楊安沛 張航 白微微 丁瑞豐 李廣闊

摘要

為探究植物揮發(fā)物中引起旋幽夜蛾嗅覺電生理反應的活性組分，本研究采用動態(tài)頂空吸附法收集藜、甜菜和棉花植株的揮發(fā)物，利用氣相色譜觸角電位聯(lián)用儀（GCEAD）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）定性鑒定寄主揮發(fā)物中引起旋幽夜蛾嗅覺反應的活性組分。結(jié)果表明，藜揮發(fā)物中有6種活性組分，甜菜和棉花揮發(fā)物中各有5種，其中乙酸葉醇酯、1，2二乙苯、對二乙苯、壬醛、二乙二醇丁醚為3種植物共有的揮發(fā)物組分，異佛爾酮僅在藜揮發(fā)物中發(fā)現(xiàn)。觸角電位（EAG）測定結(jié)果顯示，以上6種組分都能引起旋幽夜蛾雌雄成蟲的EAG反應，且隨濃度增加EAG相對反應值增大。雌雄成蟲對壬醛和異佛爾酮的EAG反應最強烈，其次是乙酸葉醇酯和1，2二乙苯。在相同濃度條件下，雌雄成蟲對同種化合物的EAG反應無性別特異性。本研究為探明旋幽夜蛾定位寄主機制及開發(fā)行為調(diào)控產(chǎn)品提供基礎。

關鍵詞

旋幽夜蛾;?植物揮發(fā)物;?觸角電位;?GCEAD

中圖分類號：

S?433.4

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023181

Analysis?of?active?components?in?three?host?volatiles?eliciting?olfactory?responses?in?Scotogramma?trifolii

YANG?Anpei，?ZHANG?Hang，?BAI?Weiwei，?DING?Ruifeng，?LI?Guangkuo*

（Institute?of?Plant?Protection，?Xinjiang?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Integrated?Management

on?Crops?in?Northwestern?Oasis，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Urumqi?830091，?China）

Abstract

To?investigate?the?active?components?of?plant?volatiles?eliciting?olfactory?electrophysiological?responses?in?Scotogramma?trifolii，?volatile?compounds?from?Chenopodium?album，?Beta?vulgaris，?and?Gossypium?hirsutum.?were?collected?using?the?dynamic?headspace?adsorption?method.?The?active?components?in?the?host?volatiles?were?qualitatively?identified?using?gas?chromatography?electroantennography?（GCEAD）?and?gas?chromatographymass?spectrometry?（GCMS）.?The?results?revealed?that?there?are?six?active?components?in?the?volatile?emissions?of?C.album，?and?five?active?components?each?in?sugar?beet?and?cotton?volatiles.?Among?these，?five?components?were?common?across?all?three?plant?volatiles，?namely?trans3hexenyl?acetate，?1，2diethylbenzene，?1，4diethylbenzene，?nonanal，?and?diethylene?glycol?monobutyl?ether.?Additionally，?isophorone?was?exclusively?found?in?the?volatiles?of?C.album.?The?antennal?electrophysiological?responses?（EAG）?of?S.trifolii?reveal?that?the?six?active?components?can?all?cause?EAG?responses?in?both?male?and?female?adults，?and?increasing?with?increasing?concentration，and?the?strongest?EAG?responses?were?observed?to?nonanal?and?isophorone，?followed?by?trans3hexenyl?acetate?and?1，2diethylbenzene.?Furthermore，?under?the?same?concentration?conditions，?the?EAG?response?of?male?and?female?adults?to?the?same?compound?displayed?no?gender?specificity.?This?study?provides?a?basis?for?exploring?the?host?localization?mechanism?of?S.trifolii?and?for?developing?behavioral?regulators.

