李冰 馮秀 朱仁 隋曉云 賈銀濤 陳毅峰

摘要：建立快速和準確的環(huán)境DNA（eDNA）檢測方法，可為魚類的長期監(jiān)測提供便利，為魚類資源保護和管理提供技術(shù)支撐。2019年在雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地采集了20種魚和水樣，針對拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）設(shè)計Cytb基因的特異性引物和探針，利用微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）檢測水樣中eDNA拷貝數(shù)，并分析其與生物量和豐度之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，正反向引物及探針序列與其他19種魚之間的平均錯配堿基數(shù)分別為6.8、6.9和3.6，且對其基因組DNA進行ddPCR擴增沒有熒光信號。通過對比ddPCR和網(wǎng)捕2種方法，70%樣點中檢測結(jié)果相同，剩余30%樣點都是網(wǎng)捕未捕獲但ddPCR檢出的情況。在拉魯濕地和雅魯藏布江干流的樣點中，水樣eDNA拷貝數(shù)與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均具有顯著的相關(guān)性，拉魯濕地水樣eDNA與二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.987和0.647，雅魯藏布江水樣eDNA與二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.786和0.756，表明eDNA技術(shù)是魚類分布和生物量監(jiān)測的有效方法。eDNA檢測易受到近緣物種和水體理化性質(zhì)的影響。

關(guān)鍵詞：環(huán)境DNA；微滴式數(shù)字PCR；拉薩裸裂尻魚；物種檢測；雅魯藏布江中游

中圖分類號：Q503? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2024）02-0084-08

環(huán)境DNA（eDNA）指從空氣、水、土壤、排泄物、沉積物等環(huán)境樣品中提取的DNA（Bohmann et al，2014）。環(huán)境DNA技術(shù)通過對eDNA進行定性和定量分析，進而獲得eDNA中的生物多樣性信息，已逐漸發(fā)展成為魚類多樣性監(jiān)測的新方法（徐念和常劍波，2016；吳昀晟等，2019；王夢等，2022）。與傳統(tǒng)方法相比，環(huán)境DNA技術(shù)具有靈敏度高、省時省力、環(huán)境友好、對調(diào)查對象無損傷、不依賴于分類學專家等優(yōu)點（邢迎春等，2022）。魚類的eDNA監(jiān)測主要有2個方面，即通過高通量測序和eDNA宏條形碼（eDNA metabarcoding）對多物種進行檢測，及通過定量PCR對特定物種進行檢測（高天翔等，2018）。高通量測序和eDNA宏條形碼雖然能同時檢測多物種，但由于擴增引物及測序過程的偏差，對單一物種豐度的評估不理想（Balasingham et al，2018）；而定量PCR使用物種特異引物，可對單一目標物種的存在和生物量進行檢測（Doi et al，2015）。

常用的定量PCR包括實時熒光定量PCR（qPCR）和微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）等，在魚類eDNA研究中均有應(yīng)用（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；Brys et al，2021；Wang et al，2021）。qPCR技術(shù)雖具有快速、簡單、經(jīng)濟等特點，可用于分析eDNA中目標物種的相對豐度，但需要制作標準曲線，且在目的序列含量低或含有大量其他序列的情況下靈敏度和精確度會受限制（王芮等，2021）；而ddPCR可在沒有參考曲線的情況下提供目標物種DNA的絕對定量，在魚類生物量調(diào)查中更具有優(yōu)勢（Doi et al，2015）。ddPCR是一種定量分析核酸的技術(shù)，通過把反應(yīng)體系分散到10 000～20 000個微滴中，再由PCR擴增和陽性信號讀取，計算得出樣本中DNA最初拷貝數(shù)，從而實現(xiàn)對DNA的絕對定量（Hindson et al，2011）。研究表明，與qPCR相比，ddPCR的誤差更小，且更適用于低濃度下的eDNA檢測（Rusch et al，2018）。

拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）裂腹魚亞科（Schizothoracinae）裸裂尻魚屬（Schizopygopsis）（陳毅峰和曹文宣，2000），自然分布于雅魯藏布江中上游干支流水體中，是我國特有的高原性魚類，也是西藏地區(qū)主要經(jīng)濟魚類之一，對研究生物地理學、系統(tǒng)演化和營養(yǎng)生理等方面具有極為重要的科學參考價值（He & Chen，2007；Liang et al，2017; 曾本和等，2019）。隨著近幾十年來西藏經(jīng)濟的快速發(fā)展，水利設(shè)施建設(shè)、外來物種入侵及環(huán)境污染等導(dǎo)致拉薩裸裂尻魚資源出現(xiàn)急劇下降的趨勢（楊漢運等，2010；朱挺兵等，2017），拉薩裸裂尻魚已被列入中國脊椎動物紅色名錄（蔣志剛等，2016）。此外，拉薩裸裂尻魚由于生長緩慢、性成熟晚、繁殖力低等特點，其資源一旦遭到破壞，將很難得到恢復(fù)（邵儉等，2019）。因此，建立快速、便捷、準確的eDNA檢測方法，對拉薩裸裂尻魚資源狀況進行長期監(jiān)測，可為其資源保護和管理提供科學依據(jù)。本研究在雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地采集魚類和水樣，針對拉薩裸裂尻魚，設(shè)計物種特異的Cytb引物和探針，評估其擴增效果，利用ddPCR檢測水樣中eDNA拷貝數(shù)，并分析其與物種生物量與豐度之間的相關(guān)性。

1? ?材料與方法

1.1? ?樣品采集

2019年在雅魯藏布江中游干流（YJ1～YJ8）、拉魯濕地（LL1～LL10）和茶巴朗濕地（CBL1～CBL5）設(shè)置23個樣點（圖1）開展樣本采集工作。使用地籠（開口40 cm×30 cm，長8 m）經(jīng)10～12 h起捕采集2個濕地的魚類樣本；對于雅魯藏布江的樣點，除了使用地籠之外，還使用三層流刺網(wǎng)（網(wǎng)目2～8 cm，高1.5 m，長20 m）作業(yè)0.5 h采集魚類樣本。統(tǒng)計拉薩裸裂尻魚的個體數(shù)量和體重，剪取部分個體的一小塊鰭條組織保存在無水乙醇中。用采水器采取上、中、下層混合水樣共1 L，在4 h內(nèi)用真空抽濾泵和混合纖維濾膜（直徑47 mm，孔徑0.45 μm）對水樣進行抽濾。每個樣點采集3個平行水樣，并設(shè)置1個陰性對照。濾膜立即放入2 mL無酶無菌離心管，并置于液氮中保存，直至放入實驗室的超低溫（-80℃）冰箱。每次采集水樣和抽濾之后，利用10%的商用漂白液對采集和抽濾工具進行消毒，并用純凈水沖洗干凈。

1.2? ?eDNA提取

每次實驗前用DNA-off試劑（Takara公司）對實驗用具和實驗桌面進行浸泡和擦拭，3 min后用清水沖洗或濕紙巾擦拭干凈。用DNeasy Blood & Tissue Kits試劑盒（Qiagen公司）提取水樣DNA，實驗步驟按說明書進行。水樣DNA最終用200 μL TE溶液稀釋，并于-20℃條件下保存。

1.3? ?引物和探針設(shè)計

在魚類eDNA研究經(jīng)常使用的線粒體分子標記中，選擇進化速度較快的Cytb基因序列（Zardoya & Meyer，1996）作為分子標記，采用通用引物（F： GRCTTGAARAACCACCGTTGT; R： CGGWTTACAAGACCGRYGCT）（Feng et al，2023）經(jīng)DNA測序獲得漁具捕撈得到的20種魚Cytb基因序列。為了擴大引物和探針的應(yīng)用范圍，將分布于雅魯藏布江流域上游或湖泊的尖裸鯉（Oxygymnocypris stewartii）、高原裸鯉（Gymnocypris waddelli）、蘭格湖裸鯉（Gymnocypris chui）和軟刺裸鯉（Gymnocypris dobula）（陳毅峰和曹文宣，2000；朱挺兵等，2017；劉明典等，2020）等4種魚對eDNA檢測的影響也考慮在內(nèi)，從NCBI數(shù)據(jù)庫中提取它們的Cytb基因序列。利用MEGA軟件的ClustalW功能（Thompson et al，1994；Tamura et al，2013）對上述24種魚的Cytb基因序列進行線性排列，利用Primer5軟件根據(jù)以下原則設(shè)計檢測拉薩裸裂尻魚的引物和探針：（1）正反向引物序列與其他23種魚相比至少具有2個堿基的差異；（2）正反向引物及探針序列在種內(nèi)保守，沒有變異；（3）擴增長度為100～200 bp；（4）其他參照常規(guī)引物和探針的設(shè)計規(guī)則（Rozen & Skaletsky，2000）。

