賈毅博，王高玉，鄧宛心，林彩云，楊 華，陳運(yùn)春，尹飛飛

（1.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與全健康國(guó)際學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院-香港大學(xué)熱帶傳染病聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?71199；3.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心，海南 ?？?570206；4.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南 ?？?570206）

TTV 病毒（Torque Teno virus， TTV）屬于指環(huán) 病 毒 科（Anelloviridae）， α 指 環(huán) 病 毒 屬（Alphatorquetenovirus），是一種無(wú)囊膜，單鏈環(huán)狀的DNA病毒。該病毒基因組約為3.8 kb，包括四個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）以及高變區(qū)（hypervariable region，HVR）和N 末 端 精 氨 酸 片 段［1，2］。TTV 病毒最早于1997 年在日本一名病因不明的急性輸血后肝炎患者體內(nèi)被首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［3］。TTV 是血液病毒組中最常見的病毒種類，其致病性目前仍然不明確。部分研究表明TTV 和肝炎、呼吸道疾病、腫瘤以及自身免疫性疾病等相關(guān)，但是近年來(lái)的研究認(rèn)為其很少會(huì)直接導(dǎo)致人和動(dòng)物感染性疾病的發(fā)生［4，5］。TTV 的致病性及復(fù)制機(jī)理等研究面臨最主要的問(wèn)題是尚未有靈敏的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物感染模型。該病毒宿主范圍十分廣泛，除了人類，目前已經(jīng)在多種動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，包括豬、駱駝、馬、貓、狗、獾、海獅和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物等［3］。流行病學(xué)研究結(jié)果表明，TTV 在全球范圍的人群中廣泛存在，在俄羅斯、日本和巴基斯坦等健康人群中流行率高達(dá)90%以上［6-8］。

近年來(lái)TTV 作為評(píng)估人體免疫功能的重要指標(biāo)受到廣泛關(guān)注，尤其在器官移植患者中已進(jìn)入臨床應(yīng)用［9-11］。盡管TTV 病毒具有廣泛的臨床重要性，但目前還沒(méi)有廣譜、便捷、高效和靈敏度高的TTV 檢測(cè)方法。當(dāng)前針對(duì)TTV 的檢測(cè)方法主要是基于分子生物學(xué)的診斷方法，主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）等技術(shù)。由于TTV 基因組的高度多樣性和變異性，不同基因型之間的變異程度最高可達(dá)到50%以上，常見的PCR 檢測(cè)方法只能針對(duì)部分TTV 亞型進(jìn)行檢測(cè)，且檢測(cè)方法靈敏度 不 夠，容 易 出 現(xiàn) 漏 檢 等 問(wèn) 題［12，13］。在2001 年，Pistello 等［14］針對(duì)特定地區(qū)流行的TTV 亞型，基于TTV 基因組的ORF1 區(qū)域，開發(fā)了一種新的realtime PCR 檢測(cè)方法。這種方法雖然能夠特異性地識(shí)別某些亞型，但由于選擇的擴(kuò)增區(qū)域的局限性，對(duì)其他TTV 亞型的檢測(cè)能力有所不足。與此同時(shí)，Maggi 等［15］研 究 者 根 據(jù)TTV 基 因 組 的UTR（untranslated regions，UTR）區(qū)域，設(shè)計(jì)了新的引物和探針，進(jìn)而建立了另一種real-time PCR 檢測(cè)方法，盡管這一方法在檢測(cè)范圍上取得了一定提升，但其檢測(cè)靈敏度仍然較低，僅為1×103copies/μL。在2017 年，法國(guó)的研究人員推出建立了一種用于檢測(cè)TTV 的標(biāo)準(zhǔn)化real-time PCR 方法，且在健康志愿者、捐贈(zèng)者和腎移植接受者中進(jìn)行了測(cè)試，但是其只可以對(duì)12 種TTV 亞型進(jìn)行檢測(cè)［16］。而酶免疫測(cè)定（enzyme immunoassay，EIA）和酶聯(lián)免疫吸附實(shí) 驗(yàn)（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA），盡管可以用于檢測(cè)TTV 抗體，但由于IgM 和IgG 抗體之間時(shí)間重疊較大，很難區(qū)分當(dāng)前感染和既往感染［13］。這些問(wèn)題限制了對(duì)TTV 感染的深入研究和其作為疾病標(biāo)志物的應(yīng)用潛力。鑒于現(xiàn)有的TTV 檢測(cè)方法存在的諸多局限性，本研究建立了一種具有更高的靈敏性和特異性的real-time PCR 方法，為揭示TTV 在多種疾病過(guò)程中的作用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及引物設(shè)計(jì)合成

