顯著。這說(shuō)明甜菜堿能增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低低溫下種子內(nèi)活性氧的積累，從而有效緩解低溫對(duì)種子的傷害。

3 討論

溫度是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，與對(duì)照相比，在一定的時(shí)間內(nèi)，低溫顯著抑制紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根長(zhǎng)，萌發(fā)高峰期也會(huì)隨著溫度降低而后延[21]，但低溫沒(méi)有終止苜蓿種子萌發(fā)過(guò)程，延長(zhǎng)低溫下萌發(fā)的時(shí)間，最終苜蓿種子仍可達(dá)到較高萌發(fā)率，且與常溫?zé)o差異。這說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)中5℃低溫脅迫并沒(méi)有對(duì)苜蓿種子產(chǎn)生不可逆的破壞，只是減緩了苜蓿種子萌發(fā)進(jìn)程。種子遭受低溫脅迫時(shí)，一方面會(huì)引起生物膜從液晶態(tài)變成凝膠態(tài)的變化;另一方面會(huì)引起膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的變化，即使膜上的各類酶活性受到影響，從而引起細(xì)胞生理生化發(fā)生異常變化[22]。種子萌發(fā)中，線粒體內(nèi)膜上呼吸電子傳遞中COX呼吸途徑產(chǎn)生的ATP為種子萌發(fā)提供了能力，是種子萌發(fā)的關(guān)鍵[5]。低溫脅迫下COX途徑的電子傳遞速率受到明顯的脅制，ATP合成受限，從而影響種子萌發(fā)。此外，低溫抑制呼吸電子傳遞過(guò)程，導(dǎo)致大量的電子泄露，活性氧產(chǎn)生[23];同時(shí)低溫顯著的抑制了苜蓿種子內(nèi)包括SOD、POD和CAT 在內(nèi)的活性氧清除酶的活性，最終導(dǎo)致H2O2 積累，對(duì)種子造成氧化傷害，最終影響了苜蓿種子的萌發(fā)。

外施甜菜堿可有效提高抗性緩解低溫脅迫對(duì)植物的傷害[24-25]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甜菜堿浸種在一定程度下可以緩解低溫脅迫對(duì)于種子萌發(fā)的影響，加快平均發(fā)芽時(shí)間，且隨著溫度的下降甜菜堿效果逐漸增加。這與前人研究發(fā)現(xiàn)使用一定濃度甜菜堿可以提高脅迫下種子各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)結(jié)論一致[26-27]。趙文靜等[5]研究表明，低溫下種子萌發(fā)過(guò)程中推動(dòng)ATP合成的COX呼吸貢獻(xiàn)更大，我們的研究表明甜菜堿處理提高了低溫下COX呼吸電子傳遞速率以及COX在總呼吸中的占比，這表明低溫下萌發(fā)種子呼吸作用受限的前提下，甜菜堿處理能調(diào)控電子傳遞向產(chǎn)生ATP的COX 呼吸途徑分配，用以產(chǎn)生較多的ATP供給種子萌發(fā)。張苗等[28]通過(guò)研究低溫下西葫蘆的研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可顯著提升低溫下西葫蘆（Cucurbitapepo L.）線粒體細(xì)胞色素細(xì)胞氧化酶活力，延緩ATP含量的下降，這進(jìn)一步佐證了甜菜堿通過(guò)維持低溫下ATP的含量進(jìn)而減緩低溫對(duì)植物的傷害。

在低溫下，甜菜堿增強(qiáng)細(xì)胞酶活性[29]，緩解低溫對(duì)細(xì)胞膜的傷害[30]，利于維持呼吸電子傳遞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，減少了活性氧的產(chǎn)生。此外，外施甜菜堿后苜蓿種子內(nèi)SOD，POD，CAT 等活性氧清除酶活性顯著增加，減少了苜蓿種子內(nèi)活性氧的積累，維持了種子內(nèi)的氧化還原平衡，緩解了低溫下苜蓿種子的氧化傷害，維持了苜蓿種子正常生理活性，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。并且甜菜堿對(duì)苜蓿種子萌發(fā)的促進(jìn)作用隨著溫度的下降而增大，其中5℃下提升作用最顯著。因此，在今后苜蓿種子生產(chǎn)加工過(guò)程中，可以以種子包衣等形式將甜菜堿預(yù)包裹種子，以促進(jìn)其在低溫下的萌發(fā)速率，從而擴(kuò)大苜蓿在寒冷地區(qū)的推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

外施甜菜堿有效緩解了低溫對(duì)苜蓿種子呼吸作用尤其是耦聯(lián)ATP產(chǎn)生的COX 呼吸途徑的抑制作用，此外，提升了活性氧清除系統(tǒng)的活性，緩解了低溫下種子萌發(fā)過(guò)程中的氧化傷害，縮短了種子萌發(fā)時(shí)間，促進(jìn)苜蓿種子在低溫下的萌發(fā)。甜菜堿對(duì)苜蓿種子萌發(fā)的促進(jìn)作用隨著溫度的下降而增大。