1.4? ?引物擴增效果評估

將拉薩裸裂尻魚的基因組DNA稀釋至1 ng/μL作為模板進行ddPCR，設(shè)置53～59℃的退火溫度梯度，用于篩選最佳擴增溫度。反應(yīng)體系包含2 μL DNA 模板，250 nmol/L上下游引物和150 nmol/L探針，10 μL 2× ddPCR Supermix for Probes（不含 dUTP），并用超純水將反應(yīng)體系補至20 μL。用微滴生成卡將20 μL反應(yīng)體系與70 μL微滴生成油（Droplet Generator Oil for Probes）在微滴生成儀中生成微滴。PCR擴增反應(yīng)在密封的96孔板內(nèi)進行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，退火1 min，40個循環(huán)；98℃保持10 min；4℃保持至拿出。擴增結(jié)束后放入微滴讀取儀中，用QuantaSoft軟件讀取結(jié)果。

將拉薩裸裂尻魚基因組DNA進行梯度稀釋，稀釋至10、1、0.1、0.01和0.001 ng/μL作為模板進行ddPCR實驗，檢測ddPCR的擴增效率及可檢出的濃度范圍。將捕撈得到的20種魚以及從羊卓雍措采集的高原裸鯉基因組DNA分別稀釋到1 ng/μL作為模板進行ddPCR，檢測ddPCR擴增的物種特異性。

1.5? ?eDNA的ddPCR擴增及數(shù)據(jù)處理

對每個eDNA樣品進行ddPCR擴增，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。用QuantaSoft 軟件讀取檢測結(jié)果，即ddPCR反應(yīng)體系中目標DNA拷貝數(shù)（copies/μL），根據(jù)水樣體積和eDNA的稀釋體積計算每個水樣中拉薩裸裂尻魚Cytb基因片段的拷貝數(shù)，計算公式為：

式中：x為ddPCR反應(yīng)體系中目標DNA拷貝數(shù)（copies/μL），y為水樣中目標DNA拷貝數(shù)（copies/mL）。利用SPSS軟件分析水樣中eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間的相關(guān)性。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?引物和探針

根據(jù)種間特異性高、種內(nèi)保守、擴增子長度適合的原則，在Cytb基因的編碼區(qū)914～935 bp和1 067～1 090 bp分別設(shè)計了正反向引物（SyCytb-F/R），在編碼區(qū)942～964 bp設(shè)計了探針（SyCytb-P）。引物和探針序列為：SyCytb-F，5-CTCTGCTCCATACCTCCAAGCT-3；SyCytb-R， 5-TGAGAAACAGTGCAAAGTACAGGG-3；SyCytb-P，5-FAM-ACTAACATTCCGCCCAATCACCC-MGB-3。正向引物、反向引物和探針序列與拉薩裸裂尻魚之間沒有錯配堿基，與尖裸鯉及3種裸鯉（高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉）之間的平均錯配堿基數(shù)分別為2.2、1.3和1.0個，與其他19種魚之間的平均錯配堿基數(shù)分別為6.8、6.9和3.6個（圖2）。