從海南省婦女兒童中心收集30 份臨床血液樣本，經(jīng) 過(guò)3 500 r/min，3 min 離 心 后，分 裝 保 存 于- 80 ℃冰 箱 備 用。 血 清 樣 本 病 毒DNA 使 用QIAamp DNA Mini Kit（德國(guó)，QIAGEN 公司）進(jìn)行提?。籔CR 擴(kuò)增使用KOD One? PCR Master Mix，（日本，TOYOBO 公司產(chǎn)品）；Real-Time PCR 反應(yīng)使用Premix Ex Taq?（Probe qPCR），（寶生物工程（大連）有限公司）；柱離心型DNA 凝膠回收與純化試劑盒和高純質(zhì)粒小量提取試劑盒，均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

使用BioEdit 軟件對(duì)ICTV 所公布的22 種不同亞型的TTV 序列進(jìn)行比對(duì)（參考序列基因號(hào)：AB008394、AB049608、AY666122、AB041957、AF345523、 AF435014、 AF261761、 DQ187006、AB064607、 AF345526、 AB037926、 AB028668、AX025830、AX025718、AB025946、AB060594、AF348409、 AB060597、 AB041959、 AB041958、AB038621、KJ082064），在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一套可針對(duì)已知所有TTV 亞型的檢測(cè)引物以及探針。選擇文獻(xiàn)報(bào)道目前應(yīng)用較為廣泛的5 套引物（表1）用于本研究質(zhì)粒的擴(kuò)增以及對(duì)real-Time PCR 方法檢測(cè)能力的對(duì)比研究。以上所有引物及探針均委托由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品制備及檢測(cè)相關(guān)引物和探針序列Tab 1 Sequences of primers and probes used in the preparation of standard samples and detection

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以臨床血液樣本提取的TTV 病毒DNA 為模板，分別利用兩對(duì)引物NG133/NG136、NG134/NG135 進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)體 系為：KOD One?PCR Master Mix，12.5 μL，上、下游引物，引物濃度為10 μmol/L，各1 μL；DNA 模板，1 μL；滅菌雙蒸水，9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃，2 min；98 ℃，10 s；60 ℃，10 s；68 ℃，30 s；35 個(gè)循環(huán)；68 ℃，5 min；4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物為3 354 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切取目的片段并使用試劑盒回收純化。隨后與pLB vector 連接后轉(zhuǎn)化到DH5-α 感受態(tài)細(xì)胞中。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)板上37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取單個(gè)菌落，增菌后用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定，測(cè)序驗(yàn)證。

以提取的含有TTV 片段的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，用NAS-99 微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，根據(jù)阿弗加德羅數(shù)將濃度換算為拷貝數(shù)，然后用滅菌雙蒸水依次進(jìn)行梯度稀釋至1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL，分 裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 real-time PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了得到更高的熒光增幅并使反應(yīng)有最小的循環(huán)數(shù)（Cycle threshold，CT），對(duì)real-time PCR 的退火溫度進(jìn)行梯度優(yōu)化，即從56 ℃開始，每次提高2 ℃的退火溫度，直至60 ℃截止；同時(shí)為提高realtime PCR 反應(yīng)中TTV 的擴(kuò)增效率，我們對(duì)反應(yīng)體系中的引物和探針終濃度由0.1 μmol/L 開始，每次增加一倍，直至終濃度為0.4 μmol/L 截止。

