關(guān)鍵詞：蘇丹草;高丹草;轉(zhuǎn)錄組分析;分蘗調(diào)控;粗蛋白合成;木質(zhì)素合成

蘇丹草（Sorghumsudanense （Piper）Stapf.）是禾本科高粱屬重要的一年生暖季型（C4）禾本科牧草[1]。蘇丹草耐旱，產(chǎn)量高，營養(yǎng)價值高，在世界各地被作為重要飼料作物廣泛栽培[2-4]，素有“漁業(yè)青飼料之王”之美譽(yù)[5]。高丹草（Sorghum bicolor （Linn.）Moench.×Sorghumsudanense （Piper）Stapf.）為高粱（Sorghumbicolor （Linn.）Moench.）與蘇丹草（Sorghumsudanense（Piper）Stapf.）雜交而成的一年生禾本科牧草[6]，既有高粱的高產(chǎn)草量、高適應(yīng)性和強(qiáng)抗逆性等特點(diǎn)，也具有蘇丹草莖葉比小、強(qiáng)分蘗性和再生性、高營養(yǎng)價值等優(yōu)點(diǎn)，對農(nóng)區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)有著重要利用價值，目前已成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的首選飼料之一[7-8]。研究表明，飼用高粱（包括蘇丹草和高丹草）的株型是影響其產(chǎn)量的主要因素[9-11]。粗蛋白含量顯著影響飼用高粱的營養(yǎng)品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)價值[6，11-14]。飼用高粱的木質(zhì)素與植物體形態(tài)建成緊密相關(guān)[15-17]。

目前關(guān)于蘇丹草和高丹草的研究主要集中在引種栽培比較[18]、生物性狀比較[19]、干旱脅迫的生理響應(yīng)與抗旱性比較[20]、簡單重復(fù)序列標(biāo)記（Simplesequencerepeat，SSR）指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[21]等方面。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用組學(xué)技術(shù)解析牧草抵御逆境脅迫機(jī)制、挖掘關(guān)鍵農(nóng)藝性狀功能基因，成為目前研究關(guān)注的焦點(diǎn)[22]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（Transcriptomesequencing，RNA-seq）是研究飼用高粱表型和細(xì)胞功能的重要方法，也是挖掘飼用高粱重要性狀相關(guān)基因、揭示飼用高粱基因調(diào)控及表達(dá)規(guī)律的最有效工具之一[23]。目前，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)在高丹草[24]、蘇丹草[2]等單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）及等位基因特異性表達(dá)、SSR分子標(biāo)記開發(fā)及遺傳多樣性評價等研究中廣泛應(yīng)用，而關(guān)于飼用高粱分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)機(jī)理的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究還鮮有報道。盧倩倩等[6]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對高丹草進(jìn)行測序分析，最終獲得與高丹草粗蛋白合成相關(guān)的基因25個，其中20個基因在拔節(jié)盛期上調(diào)表達(dá)，5個基因在拔節(jié)盛期下調(diào)表達(dá)。

‘優(yōu)牧2號’高丹草和‘寧農(nóng)’蘇丹草是江西等南方省區(qū)普遍種植的一年生高產(chǎn)牧草品種，也是南方地區(qū)“糧改飼”種植模式的2種優(yōu)選牧草。有研究表明，大田栽培的‘優(yōu)牧2號’高丹草分蘗數(shù)低于‘寧農(nóng)’蘇丹草，‘優(yōu)牧2號’高丹草粗蛋白含量高于‘寧農(nóng)’蘇丹草，‘優(yōu)牧2號’高丹草比‘寧農(nóng)’蘇丹草更抗倒伏[25]。但‘優(yōu)牧2號’高丹草和‘寧農(nóng)’蘇丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)無相關(guān)報道，挖掘兩者分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因有利于其在江西的進(jìn)一步推廣種植。

