師若迪，徐 晨，俞 洋

（寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川750004）

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是影響視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的一種進行性疾病，多見于50 歲以上人群，是世界上主要致盲疾病之一，預(yù)計到2040 年，約有2.9 億人受到AMD的影響，其中1.1 億人在亞洲［1］。AMD 是一種多因素疾病，其中光感受器-視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium， RPE ）復(fù)合體退化是導(dǎo)致AMD 發(fā)病的機制之一，而導(dǎo)致其退化的風(fēng)險之一便是日光照射［2］。由于AMD 發(fā)病率高，對視力的嚴重影響，且現(xiàn)階段的治療方法有限，近年來已成為眼科學(xué)研究的熱點。

細胞自噬是一種保守的細胞生存途徑，它可以分解受損的蛋白質(zhì)和細胞器，并維持體內(nèi)的平衡［3］，是細胞生長、分化、存活和自我平衡的重要途徑，有研究表明自噬參與了AMD 發(fā)病機制中所有細胞死亡途徑的調(diào)節(jié)［4］。目前，自噬與視網(wǎng)膜光損傷的關(guān)系尚不明確。為探討光損傷中自噬的變化，本研究采用mTOR 抑制劑雷帕霉素預(yù)處理人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19），觀察光照對ARPE-19 細胞的影響，對光損傷中RPE 細胞自噬的變化進行研究，探討雷帕霉素對光誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜色素上皮細胞自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株

原 代ARPE-19，購 買 于BNCC（BNCC3377 13）。將ARPE-19 細胞放入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d 換液1 次，細胞生長密度到90%時消化細胞，以1∶3 進行傳代，選取3～5 代細胞進行實驗。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清、DMEM/F12（美國Gibco 公司）；mRFP-eGFP-LC3 雙熒光質(zhì)粒（生工生物工程上海股份有限公司）；MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)，C0009S）Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，BB-4101）；BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，P0100、89900）、；Rapamycin（MCE，HY-10219）；Mouse Anti-LC3A antibody、LC3B antibody、Beclin 1 antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bsm-33309M、bs-4843R、bsm - 33323M）； SQSTM1/p62 Antibody（Affinity 公司，AF5384）山羊抗兔lgG、山羊抗小鼠lgG（中杉金橋，ZB-2301、ZB-2305）。TES-1332A數(shù)位式照度計（臺北泰仕電子工業(yè)）：奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡（FV3000，日本Olympus 公司）；透射電子顯微鏡（JEM-1400Flash，日本電子）；凝膠成像分析儀（Gel DocXR）（美國 BIORAD 公司）。

1.3 細胞分組

穩(wěn)定表達mRFP-eGFP-LC3 的ARPE-19 細胞隨機分為6 h 對照組、6 h 模型組、6 h 雷帕霉素組；12 h 對 照 組、12 h 模 型 組、12 h 雷 帕 霉 素 組 以 及24 h對照組、24 h 模型組、24 h 雷帕霉素組。對照組避光培養(yǎng)，用錫紙包裹；模型組進行光照刺激，雷帕霉素組中加入10 μmol/L 雷帕霉素（查閱文獻結(jié)合預(yù)實驗反復(fù)篩選比較后確定的濃度）后接受光照刺激。

1.4 穩(wěn)定表達 mRFP-eGFP-LC3 的ARPE-19 細胞株構(gòu)建

取對數(shù)生長期ARPE-19 細胞，以2×105個/孔細胞數(shù)接種于12 孔板，放于培養(yǎng)箱過夜，第2 天細胞數(shù)約50%后將表達mRFP-eGFP-LC3 慢病毒質(zhì)粒加入ARPE-19 細胞中，24 h 后用新鮮的培養(yǎng)基代替含有病毒的培養(yǎng)基。經(jīng)由嘌呤霉素（0.5 μg/mL）篩選，直到鑒定出耐受穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。饑餓處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，使用激光共聚焦顯微鏡觀察 mRFPeGFP-LC3 斑點，觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.5 構(gòu)建ARPE-19 細胞光損傷模型