Key?words

Scotogramma?trifolii;?plant?volatiles;?EAG;?GCEAD

旋幽夜蛾Scotogramma?trifolii又名旋歧夜蛾、三葉草夜蛾，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，在世界范圍內(nèi)廣泛分布［1］，在我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、吉林、河北等北方地區(qū)均有發(fā)生，對甜菜、棉花、蓖麻、向日葵、玉米均造成嚴重危害［210］。旋幽夜蛾以幼蟲取食寄主葉片，大齡幼蟲常造成大型孔洞或食盡整張葉片的葉肉，僅剩葉柄和葉脈［11］，幼蟲具有多食性、暴發(fā)性和遷移為害的特點。旋幽夜蛾寄主廣泛，可為害8科20多種作物、27種雜草［5］，藜Chenopodium?album、甜菜Beta?vulgaris、白菜?Brassica?chinensis為旋幽夜蛾的適宜寄主［12］。

在復雜的生態(tài)環(huán)境下，昆蟲與植物長期協(xié)同進化，形成了信息化合物與昆蟲行為彼此相互聯(lián)系、相互作用的關系，如覓食、求偶、遷徙、聚集、產(chǎn)卵等各種行為活動［1315］。針對旋幽夜蛾的寄主選擇性，前期研究發(fā)現(xiàn)，旋幽夜蛾成蟲偏好在藜上產(chǎn)卵，其次是棉花和甜菜［1112］。但目前關于寄主植物揮發(fā)物中的哪些組分參與旋幽夜蛾的寄主選擇行為尚不清楚，缺乏對寄主植物活性組分種類的系統(tǒng)研究。

植食性昆蟲主要通過嗅覺來識別和選擇寄主植物，寄主植物揮發(fā)物在昆蟲行為過程中發(fā)揮著重要作用［1617］，介導昆蟲的吸引和趨避行為［1820］。然而植物揮發(fā)物的種類已超過了3萬種［21］，從植物揮發(fā)物中篩選引起昆蟲嗅覺反應的活性物質(zhì)是非常重要的，可為開發(fā)昆蟲引誘劑和驅(qū)避劑奠定基礎［2224］。目前，基于植物揮發(fā)物活性物質(zhì)的食誘劑已被成功研發(fā)，對甜菜夜蛾Spodoptera?exigua、斜紋夜蛾S.litura、黃地老虎Agrotis?segetum、小地老虎A.ipsilon、棉鈴蟲Helicoverpa?armigera等重要害蟲具有明顯的誘捕效果［2527］。昆蟲在氣味識別過程中會產(chǎn)生一系列電化學信號，因此，本研究利用氣相色譜觸角電位聯(lián)用技術（gas?chromatography?electroantennographic?detection，GCEAD）測試旋幽夜蛾對3種寄主植物揮發(fā)物的觸角電位反應，結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術（gas?chromatographymass?spectrometry，GCMS）分析鑒定具有嗅覺電生理反應的活性組分，同時測試旋幽夜蛾雌雄成蟲對相應組分標準品的觸角電生理反應（electrophysiological，EAG），以期篩選出對旋幽夜蛾行為有調(diào)控作用的潛在信息化合物。

1?材料與方法

1.1?供試昆蟲與寄主植物

旋幽夜蛾于2019年4月利用頻振式誘蟲燈（鶴壁佳多科工貿(mào)股份有限公司）采自新疆昌吉市農(nóng)業(yè)技術推廣中心試驗基地。待成蟲產(chǎn)卵孵化后，在溫度（26±2）℃，相對濕度（60±5）%，光周期L∥D=14?h∥10?h的光照培養(yǎng)箱中用人工飼料（玉米粉35?g，大豆粉30?g，酵母粉6?g，尼泊金酯1?g，復合維生素B?0.4?g，抗壞血酸1.25?g，山梨酸0.4?g，番茄醬80?g，氯化膽堿0.22?g，膽固醇0.18?g，H2O?450?mL）飼養(yǎng)，幼蟲生長到6齡時，單頭放入十二孔板中飼養(yǎng)至化蛹，羽化后選擇活躍且觸角完整的雌雄成蟲（2～3日齡，未交配）作為供試用蟲。

