沈艷玲，劉承紅，王世魁，徐 堯，張云波，顧申紅

（1.海南醫(yī)學(xué)院，海南省創(chuàng)傷與災(zāi)難救援研究重點實驗室，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570102）

缺血性心肌病是指冠狀動脈病變心肌持續(xù)性缺血引起的心肌舒縮廣泛失調(diào)，導(dǎo)致心功能不全的一類疾病。心肌缺血是冠心病、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的初始病因。心肌梗死是病理生理學(xué)涉及心肌缺血、臨床上發(fā)病率和死亡率相對較高的心血管疾病。心肌梗死后會引發(fā)氧化應(yīng)激和過度生成炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致一系列促級聯(lián)反應(yīng)損傷心肌細(xì)胞并加速心肌細(xì)胞的凋亡過程［1］。研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死后導(dǎo)致心肌細(xì)胞不良重塑和梗死面積急劇惡化的觸發(fā)因素是機體白細(xì)胞和清除心肌細(xì)胞壞死碎片的平衡紊亂發(fā)生心肌細(xì)胞壞死碎片的炎癥發(fā)應(yīng)，一旦機體持續(xù)發(fā)生的炎癥反應(yīng)就會通過一些細(xì)胞因子會加速心肌細(xì)胞死亡，損害正常存活心肌細(xì)胞的收縮功能［2］。而氧化應(yīng)激參與多種缺血性心臟病的發(fā)生，當(dāng)體內(nèi)氧自由基生產(chǎn)和清除失衡時會引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損和功能障礙［3］。因此探索缺血環(huán)境下心肌細(xì)胞損傷的分子機制，尋找有效的抗心肌缺血藥物預(yù)防或減少心肌細(xì)胞損傷對控制缺血性心肌病具有重要的意義。

RhoA/ROCK 是一種重要的信號傳導(dǎo)通路，在心肌缺血中起著非常重要的作用。在心肌缺血過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，進而激活RhoA/ROCK 信號通路刺激肌球蛋白輕鏈磷酸化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞收縮增強，使心肌供血進一步受限造成心肌損傷［4］。此外，激活的RhoA/ROCK 還能促進炎癥介質(zhì)的釋放進一步加重心肌缺血損傷［5］。黃芩苷（Baicalin）是一種從雙子葉唇形科植物黃芩干燥根中提取分離得到的黃酮類化合物，其化學(xué)名稱為5，6-二羥基-7-O-葡萄糖醛酸黃酮甙。眾多研究表明，黃芩苷具備多種藥理作用，如抗炎、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)肝功能和免疫系統(tǒng)等。黃芩苷還展示出對腦缺血模型的神經(jīng)保護作用［6］，能通過促進巨噬細(xì)胞從M1 型向M2 型的轉(zhuǎn)換來減輕心肌炎癥反應(yīng)、緩解心肌損傷并抑制心肌細(xì)胞凋亡［7］。黃芩苷可應(yīng)用于內(nèi)皮功能損傷、氧化應(yīng)激、炎癥激活、血小板聚集、血管平滑肌細(xì)胞異常增殖與遷移等原因?qū)е碌男呐K缺血性疾?。?］，因此黃芩苷具有成為治療心肌缺血損傷的潛在候選藥物。但是黃芩苷在抗心肌缺血損傷作用機制仍然不充分，是否可以通過RhoA/ROCK 通路發(fā)揮對心肌缺血損傷起保護作用尚未報道?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本研究計劃以H9c2 心肌細(xì)胞為研究對象，構(gòu)建體外H9c2 細(xì)胞缺氧損傷模型以模擬心肌缺血損傷，旨在探討黃芩苷是否通過RhoA/ROCK 通路對大鼠心肌細(xì)胞缺氧損傷產(chǎn)生保護作用。本研究旨在為心肌缺血相關(guān)疾病的治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，為心肌細(xì)胞保護研究提供新的研究思路。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞（H9c2），購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 氯化鈷（CoCl2）（上海生工生物工程有限公司）；黃芩苷（成都麥德生科技有限公司）；Y-27632（MCE）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco）；胎牛血清、胰蛋白酶細(xì)胞消化液（BI）；CCK8（Cell Counting Kit-8）細(xì)胞活力檢測試劑盒、二氯熒光黃雙乙酸鹽（Dichlorofluoresceindiacetate， DCFH-DA）熒光探針、MDA 試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（特超敏）（biosharp）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma-Aldrich）；青霉素-鏈霉素溶液、PBS 緩沖液（procell）；SOD 試劑盒（碧云天公司）；兔單克隆抗體RhoA （1∶1 000）（成都正能生物技術(shù)有限公司）；抗ROCK1（1∶1 000）、抗ROCK2（1∶2 000）（景杰生物科技有限公司）；抗TNF-α（1∶2 000）、抗IL-1β（1∶2 000）、辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠或抗兔二抗（bioss）；β-actin（1∶1 000）（武漢賽維爾生物科技有限公司）。酶標(biāo)儀（Bio-Rad：Model3550-UV）；凝 膠 成 像 系 統(tǒng)（Bio-Rad：Gel doc1000）；臺式（冷凍）高速離心機（Eppendorf：5810R，5415D）；低速冷凍離心機（Eppendorf 公司）；超低溫冰箱（-80 ℃，Haier）、超凈工作臺（Biological Safety Cabinets， ClassII， NUAIR， SANYO）；電泳儀（Bio-Rad）；CO2孵育箱（SANYO）流式細(xì)胞儀（EPICSXL，COULTER）；激光共聚焦顯微鏡（TCS SP5Ⅱ，Leica）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立體外心肌細(xì)胞缺氧損傷模型 H9c2 細(xì)胞用含10%胎牛血清含雙抗的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)在生長期內(nèi)的H9c2 細(xì)胞制備細(xì)胞懸 液，5 000/孔接種于96 孔板15 h 后構(gòu)建H9c2 細(xì)胞缺氧損傷模型，采用不同濃度的氯化鈷（CoCl2）對H9c2 細(xì)胞進行缺氧處理。為模擬缺氧條件，使用氯化鈷作為化學(xué)試劑：棄去原液后加入完全培養(yǎng)基，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過預(yù)實驗，設(shè)立對照組及不同CoCl2濃度缺氧組（100、300、500、750、1 000、1 300、1 600、2 000 μmol/L），進行12、24、36 h 的缺氧狀態(tài)培養(yǎng)，以確定最佳造模條件。造模后，采用CCK8 法并使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測各孔吸光度（optical density，OD），以判斷各組細(xì)胞增殖情況。將各組細(xì)胞的OD 值分別與對照組的OD 值均數(shù)進行比較，計算各組細(xì)胞活力值，并繪制曲線圖，從而選取最佳缺氧造模條件。

