杜啟聯(lián) 宋恩峰 胡欽勇

腫瘤浸潤免疫細胞是指浸潤腫瘤及周圍組織的免疫細胞,隨腫瘤進展及治療發(fā)生動態(tài)改變,但其亞群組成和功能目前尚不完全清楚。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序技術受限于無法區(qū)分細胞亞群異質(zhì)性及樣本規(guī)模較小等缺陷,不能詳細分析數(shù)量少的免疫細胞如中性粒細胞,并且多用于前期實驗的驗證。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)能精確分析腫瘤浸潤免疫細胞在不同階段腫瘤中的免疫特征和功能狀態(tài)?，F(xiàn)就scRNA-seq在腫瘤浸潤免疫細胞中的研究進展和臨床應用做一綜述。

一、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

scRNA-seq基本研究流程包括樣本采集、單細胞分離、裂解、逆轉(zhuǎn)錄、互補DNA擴增、文庫構(gòu)建、高通量測序、數(shù)據(jù)處理及分析。

1.單細胞分離:scRNA-seq的關鍵在于快速、高效、準確地分離出高質(zhì)量單細胞。目前常用方法中微流控技術因其樣本消耗低、高靈敏度、費用經(jīng)濟的優(yōu)點而廣受歡迎[1]?；谝旱蔚奈⒘骺丶夹g(微液滴)是目前scRNA-seq最常用的高通量測序平臺,但微液滴受限于微孔直徑且對樣本要求高,新開發(fā)的單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序把組織抽核后制備成單細胞核懸液進行轉(zhuǎn)錄組測序,可以完全捕獲直徑較大或易破碎細胞的RNA信息,也可以對冷凍樣本測序[2]。

2.scRNA-seq測序技術:單細胞分離后,需盡快提取RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴增后生成cDNA庫。聚合酶鏈反應和體外轉(zhuǎn)錄擴增是構(gòu)建穩(wěn)定cDNA文庫的方法,隨后對文庫進行測序。scRNA-seq測序方案主要分為兩類:3'或5'端轉(zhuǎn)錄本測序和全長轉(zhuǎn)錄本測序。(1)3'或5'端轉(zhuǎn)錄本測序:2015年發(fā)現(xiàn)的Drop-seq和in Drop-seq開啟了微液滴技術的時代[3],這兩種基于液滴的技術通過帶有條形碼的磁珠分離單細胞且應用唯一分子標識符糾正偏差。目前scRNA-seq較為成熟的商用高通量測序平臺——10×Genomics,在降低成本、耗時少的同時顯著提高了細胞通量,已廣泛應用于腫瘤研究[4]。為提高測序深度和基因檢測的效率,Seq-Well和Seq-WellS3(第二鏈合成)相繼被開發(fā)[5]。scRNA-seq費用隨樣本數(shù)量增加。在降低費用方面,單細胞組合索引測序(sci-RNA-seq)和Sci-Plex的組合模式對于大規(guī)模的篩選實驗更加劃算,但相對繁瑣的操作會增加損傷細胞的風險[6]。綜上所述,3'或5'端轉(zhuǎn)錄本測序方法總體成本較低,能分析多重樣本但靈敏度相對較低,主要用于基因表達的定量。(2)全長轉(zhuǎn)錄本測序:Smart-seq2 是scRNA-seq 分析的標準方法之一,能發(fā)現(xiàn)可變剪接事件和等位基因特異性表達,在其基礎上開發(fā)了各有優(yōu)劣的Smart-seq3和Smart-seq3xpress[7]。Hahaut等[8]在Smart-seq3系列的基礎上開發(fā)了新的全長scRNA-seq方法,即FLASH-seq系列,能比Smart-seq3檢測更多的DNA分子,在減少資源消耗的同時還可以使用唯一分子標識符糾正誤差。然而,Smart-seq和FLASH-seq系列都不能測序細胞中所有RNA,如微小RNA。雖然測序過程仍然受到各種實際挑戰(zhàn),VASA-seq仍是目前唯一集高靈敏度、高效、高通量和全面覆蓋總RNA于一體的新技術[9]。全長轉(zhuǎn)錄本測序轉(zhuǎn)錄組覆蓋率較高,但費用和測序難度更高。

3.數(shù)據(jù)處理及分析:高通量測序后獲得的大量數(shù)據(jù)需要高效的計算機系統(tǒng)進行處理和分析。一般分析流程包括質(zhì)量控制、映射、標準化、聚類分析、后續(xù)分析。后續(xù)分析可進行基因本體論、基因富集分析、蛋白互作網(wǎng)絡分析,還可以通過擬時序軌跡分析追溯細胞分化軌跡等。