2.2? ?擴增效果

溫度梯度實驗結(jié)果顯示，在退火溫度的梯度范圍內(nèi)，ddPCR都檢測到有效DNA拷貝數(shù)，其中，在56℃時拷貝數(shù)達到峰值，因此，將56℃作為ddPCR的最佳退火溫度。濃度梯度實驗結(jié)果顯示，在拉薩裸裂尻魚基因組DNA濃度為0.001～1 ng/μL時均可獲得有效DNA拷貝數(shù)，當模板DNA濃度為10 ng/μL時，陽性微滴數(shù)遠大于陰性微滴數(shù)，檢測結(jié)果顯示無信號（圖3-a）。DNA拷貝數(shù)與DNA濃度之間擬合標準曲線的R2為0.998。物種特異性檢測結(jié)果顯示，引物和探針具有物種特異性，僅在拉薩裸裂尻魚和高原裸鯉中獲得熒光信號，在其他19種魚中均未檢出（圖3-b）。因此，當水體中存在尖裸鯉或3種裸鯉時，都可能影響拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測結(jié)果，說明本研究的探針和引物不適用于雅魯藏布江流域的湖泊或上游等有其他近緣種（裸鯉屬和裸裂尻魚屬）分布的水體。

2.3? ?eDNA的ddPCR檢測

在陰性對照中，均未檢測出熒光信號。共在14個樣點中檢測出拉薩裸裂尻魚的eDNA，其中，在茶巴朗濕地、拉魯濕地和雅魯藏布江干流中檢測出的樣點數(shù)分別為4、4和6個（表1）。在茶巴朗濕地、拉魯濕地和雅魯藏布江干流樣點中檢測出拉薩裸裂尻魚eDNA的拷貝數(shù)分別為2.4～6.3、1.9～319.3和1.6～2.3 copies/mL。

2.4? ?eDNA檢測與捕撈結(jié)果的比較

將ddPCR檢測與捕撈結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示，70%樣點ddPCR檢測結(jié)果與捕撈結(jié)果相同，30%樣點中未捕獲但ddPCR檢出，沒有樣點捕獲到但ddPCR未檢出的情況（圖4）。其中，在拉魯濕地各樣點中的檢測結(jié)果均相同；在大部分茶巴朗濕地樣點（4/5）及部分雅魯藏布江樣點（3/8）中未捕獲但ddPCR檢出。

總體上，eDNA拷貝數(shù)（copies/mL）與物種生物量（g）和豐度（尾）之間均無顯著相關(guān)性（表2）。但是，單獨對拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點進行分析，eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間均存在顯著相關(guān)性。

在拉魯濕地樣點中，eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.987（P<0.01）和0.647（P<0.05），擬合線性方程分別為：

式中：y1、y2和x分別為物種生物量和豐度及eDNA拷貝數(shù)。

在雅魯藏布江的樣點中，eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.786和0.756（P<0.05），擬合線性方程分別為：

拉魯濕地樣點的單位質(zhì)量的eDNA拷貝數(shù)[copies/（mL·g）]和單位個體的eDNA拷貝數(shù)[copies/（mL·個）]顯著大于雅魯藏布江的樣點。

3? ?討論

對于單一目標物種的eDNA檢測，需要種間特異性高、種內(nèi)通用性強的擴增引物，否則極易出現(xiàn)假陽性或者假陰性的錯誤結(jié)果（高天翔等，2018）。本研究中，拉薩裸裂尻魚的ddPCR引物序列與其他物種之間具有較多的錯配堿基數(shù)量，且在其他物種中的擴增沒有熒光信號，但尖裸鯉及3種裸鯉除外，它們的存在會影響拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測。我們對拉薩裸裂尻魚與其他23種魚的線粒體基因組DNA序列進行了比較，發(fā)現(xiàn)拉薩裸裂尻魚與尖裸鯉、高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉分別僅有1 240、1 241、1 239和91個差異堿基，而與其他19種魚的差異堿基數(shù)為1 551～4 640個（圖5）。基于線粒體DNA及基因組SNP標記的分析表明，裸鯉屬（Gymnocypris）和裸裂尻魚屬（Schizopygopsis）的物種在系統(tǒng)進化關(guān)系上不以屬名而以水域形成聚類分支（Tang et al，2019）；DNA條形碼的研究結(jié)果也表明，裸鯉屬和裸裂尻魚屬的部分物種共享操作分類單元（OTUs）（Shen et al，2019）。因此，裸鯉屬或裸裂尻魚屬內(nèi)單一物種的eDNA檢測不可避免地受到裸鯉屬和裸裂尻魚屬其他魚類的影響。但是，對于本研究的樣點區(qū)域，拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測結(jié)果不受尖裸鯉或其他裸鯉的影響。首先，在所有樣點區(qū)域未采集到這些魚類樣本；其次，近期的調(diào)查研究表明，尖裸鯉僅在雅魯藏布江仁布以上江段出現(xiàn)（朱挺兵等，2017；劉明典等，2020），且高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉主要分布于湖泊水體中?？傊谑褂帽狙芯康膁dPCR引物對自然水體的拉薩裸裂尻魚進行分子檢測時，需要考慮尖裸鯉屬、裸鯉屬或裸裂尻魚屬其他魚類的影響。