本研究分別以‘優(yōu)牧2號’高丹草和‘寧農(nóng)’蘇丹草為材料，在建立其組培無菌體系的基礎(chǔ)上，對其分蘗數(shù)以及粗蛋白和木質(zhì)素含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和測定，再經(jīng)RNA-seq測序分析、差異基因篩選和鑒定，挖掘出與蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)的功能基因，并對蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，最后運(yùn)用SPSS24.0軟件對蘇丹草和高丹草試管苗的分蘗數(shù)、粗蛋白含量、木質(zhì)素含量以及分蘗調(diào)控、粗蛋白合成和木質(zhì)素合成相關(guān)功能基因qRT-PCR 的相對表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，初步揭示蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成的分子機(jī)制，以期為蘇丹草和高丹草品種選育及種質(zhì)創(chuàng)新等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘寧農(nóng)’蘇丹草（SDC）和‘優(yōu)牧2 號’高丹草（GDC）種子（由北京正道種業(yè)有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 無菌體系的建立 選取蘇丹草和高丹草大小均一且飽滿的種子，先用75%酒精處理1min，無菌沖洗3次后，再用0.1%氯化汞處理30min，無菌沖洗3次后，接種到MS固體培養(yǎng)基上，約20d后即可獲得蘇丹草和高丹草的試管苗（圖1）。

1.2.2 單株分蘗數(shù)的統(tǒng)計(jì)以及粗蛋白和木質(zhì)素含量的測定 將蘇丹草和高丹草的莖葉和根切除，保留植株基部，重新接種到新鮮的MS培養(yǎng)基上。60d后統(tǒng)計(jì)蘇丹草和高丹草的分蘗數(shù)，并測定蘇丹草和高丹草粗蛋白和木質(zhì)素的含量。單株分蘗數(shù)（Numberoftillers，NT）為每個處理萌發(fā)的總分蘗數(shù)/每個處理接種的植株數(shù)[26];蘇丹草和高丹草植株基部以上莖稈和葉片部分的粗蛋白（Crudeprotein，CP）含量利用近紅外光譜儀（SpectraStar2600XT 型，美國UnityScientific）進(jìn)行測定[6];蘇丹草和高丹草植株基部以上莖稈和葉片部分的木質(zhì)素（Lignin，LN）含量依據(jù)Schwanninger等[27]的Kason法進(jìn)行測定。

1.2.3 酶活性和內(nèi)源激素含量的測定 將蘇丹草和高丹草的莖葉和根切除，保留植株基部，重新接種到新鮮的MS培養(yǎng)基上。60d后取蘇丹草和高丹草植株基部以上的莖稈和葉片部分進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。依據(jù)帥良等[28]的方法提取果糖激酶（Fructokinase，F(xiàn)RK）并用紫外分光光度計(jì)測定FRK活性;依據(jù)王姣等[29]的方法測定苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性;依據(jù)黃樹蘋等[30]的比色法測定多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性;采用島津超高效液相色譜儀（LC-30AT）測定獨(dú)角金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）含量;采用反肉桂酸4-單加氧酶（Trans-cinnamate4-monooxygenase，C4H）ELISA 檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）測定反肉桂酸4-單加氧酶（C4H）活性。

1.2.4 RNA 的提取、cDNA 文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序 利用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）提取蘇丹草和高丹草植株基部以上的莖稈和葉片部分的RNA。RNA 濃度和純度采用Nanodrop2000進(jìn)行檢測，RNA 完整性采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，RIN 值采用Agilent2100進(jìn)行測定。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對蘇丹草（SDC）和高丹草（GDC）樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，測序平臺為illumina NovaSeq 6000 （illumina，USA）。生物學(xué)3次重復(fù)。

1.2.5 測序數(shù)據(jù)分析及基因注釋 高質(zhì)量序列（Cleanreads）的獲得采用原始數(shù)據(jù)過濾、GC含量分布及測序錯誤率檢查的方法。Cleanreads與高粱參考基因組數(shù)據(jù)庫（NCBIv3）（PRJCA012970）的比對采用HISAT2軟件[6]。所有轉(zhuǎn)錄本比對的六大數(shù)據(jù)庫為NR，Swiss-Prot，Pfam，COG，GO和KEGG數(shù)據(jù)庫。