二、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在腫瘤浸潤免疫細胞中的應用潛力

1.發(fā)現(xiàn)新免疫細胞亞群及其功能:異質(zhì)性是腫瘤微環(huán)境的主要特征之一,scRNA-seq 可在單個細胞層面發(fā)現(xiàn)新的腫瘤浸潤免疫細胞亞群并明確其功能特征。scRNA-seq多應用于研究CD8+T細胞的免疫特征[10],但其他免疫細胞的功能表型同樣重要。Hiroshi等[11]使用scRNA-seq對6例非小細胞肺癌腫瘤微環(huán)境進行分析,鑒定了一簇發(fā)揮抗腫瘤作用的CD4+T細胞新亞群——輔助T細胞7R,能預測腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)和對程序性死亡受體1(PD-1)阻斷劑的敏感性。輔助T細胞不同亞群和調(diào)節(jié)性T細胞之間的比例與免疫微環(huán)境的促瘤或抑瘤狀態(tài)相關,可作為預測病人預后和免疫治療療效的標志物[12]。在一項霍奇金淋巴瘤的研究中,scRNA-seq確定了高表達LAG3 抑制受體的罕見調(diào)節(jié)性T細胞群體,是免疫抑制通路的介質(zhì)且有助于免疫逃逸,該亞群常出現(xiàn)在主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅱ陰性霍奇金淋巴瘤,與這種類型淋巴瘤病人不良預后相關。Chen等[13]在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)了一簇之前從未報道的表達CLEC9A髓樣樹突狀細胞新亞群,CLEC9A+樹突狀細胞與能預測鼻咽癌病人預后的EB病毒DNA水平呈顯著負相關,這可能是因為髓樣樹突狀細胞受到活躍EB病毒復制的影響。由CLEC9A+樹突狀細胞等髓系免疫細胞構(gòu)建的免疫特征與鼻咽癌病人生存結(jié)局的改善顯著相關。scRNA-seq能鑒定與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的新免疫細胞亞群,強調(diào)了未來多靶點聯(lián)合治療腫瘤的必要性。

2.追蹤腫瘤浸潤免疫細胞分化譜系和分布特點:(1)免疫細胞譜系分化:細胞發(fā)育分化是一個動態(tài)過程,大多數(shù)實驗技術只能捕捉細胞發(fā)育軌跡的瞬時狀態(tài)?；诨虮磉_的級聯(lián)變化等特征,scRNA-seq能展示不同免疫細胞的分化軌跡及其潛在機制。目前,scRNA-seq探索免疫細胞譜系分化的分析方法主要有兩種,一種是RNA速度分析,原理是未剪接和剪接的 RNA 之間是否處于平衡狀態(tài)可以作為基因是處于誘導狀態(tài)還是抑制狀態(tài)的一個指標;另一種是常用的擬時序分析,常用機器學習計算方法包括Monocle3 、SCORPIUS和TSCAN等,主要通過不同免疫細胞群體中的表達差異推測可能的分化軌跡[14]。腫瘤相關巨噬細胞亞群通過多種機制發(fā)揮促進或抑制腫瘤的作用,因此,腫瘤相關巨噬細胞分化軌跡對腫瘤進展意義重大。不同腫瘤的scRNA-seq研究證明腫瘤相關巨噬細胞經(jīng)常同時表達經(jīng)典的M1和M2基因[15-16]。擬時序分析發(fā)現(xiàn),腫瘤相關巨噬細胞在M1(促炎)和M2(促腫瘤)表型之間相互轉(zhuǎn)換。IRF2、IRF8、STAT2等轉(zhuǎn)錄因子可誘導巨噬細胞分化為抗腫瘤表型[17]。scRNA-seq還可以聯(lián)合抗原T細胞受體(TCR)庫進一步追蹤T細胞發(fā)育軌跡。T細胞分化軌跡可通過不同狀態(tài)細胞的TCR重疊率表示。例如,腫瘤浸潤CD8+T細胞主要來源于干細胞樣CD8+T細胞的局部擴增,scRNA-seq聯(lián)合TCR測序在多種腫瘤中證明CD103+CD69+組織駐留記憶T細胞和GZMK+GZMA+效應記憶T細胞也能分化為腫瘤浸潤CD8+T細胞,這兩簇細胞從癌旁組織遷移至腫瘤組織后經(jīng)常發(fā)生狀態(tài)轉(zhuǎn)換[18-20]?？傊?腫瘤浸潤免疫細胞的分化狀態(tài)及其功能隨腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移動態(tài)改變,scRNA-seq可以多時間、多部位采集腫瘤微環(huán)境的免疫特征。(2)免疫細胞分布異質(zhì)性:腫瘤浸潤免疫細胞在腫瘤中的作用尚不完全清楚,挑戰(zhàn)之一是不同腫瘤中免疫細胞的分布異質(zhì)性顯著。高分辨率的scRNA-seq可揭示不同組織中免疫細胞的分布特點。首先,腫瘤浸潤免疫細胞在不同個體樣本中分布不一致。腫瘤免疫微環(huán)境中幼稚狀態(tài)、細胞毒性狀態(tài)和功能障礙狀態(tài)的CD8+T細胞相對豐度波動很大。在黑色素瘤不同樣本的scRNA-seq研究中,耗竭T細胞可占到總T細胞浸潤比例的5%至80% ,但一些低比例耗竭T細胞的樣本中免疫抑制狀態(tài)更明顯[21]。其次,免疫細胞在不同腫瘤亞型中具有明顯異質(zhì)性。乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)陰性頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤浸潤性B細胞更少。在一項鼻咽癌的scRNA-seq研究中,HPV陰性腫瘤樣本中腫瘤中浸潤的B細胞豐度甚至超過了T細胞[22]。通過scRNA-seq技術,He等[23]發(fā)現(xiàn),血清AFP陽性(AFP≥20 ng/mL)比AFP陰性病人腫瘤微環(huán)境的免疫抑制程度更高,包括不同T細胞亞群的耗竭和SPP1+腫瘤相關巨噬細胞的積累,小鼠實驗進一步證實AFP和SPP1+腫瘤相關巨噬細胞通過SPP1-CD44 軸促進T細胞耗竭。再次,免疫細胞在腫瘤組織和癌旁組織及正常組織的分布也不同。參與免疫抑制微環(huán)境形成的腫瘤浸潤免疫細胞亞群,如耗竭T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、調(diào)節(jié)性B細胞、LAMP3+樹突狀細胞[11,24-27]等,在腫瘤組織中的浸潤比例明顯更高。最后,腫瘤浸潤免疫細胞亞群具有時間特異性,在不同臨床分期對腫瘤作用可能相反。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)血漿樣B細胞抑制早期非小細胞肺癌進展,但促進晚期腫瘤進展[26]。所以,scRNA-seq可推進腫瘤病人精準個體化治療的發(fā)展。