試驗所用寄主植物包括：甜菜?‘KWS9147、棉花‘中棉88號、藜（田間自然生長）。待田間甜菜植株4～8葉，盆栽棉花8～10葉，藜株高80～100?cm時進行揮發(fā)物采集（藜采用上部幼嫩枝葉）。

1.2?寄主植物揮發(fā)物收集

采用動態(tài)頂空吸附法收集寄主植物揮發(fā)物。用聚乙烯保鮮袋（40?cm×60?cm）套在植株的上部葉片部位收集揮發(fā)物，保鮮袋的上部剪去一角，插入一根出氣硅膠管，用封口膜膠帶纏繞封閉，下開口處插入一根進氣管，用封口膜纏繞固定于植株上，進、出氣硅膠管分別連接到大氣采樣儀（QC1B，北京勞動保護研究所）上的出口和進口，進氣硅膠管的空氣通過活性炭過濾后進入保鮮袋中，帶有植物揮發(fā)性氣體的空氣流經(jīng)吸附柱中的40?mg吸附劑（PoraPakTMQ80100）后回流入大氣采樣儀。氣體流速為1?L/min，連續(xù)收集4?h（20：00-24：00）。收集完畢后，將吸附柱取下，分2次分別用200?μL?CH2Cl2淋洗吸附柱，用洗耳球?qū)⒘芟匆簭奈街等?.5?mL玻璃瓶中，用封口膜密封置于-20℃冰箱中保存，用于氣相色譜觸角電位聯(lián)用技術（GCEAD）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術（GCMS）分析。

1.3?引起旋幽夜蛾觸角電生理反應的活性組分篩選與活性物質(zhì)鑒定

通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術，使用單四極桿氣相氣質(zhì)聯(lián)用儀（GCMSQP2020，島津公司，日本）對寄主植物揮發(fā)物成分進行分析。氣相色譜儀工作條件設定為：進樣口溫度250℃;起始溫度4℃保持2?min，之后以4℃/min升溫至120℃，保持2?min，再以20℃/min升溫至250℃，保持7?min;GC檢測器溫度設為300℃，載氣為N2（99.999%），流速15?mL/min。MS電離方式為EI，離子源溫度為250℃，電離能量為70?eV。用微量進樣器吸取1?μL揮發(fā)物樣品注入氣相色譜儀，采用GCMS?solution?v4.5軟件進行數(shù)據(jù)采集與再解析。

利用氣相色譜觸角電位聯(lián)用技術（GCEAD）測定旋幽夜蛾對寄主植物揮發(fā)物的嗅覺反應。首先將觸角從基部剪斷，同時用手術刀切去端部1?mm，將參考電極（毛細管中浸有1%生理鹽水）對準觸角基部放入，然后將參考電極置于操作臺上，觸角端部對準記錄電極插入，連接好觸角的微操作臺整體移動到氣相色譜的L形玻璃管出樣口處，保持觸角在出氣口位置，保持電極聯(lián)通。待1～3?min觸角電位信號穩(wěn)定后，用10?μL手動進樣針將田間收集的3?μL寄主植物揮發(fā)物樣品在不分流模式下注入氣相色譜儀（Agilent?7820A），GC程序同GCMS。經(jīng)毛細管柱分離的樣品由“Y”形分流閥按1∶1的比例分流，一部分進入FID檢測器，另一部分樣品通過熱傳導器內(nèi)部的色譜柱由純凈空氣（400?mL/min）帶到靠近觸角的玻璃管口，熱傳導器溫度設為300℃。觸角電位儀（IDAC2，Syntech）將采集得到的電信號經(jīng)過放大器放大，經(jīng)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換后用GcEad?v1.2.5軟件采集數(shù)據(jù)。雌雄成蟲均重復4次。最后通過比對GCEAD和GCMS圖像數(shù)據(jù)，利用譜庫NIST?14.0對引起旋幽夜蛾觸角電生理反應的揮發(fā)物組分進行定性鑒定。

