邵欣瑜 熊星 楊峰 趙云飛 劉昌來 劉國(guó)華

摘要： ??為探究月月竹竹稈受到光照由綠色變?yōu)樽仙姆肿訖C(jī)制，本研究采集月月竹同一竹節(jié)紫色部分（Z）、漸變部分（M）和綠色部分（L）的竹青，提取RNA，利用PacBio Sequel三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)不同顏色的竹青進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明，經(jīng)過三代測(cè)序和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，共獲得非冗余轉(zhuǎn)錄本66 961條，長(zhǎng)度為500～3 000 bp，平均長(zhǎng)度1 389.22 bp，序列總長(zhǎng)度為93.02 Mbp，N50為1 830 bp，G+C堿基含量為49.56%。利用NR、Swiss-Prot、COG、GO、KEGG和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋，共有56 938條轉(zhuǎn)錄本被成功注釋，占全部轉(zhuǎn)錄本的85.03%；49 115條轉(zhuǎn)錄本被GO注釋，其中催化活性、細(xì)胞器、代謝過程分別是GO數(shù)據(jù)庫(kù)分子功能、細(xì)胞組分和生物過程中含轉(zhuǎn)錄本最多的項(xiàng)目；28 231個(gè)轉(zhuǎn)錄本被KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，其中與碳水化合物代謝和基因翻譯相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本最多。結(jié)合GO注釋和KEGG注釋，66 961條轉(zhuǎn)錄本中有381條轉(zhuǎn)錄本與光信號(hào)的感受、傳遞以及光調(diào)控相關(guān)，包括紅光和遠(yuǎn)紅光的受體蛋白PHYA、PHYB及信號(hào)通路蛋白PIF3、ELF3，藍(lán)光的受體蛋白CRY、ZTL及信號(hào)通路蛋白COP1、SPA1、ELF3、GI、HY5等。類黃酮（包括花青素）代謝、葉綠素合成、類胡蘿卜素合成等與植物色素合成相關(guān)通路分別含有轉(zhuǎn)錄本187條、44條和72條。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本共獲得2 079個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中包括18個(gè)由35個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼的與花青素合成相關(guān)的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子。CNCI、CPC、Pfam、PLEK等數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)注釋到的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）6 359個(gè)，數(shù)量高于孝順竹等其他竹種。本研究獲得了高質(zhì)量的月月竹竹青全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，與竹稈變色相關(guān)的紅光和藍(lán)光受體及光信號(hào)傳遞蛋白，與花青素、葉綠素和類胡蘿卜素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA），為進(jìn)一步深入分析月月竹竹稈變色機(jī)制提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： ?月月竹； 變色竹稈； 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序； 光信號(hào)

中圖分類號(hào)： ?S795.6 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ???文章編號(hào)： ?1000-4440（2024）03-0538-14

Full-length transcriptome sequencing analysis of Chimonobambusa sichuanensis after discoloration of bamboo culm

SHAO Xin-yu1， XIONG Xing1， YANG Feng2， ZHAO Yun-fei3， LIU Chang-lai1， LIU Guo-hua1

（1.Bamboo Research Institute， Nanjing Forestry University/Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing 210037， China； 2.Heze College of Chemical Technology， Heze 274500， China； 3.Linyi Municipal Public Security Bureau， Linyi 276000， China）

Abstract： ??In order to explore the molecular mechanism of bamboo culm changing from green to purple under light， we collected the purple part （Z）， median part （M） and green part （L） of the same bamboo node， extracted RNA， and used PacBio Sequel three-generation full-length transcriptome sequencing technology combined with bioinformatics methods to analyze the full-length transcriptome of bamboo barks with different colors. The results showed that a total of 66 961 non-redundant transcripts were obtained after three generations of sequencing and data quality control. The length ranged from 500 bp to 3 000 bp， with an average length of 1 389.22 bp. The total length of the sequence was 93.02 Mbp， the ??N50 ??was 1 830 bp， and the G+C base content was 49.56%. A total of 56 938 transcripts were successfully annotated based on NR， Swiss-Prot， COG， GO， KEGG， and Pfam databases， accounting for 85.03% of all transcripts. A total of 49 115 transcripts were annotated by GO database， among which catalytic activity， organelle and metabolic process were the items with the most transcripts in molecular function， cellular component and biological process of GO database， respectively. The 28 231 transcripts were annotated by KEGG database， of which the transcripts related to carbohydrate metabolism and gene translation were the most. Combined with GO annotation and KEGG annotation， 381 transcripts of 66 961 transcripts were related to the perception， transmission and light regulation of light signals， including red and far-red light receptor proteins PHYA， PHYB and signal pathway proteins PIF3， ELF3， blue light receptor proteins CRY， ZTL and signal pathway proteins COP1， SPA1， ELF3， GI， HY5， etc. The pathways related to plant pigment synthesis， such as flavonoid （including anthocyanin） metabolism， chlorophyll synthesis and carotenoid synthesis， contained 187 transcripts， 44 transcripts and 72 transcripts， respectively. A total of 2 079 transcription factors were obtained from the full-length transcripts， including 18 R2R3MYB transcription factors related to anthocyanin synthesis encoded by 35 transcripts. The number of long non-coding RNAs （LncRNAs） simultaneously annotated in the CNCI， CPC， Pfam， and PLEK databases was 6 359， which was higher than that of other bamboo species such as Xiaoshun bamboo. In this study， we obtained high-quality full-length transcriptome data， red and blue light receptors and light signal transduction proteins related to bamboo discoloration， and transcription factors and LncRNAs related to anthocyanin， chlorophyll and carotenoid synthesis， which provided a basis for further analysis of the mechanism of bamboo discoloration.