1.4 real-time PCR 敏感性、穩(wěn)定性試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將倍比稀釋濃度在1.0×101～1.0×107copies/μL 之間的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，按優(yōu)化后的反應(yīng)體系以及條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，最終反應(yīng)體系為25 μL，主要為Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）12.5 μL，上游引物TTV-F、下游引物TTV-R 以及特異性探針TTV-P 各0.5 μL，各濃度梯度模板2 μL、滅菌雙蒸水9 μL；并設(shè)置以滅菌雙蒸水為模板的陰性對(duì)照，觀察該方法的敏感性；擴(kuò)增條件均為優(yōu)化后最佳反應(yīng)，即95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；40 個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)曲線由BioRad CFX96 rM Real-Time PCR Detection System 擴(kuò)增儀自動(dòng)生成，X 軸代表每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品模板中所含病毒起始含量以10 為底的對(duì)數(shù)，Y軸代表各個(gè)梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增時(shí)達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)，反復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次評(píng)估試驗(yàn)穩(wěn)定性以及引物最低反應(yīng)拷貝數(shù)。

1.5 與目前文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用較為廣泛的PCR 檢測(cè)方法的對(duì)比

使用文獻(xiàn)報(bào)道的4 套PCR 擴(kuò)增引物組合（見表1）和本研究設(shè)計(jì)的real-time PCR 方法，分別對(duì)收集的30 份臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。本研究所使用的引物相對(duì)位置（圖1），各引物組合PCR 反應(yīng)條件以及擴(kuò)增長(zhǎng)度（表2）。

表2 各引物組合PCR 反應(yīng)條件、擴(kuò)增長(zhǎng)度Tab 2 PCR conditions and amplification length of each primer combination

圖1 TTV 基因組結(jié)構(gòu)以及本研究所使用的引物相對(duì)位置示意圖Fig 1 The genome structure of TTV and the primers' relative positions used in this study

2 結(jié)果

2.1 TTV 病毒Real-time PCR 檢測(cè)方法的建立

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備：以TTV 陽(yáng)性血清樣本提取的病毒DNA 為模板，經(jīng)巢氏PCR 擴(kuò)增，得到大小為3 354 bp 的目的片段（見圖2）。將此特異性片段與pLB 載體連接，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，結(jié)果顯示與TTV 病毒DNA 依賴性RNA 聚合 酶 序 列（GenBank accession no.AB026345）的 一致性為98.25%，表明該質(zhì)粒中插入基因?yàn)門TV 病毒基因，因此用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。

圖2 TTV 陽(yáng)性血清樣本擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig 2 Electrophoresis image of amplification results from positive serum samples of TTV

2.2 Real-Time PCR 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

為了得到更高的熒光增幅并使反應(yīng)有最小的循環(huán)數(shù)（CT），對(duì)real-time PCR 的各項(xiàng)條件進(jìn)行了摸索，其中，對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)則主要為反應(yīng)體系中引物、探針使用的終濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選，取制備的終濃度為107copies/μL～101copies/μL 的系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別作為DNA 模板，實(shí)驗(yàn)中的引物和探針的配制濃度均為10 μmol/L，添加量分別使用1 μL、0.5 μL 和0.25 μL，放入Real-Time PCR 儀中使用相同的PCR 擴(kuò)增程序（比如95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃，5 s；58 ℃ ，30 s；40 個(gè)循環(huán)），進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增，得到各自不同的擴(kuò)增效率（E）、相關(guān)系數(shù)（R2）以及斜率，具體結(jié)果如（表3）所述，綜合比較可見引物和探針終濃度不同，擴(kuò)增效率差異顯著，以添加量后的終濃度為0.2 μmol/L 最優(yōu)。最終優(yōu)化的25 μL 的PCR 反應(yīng)體系：PCR 管中依次加入2×PCR 預(yù)混液12.5 μL，10 μmol/L 引物和探針各0.50 μL，DNA 模板2 μL，去離子水9 μL，充分混勻。

表3 Real-Time PCR 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化Tab 3 Real-time PCR system and optimization of conditions