1.2.2 分組 在確定最佳缺氧造模條件后，進行細(xì)胞培養(yǎng)和分組：（1）對照組：未使用黃芩苷和CoCl2藥物處理，加入DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h。（2）CoCl2組：通過最佳Co-Cl2造模濃度成功造模后，加入相同體積的完全培養(yǎng)基并在相同培養(yǎng)箱環(huán)境中進行培養(yǎng)。（3）CoCl2+Baicalin 組：將黃芩苷干粉充分溶解于DMSO 中，配制成濃度為150 mmol/L 的儲存液，DMSO 的終濃度≤0.1%。將配置的黃芩苷儲存液稀釋成濃度為10、25、50、75、100 μmol/L 的五個組別，確定最佳黃芩苷藥物濃度條件后，在最佳CoCl2造模濃度下加入最佳黃芩苷藥物濃度，并在相同培養(yǎng)基體積及培養(yǎng)箱環(huán)境中進行培養(yǎng)。（4）CoCl2+Baicalin+Y27632組：在最佳CoCl2造模濃度和最佳黃芩苷藥物濃度下，加入濃度為10 μmol/L 的Y27632（選擇性Rho激酶抑制劑），并在相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)。（5）CoCl2+Y27632 組：在 黃 芩 苷+CoCl2+Y27632 組的基礎(chǔ)上，不使用黃芩苷干預(yù)。

1.2.3 CCK8 檢測各組細(xì)胞增殖情況 按照每孔約5 000 個細(xì)胞的數(shù)量，以100 μL 的體積在96 孔板中接種細(xì)胞。在孔板外圍添加PBS，以減少培養(yǎng)孔內(nèi)液體的揮發(fā)。蓋上蓋子，然后在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h。按照前述分組及藥物處理方法進行細(xì)胞干預(yù)。每孔加入100 μL 含有10 μL CCK-8 溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基，避光操作。采用槍頭沿孔內(nèi)側(cè)壁注入的方式，以防止產(chǎn)生氣泡。將細(xì)胞與CCK-8 溶液在37 ℃、避光條件下共同孵育0.5～2.5 h。