Key words： ?Chimonobambusa sichuanensis; color-changing bamboo culm; full-length transcriptome sequencing; light signal

中國(guó)是世界上竹類資源最豐富的國(guó)家，竹林面積、蓄積量、竹材產(chǎn)量均居世界之冠[1]。中國(guó)的竹子栽培和利用歷史悠久，現(xiàn)代竹產(chǎn)業(yè)開發(fā)也居世界領(lǐng)先地位[2]。目前，竹子在建筑業(yè)、日用品、園林設(shè)計(jì)、食品等多個(gè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[3]。竹子的稈色有紫色（如紫竹）、黃色（如烏哺雞竹）、彩條色（如綠槽毛竹）、紫褐與黃綠雜色（如斑竹）等[4]，還有一些竹子在特殊情況下，稈色會(huì)由綠色變?yōu)樽仙缣浦瘢⊿inobambusa tootsik）、月月竹（Chimonobambusa sichuanensis）、鵝毛竹（Shibataea chinensis）、壩竹（Ampelocalamus microphyllus）等。其中，月月竹在秋冬季節(jié)稈色變化很明顯，主要表現(xiàn)為向光一側(cè)呈紫色而背光一側(cè)呈綠色的特征，具有較好的觀賞性[1]。

不同品種竹稈變色的主要原因有兩個(gè)方面，一是由遺傳因素造成的，例如紫竹竹稈一般在發(fā)筍當(dāng)年的7、8月份逐漸變?yōu)辄S色，到冬季逐漸變?yōu)樽仙?年完全變?yōu)樽仙?，此后隨著竹子年齡的增加紫色逐漸加深；黃稈烏哺雞竹、綠槽毛竹等在發(fā)筍時(shí)顏色就已經(jīng)呈現(xiàn)黃色或黃稈綠槽，而斑竹竹稈的斑點(diǎn)會(huì)隨著竹齡的增加逐漸增加，直至竹稈被斑點(diǎn)全部覆蓋，呈現(xiàn)出與紫竹竹稈類似的色澤；二是由環(huán)境引起的，例如月月竹、壩竹、鵝毛竹等，這些竹種的竹稈往往在秋冬季節(jié)或者特定條件下變?yōu)樽仙?。劉昌來等[5]研究發(fā)現(xiàn)每年9月份發(fā)筍的月月竹竹稈在12月份向光一側(cè)變?yōu)樽仙彻庖粋?cè)仍然為綠色，而4月份發(fā)筍形成的竹稈在6月份并不變色，同時(shí)，不同顏色膜包裹的竹稈的變色特征存在明顯的差異，并通過單色光模擬試驗(yàn)，確定了誘導(dǎo)月月竹竹稈變色的光質(zhì)。

光是植物生長(zhǎng)的能量來源，同時(shí)也是植物眾多生理活動(dòng)的重要信號(hào)因子。光可以誘導(dǎo)植物體的形態(tài)建成[6]、光周期[7-8]、花開放[9]、葉綠體運(yùn)動(dòng)[10]、氣孔開閉[11]及花青素和木質(zhì)素合成[12-13]等諸多生理過程。光作為信號(hào)分子的作用是通過光受體來實(shí)現(xiàn)的。目前，在植物體中發(fā)現(xiàn)的光受體主要有3類：感受紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素（phyA/phyB），感受藍(lán)光的隱花色素（Cryptochromes）、向光素（Phototropins）、ZTL/KELCH 蛋白超家族等，感受紫外光的UVR8蛋白。其中，光敏色素phyB同時(shí)也是溫度受體，在植物體的形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用。月月竹竹稈的顏色一般認(rèn)為是由色素決定的，且竹稈色素主要存在于竹青部位。色素種類包括葉綠素、類胡蘿卜素、花青素以及一些有色黃酮類物質(zhì)等。葉綠素的合成主要受紅光的誘導(dǎo)，花青素合成受藍(lán)光以及高光照度的白光誘導(dǎo)，同時(shí)高光照度白光還會(huì)誘導(dǎo)木質(zhì)素和黃酮類物質(zhì)的合成[12，14]。藍(lán)光誘導(dǎo)色素合成的過程大致是，光受體感受到光信號(hào)后，通過PIFs（Phytochrome interacting factors）、COP1（Constitutive photomorphogenesis 1）、SPA1（Suppressor of phya 1）、HY5（Long hypocotyl 5）、GI（Gigantea）、PKS（Phytochrome kinase substrate）等蛋白將信號(hào)放大并進(jìn)行傳遞，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子合成從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)色素合成。同時(shí)，通過CIB（Cryptochrome-interaction basic helix-loop-helix）、PIFs、HFR1（Long hypocotyl in far-red1）等蛋白調(diào)控植物體的去黃化、低藍(lán)光誘導(dǎo)的避蔭反應(yīng)、溫度促進(jìn)生長(zhǎng)等生理活動(dòng)[12，15]。調(diào)控花青素以及黃酮合成的轉(zhuǎn)錄因子主要是與bHLH和WD40形成MBW復(fù)合體的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子和不依賴于bHLH和WD40的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子[16]。