為進(jìn)一步提高real-time PCR 的擴(kuò)增效率，我們對(duì)PCR 擴(kuò)增程序的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)包括對(duì)各個(gè)反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化篩選，如變性溫度、變性時(shí)間、退火溫度、退火時(shí)間、延伸溫度、延伸時(shí)間和循環(huán)數(shù)。經(jīng)驗(yàn)證：本研究設(shè)計(jì)的real-time PCR 擴(kuò)增程序可以優(yōu)選二溫度點(diǎn)法，即除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，該擴(kuò)增效率與常規(guī)的三溫度點(diǎn)法（變性溫度、退火溫度、延伸溫度）相差不大。其中，主要對(duì)退火/延伸的溫度進(jìn)行摸索，分別選擇56 ℃、58 ℃和60 ℃這3 個(gè)溫度進(jìn)行退火/延伸溫度的最后優(yōu)化驗(yàn)證，根據(jù)上述已經(jīng)優(yōu)選的PCR 擴(kuò)增程序，取制備的終 濃 度 為107copies/μL～101copies/μL 的 系 列 標(biāo) 準(zhǔn)品，分別作為DNA 模板、添加量為2 μL，引物和探針（濃度均為10 μmol/L）的添加量為優(yōu)選結(jié)果0.5 μL，反應(yīng)體系其他組份參考上述對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化篩選結(jié)果，放入real-Time PCR 儀中，PCR 擴(kuò)增程序的參數(shù)條件除退火/延伸溫度參數(shù)以外，其他參數(shù)固定，進(jìn)行real-Time PCR 擴(kuò)增，得到擴(kuò)增效率（E）、相關(guān)系數(shù)（R2）以及斜率，具體結(jié)果如下（表3）所述，綜合比較可見退火/延伸溫度不同，擴(kuò)增效率差異顯著，以60 ℃的反應(yīng)結(jié)果最優(yōu)。最終確定優(yōu)化后的PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。

2.3 Real-Time PCR 的靈敏度檢測(cè)

根據(jù)上述建立并優(yōu)化驗(yàn)證的TTV real-time PCR 檢 測(cè) 方 法，對(duì) 終 濃 度 為107copies/μL～101copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的PCR 擴(kuò)增的相對(duì)熒光單位為縱坐標(biāo)，以PCR 擴(kuò)增程序中的循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，得到擴(kuò)增曲線；再以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)終濃度的常用對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，以循環(huán)次數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得TTV 多亞型PCR 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下（圖3）所示。在多次實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度為101copies/μL 時(shí)均可見PCR 擴(kuò)增、且擴(kuò)增效率E 均大于90%，同時(shí)，我們對(duì)該定量產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示初始標(biāo)準(zhǔn)品濃度在107copies/μL～101copies/μL 時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物均可見到明顯的條帶（圖4），但100copies/μL 無(wú)法成功檢測(cè)，因此確定本研究建立的TTV 多亞型檢測(cè)方法最低檢測(cè)限101copies/μL。

圖3 TTV 多基因亞型real-time PCR 檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 Standard curve of a real-time method for detecting the polygenic subtypes of TTV

圖4 對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig 4 Gel electrophoresis image of amplification products from standards at different concentrations

2.4 Real-Time PCR 的穩(wěn)定性檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)中開發(fā)的Real-Time PCR 方法對(duì)105copies/μL 的 標(biāo) 準(zhǔn) 品 進(jìn) 行 了6 次 重 復(fù) 的 批 內(nèi) 穩(wěn) 定性測(cè)試（圖5），重復(fù)實(shí)驗(yàn)的CT 值分別為26.10、26.22、26.27、26.34、26.34 以 及26.67。平 均CT 為26.32，標(biāo)準(zhǔn)差為0.19，變異系數(shù)為7.22%。結(jié)果顯示出良好的重復(fù)性。

圖5 TTV 多基因亞型real-time PCR 檢測(cè)方法組間差異實(shí)驗(yàn)分析Fig 5 Experimental analysis of within-group variations in the real-time PCR method for multiple genotypic subtypes of TTV