大量研究表明，與網(wǎng)捕相比，eDNA技術(shù)在物種檢測方面具有明顯的優(yōu)勢（Czeglédi et al，2021）。在本研究中，與網(wǎng)捕相比，基于eDNA的物種檢測同樣有優(yōu)勢，2種方法在70%樣點中的檢測結(jié)果相同；在剩余30%樣點中，均是網(wǎng)捕未捕獲但eDNA檢出的情況，主要體現(xiàn)在茶巴朗濕地和雅魯藏布江的樣點。茶巴朗濕地位于拉薩河附近，雖然水源來源于拉薩河（連接拉薩河的水渠長4 km），但是采樣時未見水渠中有水，在茶巴朗濕地檢測的拉薩裸裂尻魚eDNA來源于拉薩河的可能性較小。茶巴朗濕地是西藏主要土著魚類（包括拉薩裸裂尻魚）的養(yǎng)殖繁育基地，而水樣采于非養(yǎng)殖用途的淺水池塘。在茶巴朗濕地樣點中未捕獲拉薩裸裂尻魚但水樣中檢出其eDNA，說明有2種可能：（1）樣點水體中確實有拉薩裸裂尻魚個體，但由于個體小等原因未能捕獲；（2）樣點水體中沒有拉薩裸裂尻魚個體，目標eDNA來源于臨近養(yǎng)殖池塘的個體。拉薩裸裂尻魚在雅魯藏布江中游干流中分布廣泛（朱挺兵等，2017），通過eDNA幾乎在所有樣點中檢測出其存在，但通過網(wǎng)捕僅在部分樣點采集到其個體，說明eDNA具有更高的檢出率。

大量研究表明，在實驗室條件下，物種的eDNA拷貝數(shù)與生物量或豐度之間具有顯著的相關(guān)性（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；閆卉果等，2022），但在自然水體中的研究較少。本研究中，總體上，水樣中eDNA拷貝數(shù)與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均無顯著相關(guān)性；但是，單獨對拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點進行分析，均存在顯著的相關(guān)性。研究表明，eDNA檢測易受水體理化性質(zhì)影響，如溫度、pH、溶解氧、礦化度、水流速度和微生物等（Jane et al，2015；Eichmiller et al，2016；Jo et al，2019）。拉魯濕地和雅魯藏布江樣點的水體在水流速度、溫度[（13.11±1.40）℃ vs（11.48±1.56）℃， P<0.05]、溶解氧[（6.87± 0.8）mg/L vs （7.72±0.29）mg/L， P<0.05]和pH[（9.00±0.53）vs（7.75±0.11）， P<0.01]等方面具有明顯的差異，導(dǎo)致不同水體中拉薩裸裂尻魚eDNA的脫落和降解速度及停留時間都可能存在顯著差異，因此，不能通過eDNA來比較這2個水體中拉薩裸裂尻魚的生物量和豐度。與雅魯藏布江中游干流相比，拉魯濕地的水體流速較緩且各樣點水體理化性質(zhì)差異較小，這可能是拉魯濕地樣點eDNA拷貝數(shù)與生物量之間的相關(guān)系數(shù)更大，且單位質(zhì)量eDNA拷貝數(shù)更大的主要原因。

4? ?結(jié)論

本研究設(shè)計了檢測拉薩裸裂尻魚的eDNA特異性高、時效性好、擴增效率高的引物和探針，并利用ddPCR對雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地的水體進行了拉薩裸裂尻魚的檢測。與網(wǎng)捕相比，eDNA技術(shù)在物種檢測方面具有更高的檢出率。在拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點中，水樣中eDNA拷貝數(shù)與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均具有顯著的相關(guān)性。表明eDNA技術(shù)是魚類分布和生物量監(jiān)測的有效方法。但是，eDNA檢測結(jié)果易受到近緣物種和水體理化性質(zhì)的影響，是其不足之處。

志謝：感謝中國科學院水生生物研究所分析測試中心的喬志仙、柴小翠及周園園在實驗中提供的幫助，感謝熊雄副研究員提供環(huán)境數(shù)據(jù)。

參考文獻

陳毅峰，曹文宣，2000.裂腹魚亞科[M]//樂佩琦，等.中國動物志： 硬骨魚綱鯉形目（下卷）.北京： 科學出版社.