第三代測(cè)序技術(shù)是在第二代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，為無參考基因組植物的研究開辟了新路徑，在非模式物種基因功能、基因表達(dá)調(diào)控和進(jìn)化關(guān)系等方面的研究上有諸多應(yīng)用[17]。如Ma等[18]利用三代測(cè)序技術(shù)對(duì)西番蓮（Passiflora edulis）進(jìn)行染色體水平基因組裝，通過基因組進(jìn)化分析揭示了1個(gè)雙子葉植物共有的γ全基因組三倍體事件，以及1個(gè)更近的全基因組復(fù)制事件。魏強(qiáng)等[19-21]通過高通量測(cè)序明確了竹子增粗、節(jié)間伸長(zhǎng)等生長(zhǎng)發(fā)育過程的潛在關(guān)鍵基因，且發(fā)現(xiàn)竹子節(jié)間生長(zhǎng)過程中的模塊化現(xiàn)象。

月月竹（Chimonobambusa sichuanensis）是禾本科竹亞科植物，因其優(yōu)美的外形和較強(qiáng)適應(yīng)性被視為觀賞竹種的代表。由于不被筍籜包被的節(jié)間向陽(yáng)一側(cè)在經(jīng)過陽(yáng)光照射下由原本的翠綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙?，而同一?jié)間背光一側(cè)仍然呈現(xiàn)綠色，因此月月竹常作為竹稈變色的研究材料[5]。針對(duì)月月竹竹稈變色后全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析缺乏的現(xiàn)狀，本研究使用第三代測(cè)序技術(shù)對(duì)月月竹不同顏色竹稈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過轉(zhuǎn)錄本功能注釋、轉(zhuǎn)錄因子及長(zhǎng)鏈非編碼（LncRNA）等分析，明確月月竹竹稈變色機(jī)制與成色規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年4月于南京林業(yè)大學(xué)竹園內(nèi)（118°48′E，32°01′N）內(nèi)隨機(jī)選取2020年9月發(fā)筍，高度、粗度以及分枝狀態(tài)一致的竹稈5棵，從沒有長(zhǎng)根的第一節(jié)算起，采集高度基本一致的第6節(jié)間露出筍籜的向陽(yáng)面紫色竹青、背陰面綠色竹青和側(cè)面漸變色竹青各5樣本。取樣后，樣本迅速放入液氮，后置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 竹青樣本總RNA提取

樣本在YP-S500型超聲波研磨儀 （寧波洛尚智能科技有限公司產(chǎn)品）上-20 ℃進(jìn)行研磨，使用Trizol法提取竹青樣本總RNA，利用Nanodrop2000微量分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品）對(duì)所提取總RNA的質(zhì)量濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，利用Agilent2100生物分析儀（美國(guó)安捷倫科技科技有限公司產(chǎn)品）測(cè)定RNA完整值（RIN）。單次建庫(kù)要求RNA總量≥1 μg，質(zhì)量濃度≥35 ng/μl，OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥1.0（OD為吸光度）。利用帶有Oligo（dT）的磁珠與多聚腺苷酸（ployA）進(jìn)行A、T堿基配對(duì)，富集mRNA。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

樣品的總RNA檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。主要流程如下：以mRNA為模板使用SMARTerTM PCR cDNA合成試劑盒合成全長(zhǎng)cDNA，PCR擴(kuò)增放大cDNA片段，使用PB磁珠純化擴(kuò)增的全長(zhǎng)cDNA，對(duì)全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，連接單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）啞鈴型接頭，對(duì)連接接頭的cDNA進(jìn)行核酸外切酶消化，使用 PB 磁珠純化cDNA，構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA測(cè)序文庫(kù)，然后委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Pacbio Sequel三代測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序。