選生長狀態(tài)良好的3～5 代ARPE-19 細胞培養(yǎng)在6 孔板中，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)進行光照，防止自然光干擾。將LED 冷光燈懸掛于培養(yǎng)箱頂部，調(diào)整細胞光照強度在（16 500±500） lx 范圍內(nèi)， 垂直照射細胞6、12、24 h。光照時孔板表面的溫度控制在36.5～37.5 ℃之間，以此排除由于溫度升高而造成細胞光熱損傷的可能［5］。

1.6 MTT 檢測光照對ARPE-19 細胞增殖活性

MTT 分組：對照組、模型組、雷帕霉素組。取穩(wěn)轉(zhuǎn)后的ARPE-19 細胞，經(jīng)含EDTA 胰酶消化后按每孔6 000 個細胞鋪于96 孔板，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后分組處理，每組設(shè)3 個復(fù)孔。各組于光照結(jié)束后每孔加10 μL MTT 溶液，在培養(yǎng)箱孵育4 h 取出吸出上清，每孔加100 μL Formazan溶解液，放培養(yǎng)箱孵育3 h，使用酶標儀在570 nm 測定OD 值。實驗重復(fù)3 次。

1.7 觀察雙熒光mRFP-eGFP-LC3 體系測定ARPE-19 細胞自噬流變化

將穩(wěn)轉(zhuǎn)成功的ARPE-19 細胞系放在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清和1%雙抗（100 U/ mL 青 霉 素 和100 μg/mL 鏈 霉 素）高 糖DMEM 培養(yǎng)48 h（密度80%），按照1∶3 比例傳代。各組于光照處理后使用激光掃描共聚焦顯微鏡通過觀察一個視野下所有細胞中紅色和黃色LC3 亮點變化來判斷自噬流的變化。

1.8 透射電鏡觀察各組ARPE-19 細胞自噬囊泡形成

吸出各組ARPE-19 細胞中培養(yǎng)基，冷PBS 洗2遍后收集細胞，1 200 r/min離心5 min棄上清，向管中加入2.5%戊二醛500 μL 固定，室溫1 h，4 ℃放3 h，加入PBS 漂洗3 次，于4 ℃冰箱30 min。加1%鋨酸固定1 h，PBS 清洗2 次，梯度乙醇脫水；使用環(huán)氧樹脂包埋處理后的樣品，超薄切片機切片，經(jīng)鉛鹽和醋酸鈾染色后于透射電子顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測Beclin l、LC3、P62 蛋白表達情況

各組于光照結(jié)束后收集細胞，使用細胞裂解液提取全蛋白，BCA 法進行蛋白定量。以每孔50 μg蛋白為標準上樣，隨后進行SDS-PAGE 電泳，用PVDF 轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后與Beclin 1、LC3A/LC3B、P62（1∶1 000）一抗在4 ℃封閉過夜，第二天用TBST 洗滌3 次，每次10 min，隨后加入HRP 標記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG 二抗（1∶1 000），暗室中加ECL 發(fā)光液并曝光。采用Image-J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。實驗重復(fù)3 次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，計量資料用（±s）表示。多個樣本均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q 法檢驗；顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 自噬雙標慢病毒（mRFP-eGFP-LC3）轉(zhuǎn)染效率的檢測

mRFP-eGFP-LC3 慢病毒質(zhì)粒在與ARPE-19細胞共孵育48 h 后可觀察到被熒光標記的mRFPeGFP-LC3 的表達水平最高。因此，后續(xù)相關(guān)分組實驗將以此為標準進行。圖1 中暗場顯示轉(zhuǎn)染mRFP-eGFP-LC3 后用熒光顯微鏡觀察到的帶有紅色和綠色熒光蛋白的ARPE-19 細胞。明視場顯示通過透射光學(xué)顯微鏡下觀察到的總細胞。經(jīng)觀察轉(zhuǎn)染效率約80%以上，可以用于下一步的相關(guān)實驗。見圖1。