1.2.4 熒光探針檢測活性氧（Reactive oxygen species，ROS） 在消化細(xì)胞并進行細(xì)胞計數(shù)后，將細(xì)胞均勻接種至無菌的15 mm 共聚焦小皿中，每個小皿約含有5×104個細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到約70%時，以1∶1 000 的比例使用無血清培養(yǎng)液稀釋ROS 探針DCFH-DA 至10 μmol/L。在棄去細(xì)胞培養(yǎng)基后，加入足夠的DCFH-DA 溶液以覆蓋細(xì)胞，然后在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。使用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3 次，以充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，于倒置顯微鏡觀察熒光強度。

1.2.5 黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定SOD 活力、硫代巴比妥酸顯色法檢測MDA 消化細(xì)胞后收集各組H9c2 心肌細(xì)胞經(jīng)超聲破碎處理后檢測SOD 活力和MDA 含量。所有步驟均根據(jù)試劑盒說明操作。通過酶標(biāo)儀設(shè)定特定波長（MDA 檢測波長：532 nm；SOD 檢測波長：450 nm），檢測各個孔的OD 值并計算結(jié)果。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法分析（Westernblot） 通過Western blot 方 法 檢 測RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β 蛋白的表達(dá)水平：各組經(jīng)過不同處理后，使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，定量蛋白濃度后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜（聚偏二氟乙烯膜）。在封閉后，加入一抗孵育過夜，用TBST 洗滌后加入二抗孵育。顯影等操作后，使用ImageJ 軟件分析灰度值，利用GraphPad Prism 8 進行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CoCl2對H9c2 細(xì)胞存活率的影響

通過建立H9c2 細(xì)胞缺氧模型，經(jīng)0、100、300、500、750、1 000、1 300、1 600、2 000 μmol/L 濃度的氯化鈷（CoCl2）對H9c2 細(xì)胞進行12 h、24 h、36 h 缺氧狀態(tài)處理。隨著CoCl2濃度的增高和時間的延長，H9c2 細(xì) 胞 存 活 率 逐 漸 下 降。在1 000 μmol/L CoCl2處 理H9c2 細(xì) 胞24 h 后，細(xì) 胞 活 力 降 至（55.16±3.29）%，與0 h 相比具有顯著差異（P＜0.001）?；盍ο陆党潭忍幱?0～60%范圍內(nèi)，適中且可控。因此，后續(xù)實驗中選用1 000 μmol/L Co-Cl2建立H9c2 心肌細(xì)胞缺氧損傷模型。見表1。

表1 不同濃度CoCl2對H9c2 細(xì)胞活性的影響（n=3，±s）Tab 1 Effect of different concentrations of CoCl2 on H9c2 cell viability（n=3，±s）

表1 不同濃度CoCl2對H9c2 細(xì)胞活性的影響（n=3，±s）Tab 1 Effect of different concentrations of CoCl2 on H9c2 cell viability（n=3，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

CoCl2濃度（μmol/L）時間（h）36 h 100.00±1.95 82.00±0.95***76.17±14.46***65.15±5.70***47.81±4.07***35.98±5.91***28.36±3.00***27.22±5.01***16.66±1.91***89.13＜0.001 0 100 300 500 750 1 000 1 300 1 600 2 000 FP 12 h 100.00±9.88 98.80±4.20 95.50±3.54 87.37±1.81**82.30±3.56***77.08±3.18***66.66±3.72***63.28±4.47***61.21±4.20***40.67＜0.001 24 h 100.00±3.91 93.48±2.03 88.27±2.13***82.58±2.53***66.71±3.73***55.16±3.29***51.15±5.05***45.75±3.85***36.29±3.79***173.93＜0.001

2.2 不同濃度的Baicalin 對CoCl2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞缺氧損傷的影響