1.4 序列分析和注釋

參照鞠燁等[22]的方法對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和注釋：根據(jù)接頭序列，利用CCS軟件（https：//ccs.how/）對(duì)測(cè)得的Subread測(cè)序單分子序列糾錯(cuò)，得到環(huán)形一致性序列（Circular consensus sequence，CCS）。使用Lima軟件（https：//lima.how/）將CCS序列去除barcode、5′-primer、3′-primer，利用IsoSeq3軟件去掉polyA 尾和嵌合體序列（Concatemer），獲得全長(zhǎng)非嵌合序列（Full-length non-concatemer，F(xiàn)LNC），根據(jù)唯一分子標(biāo)識(shí)（Unique molecular identifiers，UMIs）通過聚類去掉重復(fù)序列，得到預(yù)測(cè)精度≥99%的高精度非冗余共有序列（Consensus sequence），即全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列。利用BUSCO軟件（https：//gitlab.com/ezlab/busco）對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行完整性評(píng)估，利用比對(duì)軟件Diamond 0.8.36和HMMER 3.1及NR（NCBI non-redundant protein sequences）、Swiss-Prot（a manually annotated and reviewed protein sequence database）、COG（Clusters of orthologous groups of proteins）、GO（Gene ontology）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）和Pfam（Protein family）等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。

1.5 轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄因子和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）預(yù)測(cè)

使用DESeq2軟件，設(shè)置P<0.05和差異倍數(shù)（FC）>1.5，對(duì)不同顏色竹青樣品的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行差異表達(dá)分析；利用Blastx 2.11.0軟件和植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Plant TFDB）進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)；利用 CNCI（Coding-non-coding index）、CPC（Coding potential calculator）、PFAM（Protein families database）及PLEK（Psort-based LEss common nucleotide k-mers）等數(shù)據(jù)庫(kù)，通過CNCI和PLEK軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本的編碼潛能進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用CPC2軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，最終對(duì)月月竹竹青全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）數(shù)量及長(zhǎng)度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 月月竹竹稈顏色特征

月月竹竹稈的節(jié)間長(zhǎng)度為10～15 cm，如圖1所示。從圖1可以明顯看出月月竹竹稈顏色存在明顯差異，筍籜未包裹的部分為紫色，而被筍籜包裹的部分為綠色，并且向光一側(cè)為紫色，而背光一側(cè)為綠色（圖1B），紫色和綠色之間存在明顯的過渡狀態(tài)。

2.2 測(cè)序結(jié)果和序列分析

經(jīng)質(zhì)量控制，本研究共得到66 961條平均長(zhǎng)度為1 389.22 bp的轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度主要分布在500～3 000 bp，全序列總長(zhǎng)度為93.02 Mbp，最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為8 021 bp，最短為51 bp， ?N50 ?（將拼接得到的所有序列，根據(jù)序列長(zhǎng)度從大到小進(jìn)行排序，然后逐步開始累加，當(dāng)累加長(zhǎng)度超過總長(zhǎng)一半時(shí)，新加入的序列長(zhǎng)度即為 ?N50 ?）為1 830 bp，G+C堿基含量為49.56%。去冗余后的轉(zhuǎn)錄本完整性（BUSCO值）為52.4%，轉(zhuǎn)錄本完整性達(dá)到后續(xù)分析的要求。

2.3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的GO注釋

將全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本與6大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，共有56 938條轉(zhuǎn)錄本被成功注釋，占全部轉(zhuǎn)錄本的85.03%。其中，GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋到49 115條和28 231條轉(zhuǎn)錄本（圖2）。GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的49 115條轉(zhuǎn)錄本分為51個(gè)功能，其中分子功能（Molecular function）中含有轉(zhuǎn)錄本最多的為結(jié)合和催化活性功能，細(xì)胞組分（Cellular component）中含有轉(zhuǎn)錄本最多的是細(xì)胞結(jié)構(gòu)（Cell part），生物過程（Biological process）中含有轉(zhuǎn)錄本最多的為細(xì)胞過程（Cellular process）和代謝過程（Metabolic process）（圖3A）。GO注釋中與光誘導(dǎo)有關(guān)的2個(gè)生物過程輻射響應(yīng)（Response to radiation）和節(jié)律過程（Rhythmic process）分別含有864條和199條轉(zhuǎn)錄本序列；代謝過程中（Metabolic process）與色素合成（Pigment biosynthetic process）相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本有288條，這288條轉(zhuǎn)錄本主要富集到類胡蘿卜素生物合成過程（Carotenoid biosynthetic process）、原卟啉IX 生物合成過程（Protoporphyrinogen IX biosynthetic process）、含卟啉的化合物代謝過程（Porphyris-containing compound metabolic process）等類胡蘿卜素和葉綠素的合成過程中，有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本富集到黃酮醇（Flavonol）和木質(zhì)素生物合成過程中（圖3B）。注釋到輻射響應(yīng)（Response to radiation）的864條轉(zhuǎn)錄本中有381條注釋到光刺激反應(yīng)（Response to light stimulus），且這381條轉(zhuǎn)錄本主要富集到紅光、遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光和光形態(tài)建成等生物過程（圖3C）。