圖1 自噬雙標慢病毒（mRFP-eGFP-LC3）轉(zhuǎn)染效率的檢測結(jié)果（×200）Fig 1 Transfection efficiency of autophagy double-labeled lentivirus（mRFP-eGFP-LC3） （×200）

2.2 光照對各組ARPE-19 細胞存活率

與對照組對比，模型組經(jīng)光照6、12、24 h 后，細胞存活率顯著下降（P＜0.001）；雷帕霉素組經(jīng)光照后細胞存活率高于模型組（光照6 h，P＜0.05；光照12、24 h，P＜0.001）。見表1。

表1 光照對各組ARPE-19 細胞存活率［%，n=3，（±s）］Tab 1 Effect of light on the survival rate of ARPE-19 cells in each group ［%，n=3，（±s）］

表1 光照對各組ARPE-19 細胞存活率［%，n=3，（±s）］Tab 1 Effect of light on the survival rate of ARPE-19 cells in each group ［%，n=3，（±s）］

注：與對照組比，*P＜0.001；與模型組比，#P＜0.001；與模型組比，&P＜0.05。

24 h 100.00±1.67 41.67±1.23*59.24±2.27#849.306＜0.001組別對照組模型組雷帕霉素組FP 6 h 100.00±2.06 80.02±2.08*86.73±2.36&65.595＜0.001 12 h 100.00±1.58 62.44±2.20*74.63±1.80#310.353＜0.001

2.3 光誘導(dǎo)下ARPE-19 細胞自噬流的變化

如圖2 所示，圖中6、12、24 h 對照組紅色熒光斑點弱，且少見自噬小體（黃色斑點）；模型組分別光照6、12、24 h 后，紅色熒光斑點較對照組逐漸增多，綠色熒光斑點也隨之增加，Merge 圖中從光照12 h開始黃色斑點數(shù)量增多明顯，顯示隨著光照時間的延長，ARPE-19 細胞的自噬流有所增強，但逐漸受阻。而雷帕霉素組在光照6、12、24 h 時紅色熒光斑點較模型組加強，綠色熒光較模型組弱，說明雷帕霉素組細胞自噬流增強且通暢。

圖2 光誘導(dǎo)下ARPE-19 自噬流變化（×400）Fig 2 Changes of autophagic flow in ARPE-19 induced by light（×400）

2.4 透射電鏡觀察細胞自噬囊泡形成

透射電鏡觀察光照24 h 后的各組ARPE-19 細胞，可見對照組中少見自噬囊泡，模型組較對照組自噬囊泡增多，且有空泡形成，細胞核有皺縮，雷帕霉素組細胞內(nèi)見大量聚集分布的自噬囊泡。見圖3。

圖3 各組ARPE-19 細胞超微結(jié)構(gòu)（×15 000；標尺：2 μm）Fig 3 Ultrastructure of ARPE-19 cells in each group（×15 000；scale bar：2 μm）

2.5 雷帕霉素干預(yù)對光誘導(dǎo)ARPE-19 細胞Beclin1、LC3、P62 蛋白表達的影響

經(jīng)光照6、12、24 h 后，與對照組比較，模型組和雷帕霉素組的Beclin 1 蛋白表達水平升高（P＜0.001）、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的 比 值 升 高（P＜0.001），P62 蛋白低表達（P＜0.001）。與模型組比，雷帕霉素組在光照6 h 時Beclin 1 蛋白表達量差異不明顯、在12、24 h 時Beclin 1 蛋白表達量逐漸升高（P＜0.001）；LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值較模型組均升高（6、24 hP＜0.05；12 hP＜0.001）；P62 蛋白表達量比模型組低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 雷帕霉素對光誘導(dǎo)ARPE-19 細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響Fig 4 Effect of rapamycin on the expression of autophagy-related proteins induced by light in ARPE-19 cells