1.2.6 差異基因的篩選與分析 對樣本間共有與特有表達(dá)基因/轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Venn分析和相關(guān)性分析?；?轉(zhuǎn)錄本ReadCounts的數(shù)目獲得后，進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1.2.7 分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測 為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的可靠性，利用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）提取蘇丹草和高丹草植株基部以上的莖稈和葉片部分的RNA;利用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript·First-StrandcDNASynthesisSuperMix）進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在篩選所得的與粗蛋白合成相關(guān)的差異表達(dá)基因中，隨機(jī)選取6 個，即TRINITY _DN21156_c0_g1（hexokinase-3，己糖激酶-3，HXK3）、TRINITY_DN5697_c0_g2（aspartateaminotransferase，chloroplastic，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASPAT ）、TRINITY_DN14734_c0_g1（fructokinase-2，果糖激酶2，F(xiàn)RK2）、TRINITY_DN46 _c0 _g2 （S-adenosylmethioninesynthase1，S-腺苷甲硫氨酸合成酶1，SAMS1）、TRINITY_DN31771_c0_g1（polyphenoloxidaseII，chloroplastic，多酚氧化酶II，PPOII）、TRINITY_DN12259_c0_g1（bifunctionalaspartokinase/homoserinedehydrogenase2，chloroplasticisoformX1雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2，AKI/DHI2）;在篩選所得的與木質(zhì)素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因中，隨機(jī)選取2 個，即TRINITY_DN15425_c0_g2（phenylalanineammonialyase，苯丙氨酸解氨酶，PAL）、TRINITY_DN21502_c0_g1（trans-cinnamate4-monooxygenase，反-肉桂酸4-單加氧酶，C4H ）;在篩選所得的與分蘗調(diào)控相關(guān)的差異表達(dá)基因中，隨機(jī)選取1個，即TRINITY_DN23078_c0_g2 （strigolactoneesteraseD14，獨(dú)角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14），以EIF4a 基因[31]作為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR分析。利用PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)引物，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量（Relativequantification，RQ值）。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;差異顯著性檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析采用SPSS19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹草和高丹草單株分蘗數(shù)及其粗蛋白和木質(zhì)素含量比較

由圖2可知，高丹草的單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草（Plt;0.05），蘇丹草的單株分蘗數(shù)是高丹草的1.78倍;但高丹草的粗蛋白和木質(zhì)素含量顯著高于蘇丹草（Plt;0.05），與蘇丹草相比，高丹草的粗蛋白和木質(zhì)素含量分別增加了50.19%和36.44%。

2.2 蘇丹草和高丹草酶活性和內(nèi)源激素含量的比較

由圖3可知，高丹草的獨(dú)角金內(nèi)酯（SLs）含量以及果糖激酶（FRK）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、反肉桂酸4-單加氧酶（C4H）活性顯著高于蘇丹草（Plt;0.05），與蘇丹草相比，高丹草的SLs含量以及FRK，PAL，PPO，C4H 活性分別增加57.88%，28.37%，58.27%，26.78%和44.14%。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與表達(dá)量分析

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組樣本表達(dá)unigene/transcript的表達(dá)量分布整體情況以及樣本unigene/transcript的表達(dá)量密度分布情況見圖4。由圖4可知，SDC組和GDC組表達(dá)量每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments（Fragmentsperkilobaseofexon modelper million mappedfragments，F(xiàn)PKM）的對數(shù)值在-1.5～4.5之間，表達(dá)量密度在0～0.8之間。

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組樣本間Venn分析和相關(guān)性分析見圖5。從圖5可知，蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組表達(dá)的共有基因數(shù)為30506，蘇丹草（SDC）組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)為4279，高丹草（GDC）組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)為8824，蘇丹草（SDC）組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于高丹草（GDC）組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù);蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.758，表明蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組樣本間相關(guān)性較強(qiáng)，重復(fù)性較好。