2.4 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的KEGG注釋

KEGG注釋結(jié)果表明共有28 231條序列參與到133條代謝通路中。133條代謝通路可分為代謝過程（Metabolism）、遺傳信息過程（Genetic information processing）、環(huán)境信息過程（Environmental information processing）、細(xì)胞過程（Cellular processes）、生物系統(tǒng)（Organismal systems）等（圖4A）。其中萜類和聚酮代謝過程中的萜骨架合成（Terpenoid backbone biosynthesis）和類胡蘿卜素代謝過程（Carotenoid biosynthesis）中轉(zhuǎn)錄本最多；苯丙烷類合成和黃酮醇合成等次生代謝過程中轉(zhuǎn)錄本也較多；在植物體應(yīng)對(duì)外界環(huán)境（Environmental information processing）作用中，有178個(gè)轉(zhuǎn)錄本注釋到植物生物節(jié)律信號(hào)通路中（Circadian rhythm-plant），包括紅光和遠(yuǎn)紅光受體PHYA、PHYB及信號(hào)通路蛋白PIF3、ELF3，藍(lán)光受體CRY、ZTL及信號(hào)通路蛋白COP1、SPA1、ELF3、GI、HY5等（圖4B）。

2.5 轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析

月月竹紫色竹青與綠色竹青、紫色竹青與漸變色竹青、漸變色竹青與綠色竹青3個(gè)比較組共獲得差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本1 710個(gè)。漸變色竹青與綠色竹青比較組具有差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本400個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)226個(gè)，下調(diào)表達(dá)174個(gè)；紫色竹青與漸變色竹青比較組共有差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本854個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)724個(gè)，下調(diào)表達(dá)130個(gè)（圖5A）。紫色竹青與漸變色竹青中有220個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量明顯高于綠色竹青，138個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量明顯低于綠色竹青（圖5B）。1 710個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本GO富集分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄本顯著富集到海藻糖、雙糖、寡糖等生物合成過程和陽(yáng)離子、離子、門控等通道（圖6A），同時(shí)脫落酸（ABA）信號(hào)和赤霉素（GA）信號(hào)響應(yīng)途徑也得到富集。差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本KEGG富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本顯著富集到內(nèi)吞作用（Endocytosis）以及淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）等過程，黃酮類物質(zhì)合成上游的苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）和苯丙烷代謝（Phenylpropanoid biosynthesis）途徑也分別富集到3個(gè)和6個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本；類黃酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）也富集到2個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，這2個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本是黃酮醇合成花青素的關(guān)鍵基因；卟啉和葉綠素代謝過程（Porphyrin and chlorophyll metabolism） 富集到6個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，類胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis）過程、萜類骨架生物合成（Terpenoid backbone biosynthesis）過程分別富集到2個(gè)和1個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，植物晝夜節(jié)律 （Circadian rhythm-plant）富集到2個(gè)編碼光信號(hào)途徑的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（HY5和CK2）。

2.6 色素代謝有關(guān)轉(zhuǎn)錄本

2.6.1 黃酮類代謝有關(guān)轉(zhuǎn)錄本 ?苯丙烷類代謝是木質(zhì)素合成的重要途徑，也是黃酮醇以及花青素合成的上游途徑。根據(jù)KEGG的注釋，共有186條轉(zhuǎn)錄本序列被注釋到苯丙烷類代謝通路中（表1）。涉及到的編碼蛋白質(zhì)包括莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶（PTAL）、4-香豆酸-CoA連接酶（ ?4CL ?）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、肉桂酰輔酶α還原酶（CCR）、阿魏酸5-羥化酶（ ?F5H ?）等（表1），其中，編碼莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）的轉(zhuǎn)錄本最多。黃酮醇在二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）、花青素合酶（ANR）、糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下合成為穩(wěn)定的花青素。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中獲得1個(gè)編碼花色素苷3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶（ ?BZ1 ?）的轉(zhuǎn)錄本。

2.6.2 類胡蘿卜素合成有關(guān)轉(zhuǎn)錄本 ?萜類骨架合成的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），在八氫番茄紅素合成酶（crtB）催化下縮合形成八氫番茄紅素的順式異物體，然后進(jìn)一步脫氫、催化合成葉黃素、胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)等類胡蘿卜素物質(zhì)。本研究注釋到的類胡蘿卜素合成基因包括八氫番茄紅素合成酶基因（crtB）、八氫番茄紅素脫氫酶基因（PDS）、胡蘿卜素去飽和酶基因（ZDS）、玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因（ZEP）、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因（VDE）、前番茄紅素異構(gòu)酶基因（crtISO）、胡蘿卜素羥化酶基因（crtIz）、番茄紅素環(huán)化酶基因（IcyE）等，共72個(gè)轉(zhuǎn)錄本（表2）。