使用CCK8 法檢測10、25、50、75、100 μmol/L濃 度黃芩 苷Baicalin 對1 000 μmol/L CoCl2處理24 h 的H9c2 細(xì)胞活力的影響。隨著Baicalin 濃度增高，H9c2 細(xì)胞存活率呈逐漸上升趨勢。單獨CoCl2組 相 比，75 μmol/L Baicalin+CoCl2組 細(xì) 胞 活 力 為（69.54±2.97）%，開始具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。然 而，10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 與CoCl2組，75 μmol/L 濃度組與100 μmol/L 濃度組之間的H9c2 細(xì)胞活力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，后續(xù)實驗中選用75 μmol/L Baicalin 作為治療心肌細(xì)胞缺氧損傷的治療濃度。見表2。

表2 不同濃度Baicalin 對CoCl2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞缺氧損傷的影響（n=3，±s）Tab 2 Effect of different concentrations of Baicalin on Co-Cl2-induced hypoxic injury in H9c2 cells （n=3，±s）

表2 不同濃度Baicalin 對CoCl2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞缺氧損傷的影響（n=3，±s）Tab 2 Effect of different concentrations of Baicalin on Co-Cl2-induced hypoxic injury in H9c2 cells （n=3，±s）

注：與對照組相比，***P＜0.001，與CoCl2 相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

細(xì)胞活力（%）100.00±9.26 59.00±2.50***60.48±3.45 62.99±4.97 65.81±6.26 69.54±2.97#71.78±2.32##32.32 P＜0.001組別對照組CoCl2組CoCl2+Baicalin 10 μmol/L 組CoCl2+Baicalin 25 μmol/L 組CoCl2+Baicalin 50 μmol/L 組CoCl2+Baicalin 75 μmol/L 組CoCl2+Baicalin 100 μmol/L 組FP

2.3 Baicalin 對H9c2 增殖能力的影響

將各組細(xì)胞按2.2 分組進行藥物干預(yù)。與對照組相比，CoCl2組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.001）；與CoCl2組 相 比，CoCl2+Baicalin 組 和CoCl2+Y27632組細(xì)胞活力得到緩解（P＜0.05）；與CoCl2+Baicalin組 相 比，CoCl2+Baicalin+Y27632 聯(lián) 合 組H9c2 細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組H9c2 細(xì)胞存活率情況（n=3，±s）Tab 3 H9c2 cells survival in each group（n=3，±s）

表3 各組H9c2 細(xì)胞存活率情況（n=3，±s）Tab 3 H9c2 cells survival in each group（n=3，±s）

注：與對照組相比，***P＜0.001；與CoCl2 相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與CoCl2+Baicalin 組相比，&&P＜0.01。

細(xì)胞活力（%）100.00±1.31 56.16±4.03***62.84±2.19#61.75±1.08#73.66±4.11&&149.80＜0.001組別對照組CoCl2組CoCl2+Baicalin 組CoCl2+Y27632 組CoCl2+Baicalin++Y27632 組FP

2.4 Baicalin 對各組H9c2 細(xì)胞ROS 水平的檢測

與對照組相比，CoCl2作用H9c2 心肌細(xì)胞24 h可引起顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量的ROS（P＜0.001，t=11.08）；與CoCl2組 相 比，Baicalin 或Y27632 預(yù)處理H9c2 細(xì)胞均能明顯減少H9c2 細(xì)胞內(nèi)ROS 的 堆 積（P＜0.01，t=7.32；P＜0.01，t=7.11）；Y27632 Rho 激酶抑制劑干預(yù)后，CoCl2+Baicalin+Y27632 組 相 比CoCl2+Baicalin 組H9c2 細(xì) 胞內(nèi) ROS 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05，t=2.93）。見圖1。

圖1 各組H9c2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平（100×）Fig 1 Intracellular ROS levels of H9c2 in each group（100×）

2.5 Baicalin 對各組H9c2 細(xì)胞SOD 活 力、MDA 含量的檢測

試劑盒測定結(jié)果顯示，與對照組相比，CoCl2誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞損傷后SOD 活性下降，MDA 含量升高（P＜0.001，t=11.23；P＜0.01，t=7.99）；與Co-Cl2相比，Baicalin 或Y27632 預(yù)處理后可升高SOD活 性（P＜0.05，t=4.18；P＜0.05，t=2.94），降 低MDA 含量（P＜0.05，t=2.90；P＜0.05，t=3.20）；與CoCl2+Baicalin 組 相 比，CoCl2+Baicalin+Y27632組更能顯著增高SOD 活力，降低MDA 含量（P＜0.05，t=3.16；P＜0.05，t=2.79）。見圖2。