2.4 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析及注釋

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組表達(dá)量差異火山圖和表達(dá)量差異散點(diǎn)圖見圖6。由圖6可知，蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組共產(chǎn)生差異表達(dá)基因（Differentiallyexpressedgene，DEG）12415個，與蘇丹草（SDC）組比較，高丹草（GDC）組上調(diào)基因3903，下調(diào)基因8512。

2.5 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因GO 富集分析

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組差異表達(dá)基因GO 富集分析結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，基于GO功能注釋，差異表達(dá)基因顯著（Plt;0.05）富集到生物學(xué)過程（Biologicalprocess，BP）、細(xì)胞組分（Cellcomponene，CC）和分子功能（Molecularfunction，MF）3大類303個小類。在BP類別中，差異表達(dá)基因主要富集在翻譯（GO：0006412）、肽生物合成過程（GO：0043043）、肽代謝過程（GO：0006518）、酰胺生物合成過程（GO：0043604）、細(xì)胞酰胺代謝過程（GO：0043603）、細(xì)胞大分子生物合成過程（GO：0034645）等條目;在CC類別中，差異表達(dá)基因主要富集在胞質(zhì)小核糖體亞單位（GO：0022627）、核糖體小亞基（GO：0015935）、胞質(zhì)大核糖體亞基（GO：0022625）、核糖體大亞基（GO：0015934）、核糖體（GO：0005840）、細(xì)胞外區(qū)（GO：0005576）等條目;在MF類別中，差異表達(dá)基因主要富集在單加氧酶活性（GO：0004497）、水解酶活性（水解O-糖基化合物）（GO：0004553）、鐵離子結(jié)合（GO：0005506）、水解酶活性（作用于糖基鍵）（GO：0016798）、血紅素結(jié)合（GO：0020037）、結(jié)構(gòu)分子活性（GO：0005198）等條目。

2.6 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因KEGG 富集分析

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組差異表達(dá)基因KEGG富集分析結(jié)果見圖8。由圖8可知，2438個差異表達(dá)基因被注釋到131條代謝途徑中，KEGG富集的前20代謝通路包括核糖體、苯丙烷生物合成，基于天線蛋白的光合作用，半乳糖代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，二萜生物合成，類黃酮生物合成，脂肪酸延長，苯丙氨酸代謝，氰基氨基酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，萜、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，其他各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，異喹啉生物堿生物合成，新霉素、卡那霉素和慶大霉素的生物合成，α-亞麻酸代謝，亞油酸代謝，二苯乙烯類化合物、二芳基庚烷和姜酚生物合成，類固醇生物合成，果糖和甘露糖代謝等等代謝途徑中。其中，各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成活動較為活躍，可能是引起粗蛋白和木質(zhì)素含量變化的主要代謝途徑。

2.7 轉(zhuǎn)錄組分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達(dá)基因qRT-PCR 驗(yàn)證

為了進(jìn)一步挖掘蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成的相關(guān)基因，根據(jù)已公布的高粱基因組注釋情況[32]及發(fā)表的與分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)的文獻(xiàn)[6，33-34]來對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和確定，共獲得9個分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達(dá)基因。其中6個差異表達(dá)基因，即TRINITY_DN21156_c0_g1（hexokinase-3，己糖激酶-3，HXK3）、TRINITY _DN5697_c0 _g2 （aspartateaminotransferase，chloroplastic，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASPAT）、TRINITY_DN14734 _c0 _g1 （fructokinase-2，果糖激酶2，F(xiàn)RK2）、TRINITY_DN46 _c0 _g2 （S-adenosylmethioninesynthase1，S-腺苷甲硫氨酸合成酶1，SAMS1）、TRINITY_DN31771_c0_g1（polyphenoloxidaseII，chloroplastic，多酚氧化酶II，PPOII）、TRINITY_DN12259 _c0 _g1 （bifunctionalaspartokinase/homoserinedehydrogenase2，chloroplasticisoformX1雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2，AKI/DHI2）與粗蛋白合成相關(guān);2個差異表達(dá)基因，即TRINITY_DN15425_c0_g2（phenylalanineammonia-lyase，苯丙氨酸解氨酶，PAL ）、TRINITY_DN21502 _c0 _g1 （trans-cinnamate4-monooxygenase，反-肉桂酸4-單加氧酶，C4H ）與木質(zhì)素合成相關(guān);1個差異表達(dá)基因，即TRINITY_DN23078_c0_g2（strigolactoneesteraseD14，獨(dú)角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14）與分蘗調(diào)控相關(guān)。