2.6.3 葉綠素合成有關(guān)轉(zhuǎn)錄本 ?幼竹期至成竹期，竹稈往往表現(xiàn)出綠色，葉綠素是竹青中的重要色素。本研究中共富集到44個(gè)與葉綠素合成相關(guān)的基因，包括編碼Glu-tRNA合成酶基因、Glu-tRNA還原酶基因、膽色素原合酶（ALAD）基因、鎂螯合酶基因等。

2.7 光受體和光信號(hào)通路有關(guān)轉(zhuǎn)錄本

植物體通過光受體感受到各種光質(zhì)的光，紅光和遠(yuǎn)紅光的受體為光敏色素蛋白，藍(lán)光的受體為隱花色素（CRY）、向光素、ZTL蛋白家族等，紫外光的受體為UVB8等。這些受體感受到光信號(hào)的變化后，通過下游的信號(hào)分子將光信號(hào)傳遞下去。本研究共獲得131個(gè)光受體和光信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄本（表1），包括光敏色素A（PHYA）轉(zhuǎn)錄本9個(gè)，光敏色素B（PHYB）轉(zhuǎn)錄本2個(gè)，藍(lán)光受體隱花色素基因 ?CRY1 ?轉(zhuǎn)錄本22個(gè)、 ?CRY2 ?轉(zhuǎn)錄本4個(gè)，生物鐘相關(guān)PAS蛋白基因ZTL轉(zhuǎn)錄本17個(gè)及光敏色素相互作用因子3基因（ ?PIF3 ?）轉(zhuǎn)錄本11個(gè)、轉(zhuǎn)錄因子基因 ?HY2 ?轉(zhuǎn)錄本3個(gè)、轉(zhuǎn)錄因子基因 ?HY5 ?轉(zhuǎn)錄本12個(gè)、PHYA-1051的蛋白質(zhì)抑制劑基因 ?（SPA1 ?）轉(zhuǎn)錄本3個(gè)、 ?GIANTEA（GI） ?基因轉(zhuǎn)錄本18個(gè)、F-box蛋白1基因 ?（FKF1 ?）轉(zhuǎn)錄本2個(gè)等。上述轉(zhuǎn)錄本調(diào)控節(jié)間伸長(zhǎng)、開花等生理過程。編碼HY5蛋白的轉(zhuǎn)錄本具有明顯的表達(dá)差異。

2.8 月月竹轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子是一種可與基因啟動(dòng)子區(qū)序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)，具有調(diào)控下游基因表達(dá)的功能，同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子通過蛋白質(zhì)互作具有參與信號(hào)傳遞的功能。本研究中，月月竹66 961個(gè)轉(zhuǎn)錄本（Unigenes）中共預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子2 079個(gè)，涵蓋33個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族（圖7），其中WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子最多，有316個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其次為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族、MYB轉(zhuǎn)錄因子超家族、bHLH和NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，含有HY5轉(zhuǎn)錄因子的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族也具有131個(gè)轉(zhuǎn)錄本。目前認(rèn)為R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子是由轉(zhuǎn)錄因子bHLH和轉(zhuǎn)錄因子WD40形成的MBW復(fù)合體，調(diào)控花青素和原花青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[23]。本研究獲得的轉(zhuǎn)錄本中有35轉(zhuǎn)錄本編碼為18個(gè)R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子（表2），其中MYB2、MYB20/ODO1等轉(zhuǎn)錄因子與花青素和原花青素以及苯丙烷代謝的上游莽草酸合成途徑有關(guān)。

2.9 長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）有關(guān)轉(zhuǎn)錄本

基于CNCI、CPC、PFAM及 PLEK等數(shù)據(jù)庫(kù)及竹青全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，月月竹長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）數(shù)量如圖8A所示。從圖中可以看出，CNCI、CPC、Pfam、Plek等數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋到9 421條、29 577條、26 436條、30 323條LncRNA，4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)注釋到的LncRNA為6 359條。其中，最長(zhǎng)的LncRNA為3 383 nt，平均長(zhǎng)度為532.22 nt， ?N50 ?為604 nt，LncRNA長(zhǎng)度分布見圖8B所示。

3 討 論

3.1 月月竹竹青中基因表達(dá)量較低

植物體不同部位的基因表達(dá)量并不一致，一般生長(zhǎng)旺盛的組織，基因表達(dá)量較高，RNA數(shù)量也較多。在竹子的全生長(zhǎng)期內(nèi)，筍期RNA較豐富，而成熟的竹稈RNA豐富度較低。為了探究月月竹竹稈的變色機(jī)理，本研究利用PacBio Sequel全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)方法得到月月竹竹青變色后的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組，通過組裝和質(zhì)量控制，共獲得高質(zhì)量序列66 961條，平均長(zhǎng)度為1 389.22 bp， ?N50 ?為1 830 bp，說明獲得的序列組裝完整性較高[24]，但是組裝序列少于生長(zhǎng)盛期的孝順竹筍籜（106 148條）[22]，與早竹節(jié)間組裝序列基本相似（63 776條）[25]，表明月月竹竹青基因表達(dá)數(shù)量遠(yuǎn)小于筍籜中的基因表達(dá)數(shù)量，同時(shí)