圖2 各組H9c2 細(xì)胞SOD 活力、MDA 含量Fig 2 SOD activity and MDA content in H9c2 cells of each group

2.6 Baicalin 對各組H9c2 細(xì)胞中信號蛋白和炎癥因子蛋白的表達(dá)情況

信號蛋白相對表達(dá)量表達(dá)情況：與對照組相比，CoCl2組中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白相對表達(dá) 量 明 顯 增 加（P＜0.001，t=11.57；P＜0.01，t=6.90；P＜0.01，t=5.74）；與CoCl2組 相 比，CoCl2+Baicalin 組RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白相對表達(dá)量下降（P＜0.05，t=2.82；P＜0.05，t=4.33；P＜0.01，t=5.67），CoCl2+Y27632 組RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白相對表達(dá)量也呈下降趨勢（P＜0.01，t=5.46；P＜0.05，t=3.88；P＜0.05，t=3.37）；與CoCl2+Baicalin組，CoCl2+Baicalin+Y27632 組RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白相對表達(dá)量顯著下降（P＜0.05，t=4.56；P＜0.01，t=5.07；P＜0.05，t=3.30）。見圖3。

圖3 各組H9c2 細(xì)胞蛋白相對表達(dá)量比較（n=3，±s）Fig 3 Comparison of relative protein expression in H9c2 cells of each group （n=3，±s）

炎癥因子蛋白相對表達(dá)情況：與對照組相比，CoCl2組中IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達(dá)量明顯增加（P＜0.001，t=13.35；P＜0.001，t=9.75）；與CoCl2組相比，CoCl2+Baicalin 組IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達(dá)量下降（P＜0.05，t=4.31；P＜0.05，t=2.82），CoCl2+Y27632 組IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達(dá)量也呈下降趨勢（P＜0.05，t=3.24；P＜0.05，t=3.19）；與CoCl2+Baicalin 組，CoCl2+Baicalin+Y27632 組IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達(dá)量顯著下降（P＜0.05，t=2.84；P＜0.01，t=5.12）。見圖3。

3 討論

在心臟組織中，由于心肌細(xì)胞損失無法通過有效的細(xì)胞增殖來補償，異常的心肌細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致心臟疾病的發(fā)生［9］。在諸多心臟病類型中，缺血性心臟病是導(dǎo)致死亡或殘疾的主要原因之一。目前發(fā)現(xiàn)無論是年輕人還是老年人罹患急性心肌梗死常伴有炎性細(xì)胞浸潤［10］，這可能是心肌細(xì)胞缺氧后和募集的炎癥細(xì)胞通過病原體相關(guān)分子模式（PAMP）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）與模式識別受體（PRRs）的結(jié)合而被激活，隨后激活多種信號通路，最終過度表達(dá)更多促炎介質(zhì)［11］。另外心肌缺血時血流恢復(fù)與活性氧的毒性作用有關(guān)［12］。這可能是氧化應(yīng)激對心肌細(xì)胞中的一些生物分子造成氧化損傷影響鈣離子平衡，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升導(dǎo)致心肌細(xì)胞收縮力［13］，氧化應(yīng)激也會影響心肌細(xì)胞的線粒體功能，線粒體功能障礙影響心肌細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)形成惡行循環(huán)，一旦受損的線粒體增加就會激活心肌細(xì)胞死亡的途徑［14］。

為了評估缺血損傷期間黃芩苷Baicalin 對心肌細(xì)胞的影響，本研究采用體外誘導(dǎo)的缺氧模型進行探討。研究結(jié)果顯示，1 000 μmol/L 的CoCl2處理H9c2 細(xì)胞24 h 后，以及75 μmol/L 黃芩苷作為治療心肌細(xì)胞缺氧損傷濃度時，細(xì)胞活力較佳。在確定最佳條件后，對H9c2 細(xì)胞設(shè)置對照組、CoCl2組、CoCl2+Baicalin 組、CoCl2+Baicalin+Y27632 組、CoCl2+Y27632 組，通過活性氧熒光法檢測ROS 水平，MDA 和SOD 檢測氧化應(yīng)激水平，Western Blot方法檢測RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β 的蛋白表達(dá)。