2.5 與目前文獻(xiàn)報(bào)道的PCR 檢測(cè)方法對(duì)比結(jié)果及特異性驗(yàn)證

本文選擇Okamoto 等［17］報(bào)道的且目前被多個(gè)研究所使用的4 套引物與本研究建立的方法，同時(shí)對(duì)30 份臨床血液樣本以及稀釋為103～101copies/μL 的TTV 質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，將每個(gè)濃度的質(zhì)粒，在同一批次內(nèi)進(jìn)行了4 次擴(kuò)增。隨后對(duì)所有擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 比對(duì)。檢測(cè)結(jié)果如下（表4）所示，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)具有顯著差異（χ2=51.05，P＜0.01）。無(wú)論是對(duì)臨床樣本還是不同病毒載量的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，本研究所建立的方法靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)中報(bào)道的其他方法；同時(shí)測(cè)序結(jié)果分析表明，本方法所擴(kuò)增出的30 份陽(yáng)性樣本產(chǎn)物均為TTV，特異性為100%。

表4 用不同區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對(duì)臨床樣本及不同病毒載量的TTV 質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果Tab 4 Detection results of clinical samples and TTV plasmids with different doses of virus using primers designed in different regions

3 討論

自1997 年TTV 被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，由于其人群感染率高和顯著的遺傳多態(tài)性的特點(diǎn)，受到了研究者的廣泛關(guān)注［1，18］。然而由于缺乏靈敏的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物感染模型，目前對(duì)TTV 致病性及其與特定疾病間的相互關(guān)系尚未明確。研究表明，在免疫抑制狀態(tài)下，TTV 的復(fù)制活動(dòng)明顯增強(qiáng)。在健康人 體 內(nèi)，每 天 可 以 產(chǎn) 生 超 過(guò)3.8×101 copies/mL 的病毒粒子，其中超過(guò)90%的病毒粒子被免疫系統(tǒng)清除。與健康個(gè)體相比，免疫功能較弱的患者體內(nèi)的TTV DNA 載量更高［16］。因此，TTV 血液中的水平可能反映了患者的免疫狀態(tài)，高TTV DNA 載量表明過(guò)度免疫抑制和感染風(fēng)險(xiǎn)，而低載量則可能指示免疫抑制不足和排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［10］。近年來(lái)，研究人員已經(jīng)開始探索TTV 在人類血漿中的病毒載量，試圖將其與免疫狀態(tài)、感染或器官移植后的排斥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。TTV 正日益被認(rèn)為是評(píng)估整體免疫能力、預(yù)測(cè)移植后免疫相關(guān)不良事件、并最終制定免疫抑制治療的一個(gè)重要生物標(biāo)志物［9，19-21］。最近的研究已經(jīng)明確了使用TTV 監(jiān)測(cè)多種免疫抑制疾病患者的可行性，包括HIV 患者、實(shí)體器官移植患者、造血干細(xì)胞移植后的患者以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療患者［22-24］。此外，TTV 還可以預(yù)測(cè)嚴(yán)重COVID-19 患者的院內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，以及指示慢性阻塞性肺病患者的肺功能及疾病的嚴(yán)重程度，顯示了其在臨床應(yīng)用中的重要價(jià)值［25，26］。