9個分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量及其qRT-PCR 驗(yàn)證見表2。由表2可知，9個分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達(dá)基因在蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組中的表達(dá)程度稍有不同，但轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的表達(dá)趨勢與qRT-PCR 驗(yàn)證的趨勢一致。與蘇丹草（SDC）組相比，在高丹草（GDC）組中的8個基因上調(diào)表達(dá)，包括TRINITY_DN21156_c0_g1（hexokinase-3，己糖激酶-3，HXK3）、TRINITY_DN14734_c0_g1（fructokinase-2，果糖激酶2，F(xiàn)RK2）、TRINITY _DN5697 _c0 _g2 （aspartateaminotransferase，chloroplastic，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASPAT）、TRINITY_DN46_c0_g2（S-adenosylmethioninesynthase1，S-腺苷甲硫氨酸合成酶1，SAMS1）、TRINITY_DN31771_c0_g1（polyphenoloxidaseII，chloroplastic，多酚氧化酶II，PPOII）、TRINITY_DN12259 _c0 _g1 （bifunctionalaspartokinase/homoserinedehydrogenase2，chloroplasticisoformX1雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2，AKI/DHI2）、TRINITY_DN15425 _c0 _g2（phenylalanineammonia-lyase，苯丙氨酸解氨酶，PAL）、TRINITY _DN21502 _c0 _g1 （trans-cinnamate4-monooxygenase，反-肉桂酸4-單加氧酶，C4H ），1個基因下調(diào)表達(dá)，即TRINITY_DN23078_c0_g2（strigolactoneesteraseD14，獨(dú)角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14）。

2.8 生理生化指標(biāo)與分蘗調(diào)控、粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異基因表達(dá)的相關(guān)性分析

生理生化指標(biāo)與分蘗調(diào)控、粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異基因表達(dá)的相關(guān)性分析見表3。由表3可知，單株分蘗數(shù)（NT）與獨(dú)角金內(nèi)酯（SLs）含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01），與獨(dú)角金內(nèi)酯酯酶D14基因（SLsED14）相對表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01）;粗蛋白（CP）含量與己糖激酶-3（HXK3）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT ）、果糖激酶2（FRK2）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1（SAMS1）、雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2（AKI/DHI2）基因相對表達(dá)量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P lt;0.01），與果糖激酶2（FRK2）活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）;木質(zhì)素（LN）含量與多酚氧化酶（PPO）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、反肉桂酸4-單加氧酶（C4H）活性以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶II（PPOII）、反-肉桂酸4-單加氧酶（C4H ）基因相對表達(dá)量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01）。

3 討論

3.1 蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控關(guān)聯(lián)基因差異表達(dá)分析

分蘗是飼用高粱極為重要的性狀，決定飼用高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)，而分蘗是飼用高粱極為復(fù)雜的性狀，受多種環(huán)境和生理因素控制，其中包括激素調(diào)節(jié)和同化物的競爭[11]。有研究表明，刈割能增加蘇丹草比葉面積，降低其株高，增加其分蘗數(shù)，實(shí)現(xiàn)補(bǔ)償指數(shù)的增大[35];龐良玉等[19]的研究表明，蘇丹草的生長速度和分蘗、再生能力總體上優(yōu)于高丹草;許國成等[18]的研究也表明，與高丹草相比，蘇丹草的生育期短，分蘗能力和再生能力強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，在本試驗(yàn)中，高丹草的單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草，蘇丹草的單株分蘗數(shù)是高丹草的1.78倍。