活性氧（ROS）是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素。在心肌缺氧過程中會引起細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙、Ca2+離子平衡紊亂、氧自由基的大量產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)的激活等，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的氧化損傷。這些氧自由基和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)會直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而加劇心肌細(xì)胞的損傷和死亡［15］。ROS 與多種信號通路有關(guān)，其中ROS 可激活RhoA，這可能與形成分子內(nèi)二硫化物，阻止鳥嘌呤核苷酸結(jié)合使RhoA 失活或促進鳥嘌呤核苷酸激活RhoA 有 關(guān)［16］。另 外 有 研 究 發(fā) 現(xiàn)ROS-RhoA/ROCK 通路參與了心肌梗死的病理過程［17］，還參與了減少肝細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肝纖維化［18］。而本研究結(jié)果顯示，黃芩苷能顯著降低缺氧模型中H9c2 細(xì)胞的ROS 水平，而使用Y27632 Rho 激酶抑制劑干預(yù)后，細(xì)胞中的ROS 水平出現(xiàn)明顯回升。李冰冰等［19］在研究中提到，黃芩苷可直接清除活性氧，減輕缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高心肌細(xì)胞的生物功能和存活率。而本研究進一步發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可能是通過RhoA/ROCK 通路來影響ROS 的表達(dá)，增加SOD 活力，降低MDA 濃度，從而參與H9c2 細(xì)胞缺氧過程中的氧化應(yīng)激過程。本研究中蛋白質(zhì)印跡法分析顯示與CoCl2組比較，CoCl2+黃芩 苷+Baicalin 組 的 RhoA、ROCK1、ROCK2、IL-1β、TNF-α 的蛋白表達(dá)有所降低，均再次證實了黃芩苷在心肌缺氧模型中能夠通過RhoA/ROCK通路來緩解心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞死亡率。

RhoA 作為一種廣泛表達(dá)的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，可以在細(xì)胞內(nèi)被激活并與其下游效應(yīng)蛋白ROCK 相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程。抑制RhoA/ROCK 信號通路在心血管疾病、糖尿病并發(fā)癥、腫瘤、急性肺損傷、神經(jīng)損傷性疾病、腫瘤等多種疾病的治療中具有潛在的保護作用［20］，其機制可能與減少血管平滑肌細(xì)胞的過度收縮、緩解內(nèi)皮功能障礙、減少炎癥細(xì)胞募集、改善血管和心臟重塑等相關(guān)［21］。另外黃芩苷的抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗抑郁等作用與RhoA/ROCK 降低有關(guān)［22］，這間接說明黃芩苷可能通過抑制RhoA/ROCK 通路來發(fā)揮生物學(xué)作用。而本文研究表明黃芩苷減輕心肌缺血損傷實現(xiàn)對心臟的保護作用與抑制RhoA/ROCK 信號通路有關(guān)，這為黃芩苷作為心肌缺血相關(guān)疾病的治療藥物提供重要的實驗基礎(chǔ)。目前RhoA/ROCK 信號通路廣泛參與細(xì)胞收縮、遷移、增殖 的調(diào)節(jié)，而Yang 等［23］的研究表明RhoA/ROCK 信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長、增殖是通過miR-126 進行調(diào)控。本研究僅分析了黃芩苷通過RhoA/ROCK 通路來緩解心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低細(xì)胞凋亡率，尚未探究黃芩苷是否通過調(diào)控miR-126 來影響RhoA/ROCK 通路，后續(xù)可進一步實驗來證實。

本研究首次揭示了黃芩苷通過影響RhoA/ROCK 信號通路實現(xiàn)對心肌細(xì)胞缺氧的保護機制，為心肌細(xì)胞缺血損傷治療提供了潛在靶點。研究聚焦于黃芩苷通過抑制ROS 依賴性調(diào)節(jié)RhoA/ROCK 信號通路對缺氧損傷心肌細(xì)胞的保護作用，這為黃芩苷在缺氧損傷疾病防治中作為新靶點的應(yīng)用提供了更加充分的理論和實驗依據(jù)，并為心肌細(xì)胞保護研究開辟了新的研究思路。

作者貢獻(xiàn)度說明：

沈艷玲：撰寫論文、數(shù)據(jù)分析；劉承紅、王世魁、徐堯：完成細(xì)胞實驗和指標(biāo)檢測、實驗數(shù)據(jù)的收集；張云波：評價文獻(xiàn)檢索，完成文章初稿修改；顧申紅：實驗設(shè)計、論文最后校審。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。