3 討論

視網(wǎng)膜是位于眼球后壁內(nèi)側(cè)的透明中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，由色素上皮層和視網(wǎng)膜感覺層組成，對視力至關(guān)重要［6］。光在視覺過程中起著重要作用，但過度暴露在光下會對視網(wǎng)膜色素上皮層和感光細胞造成不同程度的損害［7］，臨床上可表現(xiàn)為視力下降或視力缺失。視力缺陷對生活質(zhì)量有很大的負面影響，研究表明，視網(wǎng)膜色素上皮細胞過度暴露于可見光可促進脂褐素的自發(fā)熒光色素的積累，而脂褐素是視網(wǎng)膜色素上皮細胞吞噬構(gòu)成感光細胞外節(jié)的脂類并積聚在溶酶體中的副產(chǎn)物，自身熒光脂褐素的過量積聚可能預(yù)示著細胞的老化，并增加視網(wǎng)膜退行性疾病發(fā)生的風(fēng)險［8］。

AMD 是一種影響黃斑區(qū)的復(fù)雜眼病，黃斑區(qū)是視力敏感區(qū)，負責視覺和色覺。在AMD 中可發(fā)現(xiàn)絨毛膜、布魯氏膜、RPE 和光感受器發(fā)生病理變化。其中RPE 在 AMD 的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，因為其位于布魯氏膜和光感受器之間的中心位置，是視網(wǎng)膜外層和絨毛膜之間運輸氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和廢物的通道［9］。隨著疾病的進展，視網(wǎng)膜色素上皮細胞的變性和功能障礙會導(dǎo)致光感受器的進行性丟失，最終可能導(dǎo)致永久性失明［10］。視網(wǎng)膜色素上皮被認為是最早在人類AMD 中受到影響的細胞之一［11］。自噬是將細胞質(zhì)成分運輸和溶解到溶酶體中的過程，其與年齡相關(guān)的功能障礙可能導(dǎo)致AMD［12］。自噬對細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其在應(yīng)對各種應(yīng)激源時會迅速上調(diào)，比如饑餓、細胞器或DNA 損傷、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或感染［13］。有研究表明，自噬參與了許多與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程，揭示自噬在這些疾病中的參與至關(guān)重要［14］。為檢測光照下ARPE-19 細胞自噬的發(fā)生情況，使用串聯(lián)mRFP-eGFP-LC3 雙熒光自噬指示體系進行檢測，對LC3 進行標記及追蹤并觀察自噬流的變化，LC3 雙熒光體系最大的優(yōu)點是可以直觀地判斷細胞自噬流的變化［15］。在未發(fā)生自噬的細胞中，LC3 散在分布細胞質(zhì)中，當自噬發(fā)生時，LC3 集中富集在自噬小體上，自噬小體需要和溶酶體融合才會具有自噬功能，但溶酶體為酸性的，所以eGFP 綠色熒光在酸性環(huán)境下可以發(fā)生淬滅，而紅色的RFP 熒光不會受到影響，因此自噬溶酶體會呈現(xiàn)紅色斑點，而沒有與溶酶體融合的自噬小體則呈現(xiàn)黃色斑點［16］。由此，采用雙熒光體系可以直觀且定性的判斷細胞內(nèi)自噬流的改變。本研究通過共聚焦熒光顯微鏡觀察不同時間的光誘導(dǎo)下ARPE-19 細胞自噬流的變化，結(jié)果顯示，光照射能夠誘導(dǎo)ARPE-19細胞發(fā)生自噬，且雷帕霉素會上調(diào)自噬活性。

