摘要：地方流行性牛白血病是一種嚴(yán)重的牛類傳染病，是由牛白血病病毒導(dǎo)致各種牛均可感染的一種慢性進行性腫瘤性疾病，嚴(yán)重時可致死。該病在全球流行范圍廣泛，可造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，特別是對奶牛產(chǎn)業(yè)危害巨大，需要引起重視。本文綜述地方流行性牛白血病的病原學(xué)基本情況、流行病學(xué)因素、診斷檢測方法和防控措施，為廣大牛養(yǎng)殖場戶防控本病提供一定參考。

關(guān)鍵詞：地方流行性牛白血病;診斷;檢測;預(yù)防與控制

地方流行性牛白血?。╡nzootic bovine leukosis，EBL），又名牛淋巴肉瘤、牛白血病復(fù)合癥等，該病的病原體是牛白血病病毒（bovine leukemia virus，BLV）[1]。奶牛、黃牛、牦牛等均可感染，主要表現(xiàn)為牛淋巴細(xì)胞持續(xù)性增生，產(chǎn)生進行性惡病質(zhì)，病死率高[2]。因其對動物構(gòu)成危害，可能造成一定程度的經(jīng)濟損失和社會影響，需要及時預(yù)防、控制，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中將其規(guī)定為三類動物疫病。

1 病原學(xué)

牛白血病病毒是一種只感染牛的病毒，與人類嗜T細(xì)胞病毒1型和2型（human T-cell lymphotropic virus，HTLV-1和HTLV-2）相近，屬于HTLV-1同一家族，同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科（retroviridae）丁型反轉(zhuǎn)錄病毒屬（deltaretrovirus），是一種RNA病毒，含單股鏈狀RNA[3-4]。BLV通過出芽增殖方式復(fù)制，即在細(xì)胞表面出芽增殖并釋放形成另一個新的個體。BLV對外界抵抗力不強，紫外線和反復(fù)凍融即可滅活，不耐熱，0.5%石炭酸、甲醛溶液也能使其失去活性。

2 流行病學(xué)

作為一種牛的重要傳染病，地方流行性牛白血病廣泛遍布于美洲、歐洲、亞洲、非洲等養(yǎng)牛地區(qū)，包括阿根廷、巴西和烏拉圭、中國、美國和加拿大等，因此世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將地方流行性牛白血病列為B類動物疫病。我國首次于1974年在上海發(fā)現(xiàn)本病，1978年鄧普輝等[5]首次報道在烏魯木齊發(fā)現(xiàn)該病，隨后江蘇、吉林等全國多個省區(qū)被發(fā)現(xiàn)。1982年杜念興等[6]對南京和上海地區(qū)奶牛進行了血清流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)陽性率較高。有調(diào)查顯示當(dāng)前我國奶牛場BLV陽性率較高，個別奶牛場的個體感染率甚至接近50%，牦牛BLV陽性率20.1%，但是肉牛感染率僅為1.6%。

感染病牛和隱性感染牛是最重要的傳染源，且終生帶毒。其自然感染宿主包括瘤牛、水牛、綿羊、水豚等，但在人工實驗條件下還可感染山羊、羊駝、兔子、大鼠和雞，甚至有學(xué)者在人類乳腺組織中發(fā)現(xiàn)了BLV核酸。BLV的傳播方式有病原體從母牛經(jīng)過子宮胎盤或產(chǎn)道傳染給胎兒的垂直傳播（vertical transmission），和病原體在牛個體之間的水平傳播（horizontal transmission）兩種。通過胚胎移植感染也可造成垂直傳播。水平傳播主要是通過血液、體液及分泌物接觸和吸血昆蟲機械叮咬等方式進行。

該病潛伏期長，一般3歲以上的感染牛才會表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。而肉牛普遍飼養(yǎng)周期在1～2年，所以臨床表現(xiàn)并不嚴(yán)重。奶牛飼養(yǎng)周期多在6～8年，所以癥狀更加明顯，造成的影響和經(jīng)濟損失更加明顯。

3 診斷方法

地方流行性牛白血病的臨床診斷主要是通過觸診發(fā)現(xiàn)體表腫大的淋巴結(jié)。而感染地方流行性牛白血病的牛大部分不會表現(xiàn)臨床癥狀，所以只是初步判斷。隨著科技手段的不斷進步，多種高度特異和靈敏的實驗室檢測方法為地方流行性牛白血病的診斷提供了可靠手段。常用的檢測方法包括病理組織形態(tài)學(xué)觀察、血清學(xué)試驗、PCR實驗等分子生物學(xué)檢測方法。

3.1 病理組織形態(tài)學(xué)觀察

將病牛剖檢后采集脾臟、淋巴結(jié)、心臟、肺臟、肝臟、腎臟等器官和肌肉等肉眼可見的淋巴細(xì)胞肉瘤等典型癥狀的組織[7]。用甲醛溶液、乙醇溶液等固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅染色鏡檢可見淋巴細(xì)胞惡性增生。由于病理組織學(xué)觀察只能在一定程度上提供參考，地方流行性牛白血病的確診仍需借助血清學(xué)或分子生物學(xué)等方法來做出診斷。

3.2 血清學(xué)檢測方法

地方流行性牛白血病常用的血清學(xué)檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附實驗和免疫瓊脂擴散實驗。

1）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附實驗基于特異性抗體與病原體相關(guān)抗原的結(jié)合反應(yīng)，通過檢測抗原-抗體反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化來判定是否感染地方流行性牛白血病。具有敏感性高、特異性強、高通量、簡便快速、成本較低等優(yōu)點。對于感染性低或潛在感染的個體也能較準(zhǔn)確地進行檢測，同時可以在一定程度上排除其他交叉反應(yīng)，結(jié)果較為可靠。但是在低水平抗體樣品的檢測中可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，同時由于交叉反應(yīng)、特定的樣品處理方式等造成假陽性結(jié)果。