1.4?旋幽夜蛾對活性組分標準品的EAG反應

選取健康成蟲的完整觸角進行測試，觸角處理同1.3，用導電膠連接觸角于觸角電位儀上。測試氣體流量設定為0.4?L/min，待基線平穩(wěn)后開始測定。1.3中鑒定出的活性組分的標準品用于EAG反應試驗。

用液體石蠟油將標準品配制成濃度為0.1、1、10、100?μg/μL的溶液，取10?μL溶液滴于5?cm×1?cm濾紙上，揮發(fā)30?s后置于巴斯德管中。測試時，將巴斯德管接入氣流控制器，出口正對觸角，距離10?mm左右，由氣流控制器（DGST1）提供氣流，流量均設定為400?mL/min，待基線穩(wěn)定后給予刺激，刺激時間設為0.5?s，刺激間隔至少30?s，以保證觸角感器的感覺功能完全恢復。首先測試對照（液體石蠟油），然后按濃度從低到高測試標準品（表1），最后再測試對照（液體石蠟油），重復測試3次。每個標樣測試10根觸角。利用Syntech公司提供的EAG?Pro?2.0軟件進行數(shù)據(jù)記錄與分析，觸角電位相對反應值計算公式如下：

觸角電位相對反應值=標準品觸角電位反應值-（測試前對照觸角電位反應值+測試后對照觸角電位反應值）/2。

1.5?數(shù)據(jù)處理

不同濃度下不同活性組分的EAG相對反應值間的差異顯著性采用單因素方差分析（Oneway?ANOVA），Duncan氏新復極差法檢驗差異顯著性。數(shù)據(jù)統(tǒng)計計算采用SPSS?25.0軟件進行。

2?結(jié)果與分析

2.1?3種寄主植物揮發(fā)物中引起旋幽夜蛾嗅覺電生理反應的組分鑒定

藜揮發(fā)物中能引起旋幽夜蛾雌成蟲GCEAD反應的活性組分有6種，即乙酸葉醇酯、1，2二乙苯、對二乙苯、壬醛、異佛爾酮和二乙二醇丁醚，棉花和甜菜揮發(fā)物中能引起旋幽夜蛾雌成蟲GCEAD反應的活性組分均為5種，即乙酸葉醇酯、1，2二乙苯、對二乙苯、壬醛、二乙二醇丁醚（圖1～3，表2）。

2.2?旋幽夜蛾對活性組分標準品的EAG反應

當供試化合物標準品濃度為0.1、1、10?μg/μL時，雌成蟲對異佛爾酮的EAG相對反應值最大，分別為0.40、0.96、1.87?mV，在相同濃度下顯著高于其他化合物（F5，54=11.888，P<0.001;F5，54=36.424，P<0.001;F5，54=27.776，P<0.001）;當濃度為100?μg/μL時，雌成蟲對壬醛和異佛爾酮的EAG反應最強烈，分別為2.48、2.28?mV，顯著強于其他化合物?（F4，45=11.588，?P<0.001;?F4，45=9.449，P<0.001）（圖4）。?在供試化合物標準品濃度為1、10?μg/μL時，雄成蟲對異佛爾酮的EAG相對反應值最大，分別為0.94、1.95?mV，在相同濃度下顯著高于其他化合物（F5，54=12.107，?P<0.001;?F5，54=10.442，P<0.001）;當濃度為0.1、100?μg/μL時，雄成蟲對壬醛和異佛爾酮的EAG反應最大，其次是乙酸葉醇酯和1，2二乙苯（圖5）。

在0.1～100?μg/μL?濃度梯度內(nèi)，旋幽夜蛾對6種化合物的EAG相對反應值隨濃度的增加而增大，且均在濃度100?μg/μL時EAG相對反應值最高（圖4，5）。在相同濃度條件下，雌雄成蟲對同種化合物的EAG反應值無明顯差異，無性別特異性。