除了通過雙熒光體系觀察自噬流的變化，選取自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3 以及P62 進行定量檢測。Beclin 1 是自噬過程中的關(guān)鍵步驟，也是自噬的正調(diào)控因子［17］。LC3 是自噬體形成的特異性標志物，在自噬過程中，自噬泡的形成會導(dǎo)致LC3Ⅰ通過脂質(zhì)化轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可以估計自噬的功能狀態(tài)［18］。目前免疫印跡檢測LC3 已成為監(jiān)測自噬和自噬相關(guān)過程的可靠方法［19］。P62 是另一種廣泛使用的自噬標記，它通過一個短的LC3 相互作用區(qū)（LIR）直接與LC3 和Atg8 直系物家族蛋白結(jié)合。通過這種機制，使得其通過自噬提供選擇性的自噬貨物進行降解。當自噬受到抑制時，p62 積聚，而當自噬被誘導(dǎo)時，p62 數(shù)量 減 少［20］。本 研 究Western Blot 結(jié) 果 顯 示，光 照6 h、12 h 和24 h 后，與對照組對比，模型組自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達量均增高，P62 蛋白呈低表達。表明模型組在光誘導(dǎo)下自噬被激活。

Rapamycin 是一種來源于潮霉素鏈霉菌的親脂性抗生素，是一種眾所周知的通過抑制mTOR 作用的自噬特異性誘導(dǎo)劑。它存在于兩種不同的功能復(fù)合體中：mTOR 復(fù)合體1（mTORC1）和mTOR 復(fù)合體2（mTORC2），這兩種復(fù)合體對雷帕霉素的敏感度是有區(qū)別的，mTORC1 對雷帕霉素有高度敏感性，并能調(diào)節(jié)自噬［21］。自噬參與了AMD 的發(fā)病機制，AMD 的發(fā)生可因受損細胞器無法清除而促進疾病的進展。由此，上調(diào)自噬可能為減緩或阻止AMD 進展提供一種可選擇的治療策略［22］。近些年，雷帕霉素被發(fā)現(xiàn)在抗衰老、治療心臟病、中樞神經(jīng)、免疫系統(tǒng)等方面有一定的作用［23］。Gao 等［24］發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過調(diào)節(jié)mTOR 和ER 應(yīng)激通路之間的串擾，減少慢性心衰時心肌細胞的凋亡，促進心肌細胞的自噬。Sun 等［25］發(fā)現(xiàn)雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬可以改善谷胱甘肽耗竭誘導(dǎo)的RPE 細胞的早衰。本研究采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對人RPE 細胞進行處理，使用透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)經(jīng)雷帕霉素處理的細胞可見大量聚集分布的自噬囊泡；此外通過蛋白免疫印跡法檢測自噬通量，發(fā)現(xiàn)使用雷帕霉素干預(yù)后，與對照組相比，雷帕霉素組的Beclin1 與LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均增加，P62 蛋白表達量均減少；與模型組相比，雷帕霉素組在光照6 h 時Beclin 1 蛋白表達量差異不明顯、在12 h、24 h 時Beclin 1 蛋白表達量逐漸升高；LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值較模型組均升高。這說明，雷帕霉素干預(yù)激活了光誘導(dǎo)下的ARPE-19 細胞自噬通量，并上調(diào)自噬活性。

綜上，本實驗通過觀察視網(wǎng)膜色素上皮細胞在光損傷中的自噬變化，探討了雷帕霉素對光誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜色素上皮細胞自噬的影響，目的是為了預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)生、降低患該病的風(fēng)險以及為開發(fā)天然藥物來治療AMD 提供新的研發(fā)思路。本研究不足之處是只觀察了人視網(wǎng)膜色素上皮細胞在光誘導(dǎo)下自噬及其動態(tài)性情況，同時進一步驗證了雷帕霉素促進自噬的特性，但自噬與細胞損傷之間的關(guān)系尚未涉及，需要接下來進一步研究和驗證。

作者貢獻度說明：

師若迪：實施研究，論文撰寫，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；徐晨：數(shù)據(jù)整理，論文審校；俞洋：課題設(shè)計，論文指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。