2）免疫瓊脂擴散實驗（AGID）。AGID的原理是根據(jù)抗原與陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，在瓊脂中呈現(xiàn)為特異性的肉眼可見沉淀線，根據(jù)免疫沉淀線的形狀、相對遷移距離和大小來初步判斷被檢血清有無牛白血病病毒特異性抗體。需要注意，免疫瓊脂擴散實驗是一種初篩方法，對于BLV感染的陽性或陰性檢測結(jié)果只能作為參考。陽性樣本，需要進一步使用其他更敏感和特異性的檢測方法（如酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA或PCR）來確認(rèn)。

3）單克隆抗體技術(shù)（McAb）。單克隆抗體技術(shù)是一種高靈敏度和高特異性的診斷技術(shù)，通過制備和篩選單克隆抗體來特異性識別并定量檢測BLV抗原。單克隆抗體相比于多克隆抗體具有更高的特異性和一致性，因此可以用于早期診斷和監(jiān)測病毒的傳播，并在疫苗研發(fā)和監(jiān)測、病毒變異和抗藥性監(jiān)測等方面有廣泛的應(yīng)用前景。然而，單克隆抗體的制備和應(yīng)用需要一定的時間和技術(shù)成本，因此在實際生產(chǎn)中試劑價格較高。

3.3 分子生物學(xué)檢測方法——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

傳統(tǒng)檢測技術(shù)幾乎無法檢測到來自感染動物的新鮮腫瘤或外周血單核細(xì)胞樣本中BLV，但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于分子生物學(xué)檢測方法高度敏感的特點，克服了傳統(tǒng)檢測技術(shù)在檢測BLV基因的不足之處，使得BLV檢測技術(shù)得到極大提升，加快了BLV的檢測進程。目前常用的BLV分子生物學(xué)檢測方法包括普通PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR、LAMP等。

1）PCR反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）利用特異性引物定位到BLV基因組的特定區(qū)域，并通過DNA聚合酶擴增生成足夠數(shù)量的DNA片段，可用于直接檢測外周血BLV前病毒DNA的存在，靈敏性、特異性較高。普通PCR檢測的樣品類型包括疑似感染的牛的血液或其他組織樣品。由于需要進行瓊脂糖凝膠電泳分析觀察反應(yīng)結(jié)果，其靈敏性、特異性相對Nested PCR、Real-time PCR等方法來說較低。同時由于PCR實驗標(biāo)準(zhǔn)的實驗操作規(guī)程，包括個人防護、試劑消毒、質(zhì)控和質(zhì)量保證等方面的要求較高，需要在專業(yè)實驗室條件下及專業(yè)技術(shù)人員進行操作[7]。

2）熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是一種能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中的熒光信號的技術(shù)。通過在PCR反應(yīng)中加入熒光染料或熒光探針，在每個PCR循環(huán)中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物數(shù)量越多則熒光信號強度越強。通過實時檢測熒光信號的強度，可以實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)目變化。具有準(zhǔn)確、靈敏、快速檢測和可定量基因組中特定序列等優(yōu)點。熒光定量PCR方法相對于普通PCR、Nested PCR等方法敏感性、特異性更高，且不需要凝膠電泳這一步驟，操作更簡便，可用于早期診斷、防控效果評估和流行病學(xué)調(diào)查等方面的研究。但實驗室條件、儀器設(shè)備、試劑耗材等軟硬件條件要求更高，在實際應(yīng)用過程中，需要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行實驗，并結(jié)合其他技術(shù)和方法，綜合分析和解讀結(jié)果[8]。

3）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）通過使用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）和環(huán)介導(dǎo)引物，實現(xiàn)了在恒溫條件下（60～65 ℃）即可進行DNA的擴增和檢測，且擴增時間短，僅需15～60 min。相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的溫度控制步驟，具有儀器設(shè)備簡單、操作簡便、省時省力、檢測結(jié)果觀察易觀察等優(yōu)點，因此可以在簡單的實驗室條件下進行。

4 防控措施

地方流行性牛白血病為慢性持續(xù)性感染，目前為止，尚無有效的疫苗預(yù)防和針對性藥物治療方法，鑒于此病可能給畜牧養(yǎng)殖業(yè)和奶業(yè)造成的嚴(yán)重危害及經(jīng)濟損失，采取綜合的防控措施是根本任務(wù)。歐美發(fā)達國家通常采取監(jiān)測撲殺來根除這種病毒，但美國農(nóng)業(yè)部有研究報告稱監(jiān)測和撲殺血清陽性動物可能并不是控制該病最經(jīng)濟有效的方法，而通過實施綜合措施來預(yù)防疾病傳播可能性價比更高，取得的防控效果更好。因此其主要的防控措施包括：①重視引種安全，自繁自養(yǎng)，堅持“預(yù)防為主、防重于治”的原則，嚴(yán)格檢疫防止引入病牛，定期監(jiān)測淘汰陽性牛;②制定科學(xué)合理的消毒程序并嚴(yán)格執(zhí)行徹底殺滅養(yǎng)殖場內(nèi)的吸血昆蟲及幼蟲;③同時要在日常生產(chǎn)實踐中特別注意做好生物安全防護，切斷通過直接或間接接觸動物血液、分泌物等可能的傳播途徑，避免因手術(shù)、注射、打耳標(biāo)等生產(chǎn)活動可能引起的交叉感染。

參考文獻：

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