高天翔，陳治，王曉艷，2018.近海魚類多樣性調(diào)查新方法：環(huán)境DNA分析技術(shù)[J].浙江海洋大學學報（自然科學版），37（1）：1-7.

蔣志剛，江建平，王躍招，等，2016.中國脊椎動物紅色名錄[J].生物多樣性，24（5）：500-551.

劉明典，馬波，張馳，等，2020.西藏河流裂腹魚類分布格局及環(huán)境影響因素： 以怒江和雅魯藏布江為例[J].生態(tài)環(huán)境學報，29（9）：1792-1800.

邵儉，馬寶珊，段友健，等，2019.雅魯藏布江拉薩裸裂尻魚種群資源狀況及其漁業(yè)管理對策[J].應(yīng)用生態(tài)學報，30（7）：2437-2446.

王夢，楊鑫，王維，等，2022.基于eDNA技術(shù)的長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區(qū)重慶段魚類多樣性研究[J].水生生物學報，46（1）：2-16.

王芮，林龍山，李海，等，2021.環(huán)境DNA方法在北極地區(qū)魚類多樣性研究中的應(yīng)用潛力[J].極地研究，33（1）：148-155.

吳昀晟，唐永凱，李建林，等，2019.環(huán)境DNA在長江江豚監(jiān)測中的應(yīng)用[J].中國水產(chǎn)科學，26（1）：124-132.

邢迎春，高婉茹，白潔，等，2022.環(huán)境DNA在湖泊生物多樣性研究中的應(yīng)用[J].水生生物學報，46（1）：136-147.

徐念，常劍波，2016.長江中下游干流環(huán)境DNA樣本魚類物種檢測的初步研究[J].水生態(tài)學雜志，37（5）：49-55.

閆卉果，董智玲，馬婷婷，等，2022.基于環(huán)境DNA的巖原鯉檢測及生物量評估[J].水產(chǎn)學報，46（6）：1018-1026.

楊漢運，黃道明，謝山，等，2010.雅魯藏布江中游漁業(yè)資源現(xiàn)狀研究[J].水生態(tài)學雜志，3（6）：120-126.

曾本和，劉海平，王建，等，2019.飼料蛋白質(zhì)水平對拉薩裸裂尻魚幼魚肌肉氨基酸及蛋白質(zhì)代謝的影響[J].中國水產(chǎn)科學，26（6）：1153-1163.

朱挺兵，陳亮，楊德國，等，2017.雅魯藏布江中游裂腹魚類的分布及棲息地特征[J].生態(tài)學雜志，36（10）：2817-2823.

Balasingham K D， Walter R P， Mandrak N E， et al， 2018.Environmental DNA detection of rare and invasive fish species in two Great Lakes tributaries[J].Molecular Ecology， 27（1）：112-127.

Bohmann K， Evans A， Gilbert M T P， et al， 2014.Environmental DNA for wildlife biology and biodiversity monitoring[J].Trends in ecology & evolution， 29（6）：358-367.

Brys R， Halfmaerten D， Neyrinck S， et al， 2021.Reliable eDNA detection and quantification of the european weather loach （Misgurnus fossilis）[J].Journal of Fish Biology， 98（2）：399-414.

Czeglédi I， Sály P， Specziár A， et al， 2021.Congruency between two traditional and eDNA-based sampling methods in characterising taxonomic and trait-based structure of fish communities and community-environment relationships in lentic environment[J].Ecological Indicators， 129： 107952.

Doi H， Uchii K， Takahara T， et al， 2015.Use of droplet digital PCR for estimation of fish abundance and biomass in environmental DNA surveys[J].PloS One， 10（3）：e0122763.