也說明本研究所獲得的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)可以用于深入的分析。轉(zhuǎn)錄本功能注釋發(fā)現(xiàn)，大多轉(zhuǎn)錄本與植物體生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，而基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，同一節(jié)間的不同顏色竹青中糖代謝基因和陽(yáng)離子通道蛋白基因表達(dá)存在顯著差異。多糖是組成細(xì)胞壁纖維素的主要成分，同時(shí)細(xì)胞壁上含有大量的鈣、硅和鈉離子，說明不同顏色竹青細(xì)胞壁上的多糖和鈣、硅和鈉離子存在顯著差異。本實(shí)驗(yàn)室通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，月月竹竹青向光面細(xì)胞壁厚度明顯高于背光面，推測(cè)可能正是竹青變色后，不同顏色竹青糖代謝和陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)差異導(dǎo)致的。Qi等[26]研究發(fā)現(xiàn)，番茄和擬南芥葉片背面與腹面由于極性信號(hào)差異導(dǎo)致細(xì)胞壁的力學(xué)異質(zhì)性，同樣與細(xì)胞壁果膠的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[26]。

3.2 光是誘導(dǎo)竹青變色的主要信號(hào)

秋冬和春季時(shí)，寒竹屬（月月竹、刺黑竹、金佛山方竹、筇竹等）、唐竹屬、懸竹屬、苦竹屬及箭竹屬竹子中都出現(xiàn)同一節(jié)竹稈向陽(yáng)面呈現(xiàn)紫色、背陰面呈綠色的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在雞爪槭、紅葉石楠等植物中亦有發(fā)現(xiàn)。大量研究結(jié)果表明光照導(dǎo)致的植物變色與花青素的合成有關(guān)，Kondo等[27]發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光處理下葡萄花青素含量顯著高于正常處理，而紅光處理下花青素含量低于正常處理。宋哲等[28]研究發(fā)現(xiàn)UVB光源能影響紅富士蘋果的著色。因此本研究認(rèn)為這種現(xiàn)象與光信號(hào)有關(guān)。本研究在組裝的轉(zhuǎn)錄本中共獲得了131個(gè)光信號(hào)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)基因表達(dá)差異分析也發(fā)現(xiàn)同一節(jié)間不同顏色的竹青光信號(hào)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HY5表達(dá)量存在明顯的差異。光不僅為植物體的光合作用提供能量，同時(shí)也作為信號(hào)誘導(dǎo)植物體的形態(tài)建成，調(diào)控植物體的生長(zhǎng)發(fā)育（去黃化、葉綠體發(fā)育、光周期和開花等生理過程），但是光照度過高同樣會(huì)對(duì)植物體造成傷害，誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生一些光保護(hù)物質(zhì)[12-13，29]。光信號(hào)的傳遞首先是被光受體感知，然后通過一些信號(hào)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子將光信號(hào)放大，調(diào)控基因的表達(dá)，使得植物產(chǎn)生應(yīng)激性響應(yīng)，例如產(chǎn)生黃酮類和花青素類抗氧化物質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)的光受體包括感受紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素（PHYA、PHYB等），感受藍(lán)光的隱花色素（CRY）、向光素、ZTL蛋白家族等，感受紫外光的UVB8蛋白等，這些受體感受到光密度、光質(zhì)以及光周期后，通過MYB、PIFs、COPs、SPAs、HY5以及GI蛋白將光信號(hào)進(jìn)行傳遞[7，12，30-31]。本研究組裝獲得的轉(zhuǎn)錄本中有131個(gè)轉(zhuǎn)錄本明顯注釋到光信號(hào)通路中，包括紅光和遠(yuǎn)紅光的受體PHYA、PHYB。

目前研究認(rèn)為溫度亦是影響植物變色的重要環(huán)境因子，原因在于低溫能促進(jìn)葉綠素降解，誘導(dǎo)花色素苷合成，從而使植物葉片在秋季呈現(xiàn)紅色，例如紅楓葉片的變紅和蘋果的變紅。目前的研究發(fā)現(xiàn)光敏色素phyB同時(shí)亦是溫度受體[32]，但是自然界中仍然存在很多植物體在春季就表現(xiàn)出紅色的現(xiàn)象，例如紅葉石楠往往在向陽(yáng)一側(cè)要花紅于背陰一側(cè)，春季櫻花的花托在向光一側(cè)表現(xiàn)出紅色，而背陰一側(cè)并不變紅。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在5 d以上 8 μmol/（s·m2）的藍(lán)光刺激下，種植于25 ℃恒溫氣候室中的月月竹竹稈就會(huì)表現(xiàn)出明顯的紫色，這種現(xiàn)象在壩竹、鵝毛竹等竹種上亦有發(fā)生。但如果使用不含藍(lán)光的光源或者使用橙色透光膜處理月月竹竹稈，即使在-2～4 ℃的環(huán)境下，竹稈也不會(huì)出現(xiàn)變色現(xiàn)象[1]。這說明雖然溫度可以影響竹稈的變色，但是引起竹稈變色的主要因素仍然為光，但光和溫度協(xié)同調(diào)控竹稈變色的機(jī)制目前仍然不清楚。