3?結(jié)論與討論

本研究通過GCEAD和GCMS技術從藜、甜菜、棉花植株揮發(fā)物中鑒定出能引起旋幽夜蛾嗅覺反應的6種活性物質(zhì)，其中乙酸葉醇酯、1，2二乙苯、對二乙苯、壬醛、二乙二醇丁醚等5種為甜菜、棉花和藜中共有組分，異佛爾酮僅在藜中發(fā)現(xiàn)。本試驗中鑒定的引起旋幽夜蛾嗅覺反應的組分在其他鱗翅目昆蟲中也有類似的報道，如壬醛能引起馬鈴薯塊莖蛾Phthorimaea?operculella［28］、草地貪夜蛾Spodoptera?frugiperda［29］、亞洲玉米螟Ostrinia?furnacalis［30］、黃地老虎［31］、朱紅毛斑蛾Phauda?flammans［32］明顯的觸角電生理反應。1，2二乙苯、對二乙苯能觸發(fā)黃地老虎［31］、朱紅毛斑蛾［32］的EAG反應，乙酸葉醇酯能引起黃地老虎［31］的嗅覺反應。

本研究通過EAG測試了旋幽夜蛾雌雄成蟲對不同濃度6種活性組分的觸角電生理反應，6種組分均能引起旋幽夜蛾雌雄成蟲EAG反應。在同一化合物同一濃度條件下，旋幽夜蛾雌雄成蟲的EAG相對反應值無明顯差異，在其他昆蟲中也有相似報道，入侵害蟲芒果壯鋏普癭蚊Procontarinia?robusta雌雄蟲對α蒎烯等3種揮發(fā)物成分的EAG反應值無顯著性差異［33］。棉鈴蟲和煙青蟲Helicoverpa?assulta對19種揮發(fā)物的EAG反應均無顯著的性別差異［34］。但也有研究報道昆蟲對同一物質(zhì)的EAG反應存在性別差異，如雙斑長跗螢葉甲Monolepta?hieroglyphica雌雄成蟲對同一濃度的同一揮發(fā)物的EAG反應存在差異［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，旋幽夜蛾對相同濃度的不同化合物的EAG反應存在差異，濃度為100?μg/μL時，雌成蟲對壬醛和異佛爾酮的EAG反應最強烈;濃度為0.1、100?μg/μL時，雄成蟲對壬醛和異佛爾酮的EAG反應最大。在其他昆蟲中也有類似報道，如當5種化合物濃度均為0.01?μg/μL時

芒果壯鋏普癭蚊雌雄成蟲對α蒎烯的反應均顯著高于其他4種揮發(fā)物［33］，當14種化合物濃度為50?μg/μL或100?μg/μL時草地貪夜蛾雌蟲對癸醛、壬醛、反2己烯醛、反2己烯醇反應最強烈，高于其他10種揮發(fā)物的響應峰值［29］。EAG結(jié)果表明，旋幽夜蛾對活性物質(zhì)的EAG反應存在濃度依賴性，隨著濃度的升高而升高，與其他昆蟲的研究結(jié)果一致。如美國白蛾Hyphantria?cunea對鄰苯二甲酸二丁酯的EAG相對反應值

隨著濃度的增加而增加［36］，黃地老虎雌成蟲對11種植物揮發(fā)物的EAG反應均隨濃度的升高而升高［31］，煙青蟲和棉鈴蟲對6種植物揮發(fā)物的EAG反應隨著刺激物質(zhì)濃度的增大而增強［34］，草地貪夜蛾對14種揮發(fā)物的EAG反應隨濃度（0.1～100?μg/μL）增大而增強，但對某些活性組分的EAG反應存在飽和值［29］。本研究初步確定了引起旋幽夜蛾嗅覺反應的活性化合物，還需進一步明確旋幽夜蛾對活性化合物的嗅覺行為反應，為探明寄主植物揮發(fā)物對旋幽夜蛾的行為反應作用提供理論基礎。

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