獨(dú)腳金內(nèi)酯是一種控制禾本科植物分蘗的新激素，為倍半萜烯化合物，可抑制植物分蘗和側(cè)芽生長[34]。Hayward等[36]和Dun等[37]的研究揭示了獨(dú)角金內(nèi)酯的含量與分蘗增加的關(guān)系，即獨(dú)角金內(nèi)酯含量降低，分蘗增加。本研究結(jié)果也表明，高丹草的獨(dú)角金內(nèi)酯（SLs）含量顯著高于蘇丹草，與蘇丹草相比，高丹草的SLs含量增加57.88%;轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量及其qRT-PCR證實(shí)，與蘇丹草（SDC）組相比，高丹草（GDC）組的TRINITY_DN23078 _c0 _g2（strigolactoneesteraseD14，獨(dú)角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14）基因下調(diào)表達(dá)。獨(dú)角金內(nèi)酯酯酶起到水解獨(dú)角金內(nèi)酯的作用，高丹草（GDC）組的SLsED14 基因下調(diào)表達(dá)，表明與蘇丹草（SDC）組相比，高丹草（GDC）組獨(dú)角金內(nèi)酯含量較高，這與生理生化指標(biāo)一致;生理生化指標(biāo)與分蘗調(diào)控的相關(guān)性分析表明，單株分蘗數(shù)（NT）與獨(dú)角金內(nèi)酯（SLs）含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與獨(dú)角金內(nèi)酯酯酶D14基因（SLsED14）表達(dá)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，與蘇丹草相比，高丹草SLsED14 基因表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致SLs無法水解，引起SLs大量積累，在一定程度上抑制了分蘗和側(cè)芽的生長，最終導(dǎo)致其單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草。

3.2 蘇丹草和高丹草粗蛋白合成關(guān)聯(lián)基因差異表達(dá)分析

氮代謝是無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮以及氨基酸合成代謝的重要途徑，對飼用高粱品質(zhì)形成起著重要調(diào)節(jié)作用[6]。FRK 和HXK 可催化果糖和己糖磷酸化[28，38]，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT）可調(diào)控氮代謝[39]，三者均可通過影響植物生長周期來調(diào)控蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)粗蛋白的合成。Karmoker等[41]研究表明，SAMS可促進(jìn)硫代謝和谷胱甘肽代謝，調(diào)控飼用高粱粗蛋白的合成[40]。天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶（AKI/DHI）由thra 基因編碼，是蘇氨酸生產(chǎn)的限速酶，直接影響蛋白質(zhì)的合成[42]。研究表明，粗蛋白含量會顯著影響飼用高粱的營養(yǎng)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值[6]。有研究表明，與蘇丹草相比，高丹草富含糖類和多種氨基酸等營養(yǎng)成分，拔節(jié)盛期其粗蛋白含量高達(dá)14%以上，雜種優(yōu)勢明顯，應(yīng)用前景廣泛[7]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，在本試驗(yàn)中，高丹草的粗蛋白含量顯著高于蘇丹草，與蘇丹草相比，高丹草的粗蛋白含量增加了50.19%。究其原因，可能是與蘇丹草相比，高丹草的己糖激酶-3（HXK3）、果糖激酶2（FRK2）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1（SAMS1）、雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2（AKI/DHI2）等基因上調(diào)表達(dá)，造成高丹草的果糖激酶（FRK）活性增加。生理生化指標(biāo)與粗蛋白合成基因表達(dá)的相關(guān)性分析表明，粗蛋白（CP）含量與HXK3，ASPAT，F(xiàn)RK2，SAMS1，AKI/DHI2 基因表達(dá)均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與FRK2活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，與蘇丹草相比，高丹草HXK3，ASPAT，F(xiàn)RK2，SAMS1，AKI/DHI2 基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)RK2活性顯著增加，可能直接或間接促進(jìn)粗蛋白的合成。但許國成等[18]的研究表明，蘇丹草粗蛋白含量（11.2%）高于高丹草（6.8%），這可能是選用了低蛋白高丹草品種的緣故。盧倩倩等[6]也指出高丹草有高粗蛋白含量高丹草（GH）和低粗蛋白含量高丹草（GL）之分，GH 樣本的粗蛋白含量（10.53%）比GL樣本的粗蛋白含量（5.59%）高88.37%。這可能是因?yàn)楦叽值鞍缀扛叩げ荩℅H）的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等基因的表達(dá)量上調(diào)，從而導(dǎo)致其粗蛋白含量顯著高于低粗蛋白含量高丹草（GL）。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，與蘇丹草相比，高丹草的己糖激酶-3（HXK3）、果糖激酶2（FRK2）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1（SAMS1）、雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2（AKI/DHI2）等基因上調(diào)表達(dá)，說明在氮代謝途徑中，可能通過多種基因協(xié)同發(fā)揮作用，共同促進(jìn)高丹草氮同化，引起粗蛋白的積累。