3.3 激素參與月月竹竹稈中花青素的合成

高等植物中含有豐富的色素[33-37]，這些色素有助于植物光合作用、吸引傳粉者、抵御天敵以及生長(zhǎng)發(fā)育。植物中重要的色素有葉綠素、類胡蘿卜素、花青素和類黃酮等。目前認(rèn)為光照、溫度、糖類以及激素等因子能調(diào)節(jié)液泡pH值，從而影響花青素的合成和植物的呈色。光通過光受體以及光信號(hào)分子誘導(dǎo)植物體顏色的改變。激素通過調(diào)控茉莉酸、脫落酸（ABA）和生長(zhǎng)素的代謝，從而影響花青素的合成[38]。本研究通過基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因被富集到ABA信號(hào)途徑中，因此，月月竹竹稈的變色還可能與ABA信號(hào)有關(guān)，但確切的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步分析。

3.4 光信號(hào)通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青素的合成

竹稈中花青素和類黃酮的合成是受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，參與黃酮類物質(zhì)合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要是2類R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子：一類是能與bHLH和WD40形成MBW復(fù)合體的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子處于花青素合成的下游，調(diào)控花青素和原花青素相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，在擬南芥中主要有PAP1/PAP2、MYB113、GL3/EGL3、TT8和TTG1轉(zhuǎn)錄因子等；另一類為不依賴bHLH和WD40因子的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控黃烷酮合成。例如，玉米中的P1蛋白以及MYB12、MYB111和MYB11。本次組裝獲得的轉(zhuǎn)錄本中共有18個(gè)由35個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中MYB2、MYB20/ODO1、MYB6-like、Myb-related protein308等轉(zhuǎn)錄因子與花青素和原花青素以及苯丙烷代謝上游的莽草酸合成有關(guān)[39-41]。Xiao等[31]研究發(fā)現(xiàn)，光通過HY5蛋白對(duì)黃酮類物質(zhì)的合成進(jìn)行調(diào)控，HY5在BBX家族蛋白輔助作用下，結(jié)合ACEs（含有ACGT的原件），激活 ?CHS、CHI、F3H、F3H、MYB12和PAP1 ?等基因的表達(dá)，且HY5-BBX結(jié)合單元具有比較好的保守性。本研究獲得的轉(zhuǎn)錄本中，有12個(gè)編碼HY5蛋白，其中HY5_PH02Gene29106、HY5_PH02Gene25237在同一節(jié)間的不同部位有明顯的表達(dá)差異。HY5蛋白處于多種光受體的下游，在光信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用[31]，同時(shí)，還在下胚軸生長(zhǎng)抑制、根伸長(zhǎng)、色素合成和積累、各種激素信號(hào)響應(yīng)以及高溫和低溫響應(yīng)等生理過程中發(fā)揮著重要作用[31，41]。

3.5 LncRNA可能參與月月竹竹稈中花青素的積累

LncRNA是一種非編碼蛋白質(zhì)的RNA，具有調(diào)控基因表達(dá)以及催化和穩(wěn)定基因結(jié)構(gòu)的作用。LncRNA通過對(duì)基因啟動(dòng)子、非翻譯區(qū)、外顯子、內(nèi)含子以及終止子等區(qū)域的作用，調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄、剪切以及翻譯，進(jìn)而影響到基因的表達(dá)，調(diào)控植物開花時(shí)間、生殖器官發(fā)育及響應(yīng)生物與非生物脅迫[42-43]。Sun等[44]研究結(jié)果表明隨著藍(lán)光處理時(shí)間的增加，擬南芥下胚軸lncRNA數(shù)量明顯增加；Yang等[45]研究發(fā)現(xiàn)miRNA156a與lncRNA相互作用調(diào)控SPL2like和SPL33轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而調(diào)控蘋果皮花青素的合成。本研究中，CNCI、CPC、PFAM以及PLEK 4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)注釋到的月月竹竹青LncRNA 6 359條，遠(yuǎn)多于毛竹和孝順竹中預(yù)測(cè)的LncRNA數(shù)目[46]，但LncRNA數(shù)量與花青素積累的關(guān)系還有待進(jìn)一步的分析。

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（責(zé)任編輯：石春林）