3.探究泛癌中腫瘤浸潤免疫細胞的共性和可塑性:泛癌研究是對多種腫瘤類型或亞型整合分析,旨在識別在異種腫瘤中共有或特異的特征,這些可能是由特定的分子機制驅(qū)動的。scRNA-seq是研究腫瘤浸潤免疫細胞泛癌特征的強有力工具。T細胞腫瘤免疫微環(huán)境中數(shù)量最多的細胞群體。Zheng等[28]整合分析21種腫瘤類型共三百多例腫瘤、癌旁組織、外周血液樣本中的T細胞發(fā)現(xiàn),腫瘤反應T細胞主要是高異質(zhì)性的耗竭T細胞、IFNG+卵泡輔助T細胞和TNFRSF9+調(diào)節(jié)性T細胞,其中TNFRSF9+調(diào)節(jié)性T細胞比例與免疫治療成功率正相關。盡管不同腫瘤中腫瘤浸潤T細胞異質(zhì)性明顯,但T細胞耗竭主要通過效應記憶T細胞和組織駐留記憶T細胞兩條途徑。研究人員根據(jù)預后情況把腫瘤樣本分為兩組:終末耗竭CD8+ T 細胞占比高組和組織駐留記憶CD8+ T 細胞占比高組,研究結(jié)果顯示后者總體上生存時間更長。自然殺傷(NK)細胞在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的先天免疫中的作用不可或缺。嵌合抗原受體-NK細胞治療淋巴瘤和白血病取得了顯著的臨床成功。因為實體瘤中腫瘤浸潤NK細胞了解并不全面,所以相應治療在實體瘤中療效有限。2023年8月,Tang等[29]收集整理分析了24種腫瘤病人和健康人NK細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù),首次在泛癌水平系統(tǒng)地鑒定到14類NK細胞亞群并詳細分析了每個亞群的功能特征。研究者把表達殺傷性下降、抑制受體上升、高表達應激反應相關蛋白等功能失調(diào)特征的表型命名為腫瘤相關NK細胞,該細胞群富集在腫瘤組織中和LAMP3+樹突狀細胞相互作用,與多種癌癥類型的不良預后及免疫治療的耐藥顯著相關。這些腫瘤浸潤免疫細胞的特征為臨床治療提供了重要參考[30]?？傊?泛癌scRNA-seq揭示了異種腫瘤免疫細胞的共性及可塑性,為未來腫瘤免疫微環(huán)境相關研究提供了基線參考和潛在方向。

三、結(jié)語和展望

腫瘤浸潤免疫細胞是影響腫瘤進展的主要因素之一。scRNA-seq不僅能確定免疫細胞亞群和功能特征,還能追蹤細胞分化軌跡和分布及異種腫瘤的免疫細胞共性。未來研究應集中于以下幾點:(1)進一步明確腫瘤浸潤免疫細胞分化軌跡和表型;(2)鑒定不同免疫細胞亞群在不同腫瘤中的作用;(3)繼續(xù)探索腫瘤浸潤免疫細胞和免疫治療的相關性。綜上所述,scRNA-seq是解析腫瘤浸潤免疫細胞的細胞和分子特征的強大工具,有望全面闡明腫瘤免疫微環(huán)境異質(zhì)性并促進病人精準個體化治療。

利益沖突 :所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明 :杜啟聯(lián):研究選題設計、收集資料、論文撰寫、論文修改,宋恩峰:研究選題設計、論文撰寫、論文修改;胡欽勇:研究選題設計、論文撰寫、論文修改、經(jīng)費支持