2020 年國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）更新的數(shù)據(jù)將TTV 分為22 個(gè)基因型，不同的TTV 分離株之間的核苷酸差異超過(guò)30%［27］。此外，TTV 被分為5 個(gè)亞群，各亞群之間的差異超過(guò)50%。在基于靶向擴(kuò)增的real-time PCR 檢測(cè)方法建立過(guò)程中，病毒DNA 片段的選擇對(duì)PCR 檢測(cè)靈敏度有顯著影響［28-30］。自TTV 發(fā)現(xiàn)以來(lái)，ORF1 的N22 區(qū)域在巢氏或半巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中被廣泛應(yīng)用［31］。但是由于此區(qū)域序列的復(fù)雜多變，因此該區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物很難擴(kuò)增所有的TTV 分離株。近期對(duì)TTV 的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TTV 基因組的UTR 區(qū)域由于其更高的保守性，更加適合設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，在UTR 區(qū)域設(shè)計(jì)的引物已被證明可檢測(cè)出目前公認(rèn) 的 大 多 數(shù)TTV 亞 型［30，32］。與ORF1 區(qū) 域 設(shè) 計(jì) 的引物相比，UTR 區(qū)設(shè)計(jì)的引物，極大的提高了TTV DNA 在不同樣本中的檢出率。在Takahashi等［33］的研究中，將UTR 區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物與ORF1區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，同樣的樣本，前者的TTV 檢出率為92%，而后者的TTV 檢出率只有23%。Irving 等［34］的研究中也報(bào)道了這一情況，將UTR 區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物與ORF1 區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，前者的檢出率為50%，而后者只有9%。同時(shí)，在Itoh 等［29］的研究中，將UTR 區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物與ORF1 區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，前者的檢出率為95%，而后者只有20%。與此同時(shí)，有研究認(rèn)為，雖然UTR 區(qū)域較ORF1 區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物，其對(duì)TTV 的檢出率會(huì)極大提高；但可能會(huì)由于研究者設(shè)計(jì)位點(diǎn)選擇不夠精確的原因，而出現(xiàn)所設(shè)計(jì)的引物更加偏向于某一個(gè)型別的TTV 且對(duì)其他型別不夠靈敏的現(xiàn)象［30］。目前以TTV 為標(biāo)記物來(lái)評(píng)估器官移植等患者的免疫功能，不只需要對(duì)TTV 進(jìn)行檢測(cè)，還需要對(duì)其進(jìn)行精確定量［35］。然而，由于應(yīng)用于TTV 定量的不同的real-time PCR 方法檢測(cè)結(jié)果間存在差異，因此，對(duì)TTV 病毒載量的檢測(cè)需要進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估和比較。一般來(lái)說(shuō)，使用基于UTR 區(qū)域的檢測(cè)方法，其靈敏度較基于ORF 區(qū)域的檢測(cè)能力高10～100 倍［17，33］?，F(xiàn) 階 段 所 報(bào) 道 的Real-time PCR 測(cè) 定的檢測(cè)下限約為102copies/μL～103copies/μL，且該檢測(cè)值僅可以用于測(cè)定評(píng)估的特定TTV 基因型［36，37］。面 對(duì) 這 種 挑 戰(zhàn)，本 研 究 開 發(fā) 的Real-time PCR 方法無(wú)疑提供了一個(gè)可行的工具。筆者分析了具有序列高變性的多個(gè)亞型的TTV 引物設(shè)計(jì)的靶基因序列，篩選到本研究所述能廣譜檢測(cè)到多個(gè)亞型TTV 的引物和探針組合物。此方法相對(duì)于已公開的其他引物組合物，檢測(cè)覆蓋范圍更廣，檢測(cè)靈敏度高達(dá)101copies/μL。通過(guò)核酸測(cè)序分析驗(yàn)證，本研究檢測(cè)TTV 的陽(yáng)性符合率為100%，對(duì)TTV 檢測(cè)的特異性更高。

本研究的主要局限在于為了能夠檢測(cè)更多的TTV 亞型，real-time PCR 檢測(cè)方法的引物選取了高度保守的UTR 區(qū)域的保守片段。因此，雖然本realtime PCR 檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到目前已知大部分基因型的TTV，但不能用于區(qū)分TTV 的亞型。未來(lái)的研究應(yīng)考慮開發(fā)既能覆蓋廣泛基因型的檢測(cè)方法，又能對(duì)TTV 的不同亞型進(jìn)行更區(qū)分的檢測(cè)方法。

綜上所述，本研究采用基于TaqMan 探針的real-time PCR 檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏性高、覆蓋基因型范圍廣，檢出率高，尤其對(duì)于TTV 病毒載量較低的情況下能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，為探索TTV 作為疾病生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用提供重要的更全面的技術(shù)支持。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

賈毅博：實(shí)驗(yàn)操作并撰寫論文；王高玉、鄧宛心：負(fù)責(zé)樣本收集與數(shù)據(jù)整理；林彩云、楊華、陳運(yùn)春：負(fù)責(zé)論文審閱與修改；尹飛飛：全程參與、指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作并修改論文。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。