3.3 蘇丹草和高丹草木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因差異表達(dá)分析

倒伏是飼用高粱生長發(fā)育過程中很常見的現(xiàn)象[17]。倒伏會造成飼用高粱莖稈疏導(dǎo)系統(tǒng)堵塞，養(yǎng)分和水分運(yùn)輸受阻，飼用高粱產(chǎn)量和品質(zhì)降低，從而嚴(yán)重制約了飼用高粱的穩(wěn)產(chǎn)栽培[43]。隨著對飼用高粱抗倒伏性研究的深入，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素在飼用高粱生長發(fā)育和抗倒伏方面發(fā)揮著重要的功能。PPO，C4H 和PAL的活性和含量直接影響飼用高粱木質(zhì)素合成的效率[44-47]。劉兆明等[48]的研究表明，蘇丹草新品系‘蘇牧3 號’的胚性愈傷組織在MS+3g·L-1活性炭+16h·d-1光照的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)21d，木質(zhì)素含量達(dá)到最高值18.11%，與木質(zhì)素合成相關(guān)的酶PAL的活性也達(dá)到最高值。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與蘇丹草相比，高丹草的木質(zhì)素含量分別增加了36.44%。究其原因，可能是與蘇丹草相比，高丹草的多酚氧化酶II（PPOII）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、反-肉桂酸4-單加氧酶（C4H ）基因上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致高丹草的PPO，PAL，C4H 活性顯著增加。生理生化指標(biāo)與木質(zhì)素合成基因表達(dá)的相關(guān)性分析表明，木質(zhì)素（LN）含量與PPO，PAL，C4H 活性以及PAL，PPOII，C4H 基因表達(dá)均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，與蘇丹草相比，高丹草PAL，PPOII，C4H 基因極顯著表達(dá)，PPO，PAL，C4H 活性顯著增加，可能直接或間接促進(jìn)木質(zhì)素的合成。

4 結(jié)論

高丹草的單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草，高丹草的粗蛋白和木質(zhì)素含量顯著高于蘇丹草。高丹草SLsED14 基因極顯著表達(dá)，可能導(dǎo)致SLs無法水解，引起SLs大量積累，在一定程度上抑制了分蘗和側(cè)芽的生長，最終導(dǎo)致其單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草。與蘇丹草相比，高丹草HXK3，ASPAT，F(xiàn)RK2，SAMS1，AKI/DHI2 基因極顯著表達(dá)，F(xiàn)RK2活性顯著增加，可能直接或間接促進(jìn)粗蛋白的合成。與蘇丹草相比，高丹草PAL，PPOII，C4H基因表達(dá)上調(diào)，PPO，PAL，C4H 活性顯著增加，可能直接或間接促進(jìn)木質(zhì)素的合成。