Eichmiller J J， Best S E， Sorensen P W， 2016.Effects of temperature and trophic state on degradation of environmental DNA in lake water[J].Environmental Science & Technology， 50（4）：1859-1867.

Feng X， Li B， Chen Y， et al， 2023. Species-level monitoring of rare and invasive fishes using eDNA metabarcoding in the middle and upper Yarlung Zangbo River， Tibet[J]. Water Biology and Security， 2（1）：100089.

He D， Chen Y， 2007.Molecular phylogeny and biogeography of the highly specialized grade schizothoracine fishes （Teleostei： Cyprinidae） inferred from cytochrome b sequences[J].Chinese Science Bulletin， 52（6）：777-788.

Hindson B J， Ness K D， Masquelier D A， et al， 2011.High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number[J].Analytical chemistry， 83（22）：8604-8610.

Jane S F， Wilcox T M， McKelvey K S， et al， 2015.Distance， flow and PCR inhibition： eDNA dynamics in two headwater streams[J].Molecular Ecology Resources， 15（1）：216-227.

Jo T， Murakami H， Yamamoto S， et al， 2019.Effect of water temperature and fish biomass on environmental DNA shedding， degradation， and size distribution[J].Ecology and Evolution， 9（3）：1135-1146.

Liang Y， He D， Jia Y， et al， 2017.Phylogeographic studies of schizothoracine fishes on the central Qinghai-Tibet Plateau reveal the highest known glacial microrefugia[J].Scientific Reports， 7：10983.

Mauvisseau Q， Davy-Bowker J， Bulling M， et al， 2019.Combining ddPCR and environmental DNA to improve detection capabilities of a criticay endangered freshwater invertebrate[J].Scientific Reports， 9（1）：14064.

Rozen S， Skaletsky H， 2000. Primer3 on the WWW for General Users and for Biologist Programmers[M]// Misener S， Krawetz S A. Bioinformatics Methods and Protocols： Methods in Molecular Biology， vol 132. Totowa， NJ： Humana Press：365-386.

Rusch J C， Hansen H， Strand D A， et al， 2018.Catching the fish with the worm： a case study on eDNA detection of the monogenean parasite Gyrodactylus salaris and two of its hosts， Atlantic salmon （Salmo salar） and rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）[J].Parasit Vectors， 11（1）：333.

Shen Y， Hubert N， Huang Y， et al， 2019.DNA barcoding the ichthyofauna of the Yangtze River： Insights from the molecular inventory of a mega-diverse temperate fauna[J].Molecular Ecology Resources， 19（5）：1278-1291.

Tamura K， Stecher G， Peterson D， et al， 2013.MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular Biology and Evolution， 30（12）：2725-2729.

Tang Y， Li C， Wanghe K， et al， 2019.Convergent evolution misled taxonomy in schizothoracine fishes （Cypriniformes： Cyprinidae）[J].Molecular phylogenetics and evolution， 134：323-337.

Thompson J D， Higgins D G， Gibson T J， 1994.CLUSTAL W： improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting， position-specific gap penalties and weight matrix choice[J].Nucleic Acids Research， 22（22）：4673-4680.

Wang S， Yan Z， H?nfling B， et al， 2021.Methodology of fish eDNA and its applications in ecology and environment[J].Science of the Total Environment， 755：142622.

Zardoya R， Meyer A， 1996.Phylogenetic performance of mitochondrial protein-coding genes in resolving relationships among vertebrates[J] .Molecular biology and evolution， 13（7）：933-942.

（責任編輯? ?熊美華）

收稿日期：2022-01-12? ? ? 修回日期：2023-08-29

基金項目：第二次青藏高原綜合科學考察研究項目（2019QZKK0304，2019QZKK0501），中國科學院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（XDA2005020403）。

作者簡介：李冰，1996年生，女，碩士研究生，主要從事魚類環(huán)境DNA研究。E-mail： 15007195038@163.com

馮秀，1989年生，男，副研究員，主要從事魚類分子生態(tài)學研究。E-mail： fengxiu@ihb.ac.cn

通信作者：陳毅峰，男，研究員。E-mail： chenyf@ihb.ac.cn