夏會楠 李東曉 周金看 王春霞 郭金英 鄭素月

夏會楠，李東曉，周金看，等. 黑平菇及白色變異平菇單核菌株的遺傳多樣性分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（7）：41-47.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.006

（河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北邯鄲 056038）

摘要：以篩選平菇雜交過程中優(yōu)良菌株為目標(biāo)，分析黑平菇以及白色變異平菇單核菌株遺傳多樣性。用24個白色變異平菇原生質(zhì)體單核菌株以及37個黑平菇原生質(zhì)體單核菌株為試驗材料，采用酯酶同工酶技術(shù)以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對其單核菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，酯酶同工酶白色變異原生質(zhì)體單核菌株菌株共檢測出7條遷移率不同的酶帶，黑平菇單核菌株共檢測出8條遷移率不同的酶帶，多態(tài)性條帶分別占65.8%、75%；ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將平菇白色變異單核菌株以及黑平菇單核菌株的原生質(zhì)體單核菌株從5個ISSR引物中分別擴(kuò)增出68、74條清晰的DNA多態(tài)片段，多態(tài)性位點分別占78.5%、63%。兩類聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)GS為0.75時，將24個平菇白色變異菌株單核菌株分為兩大類；當(dāng)GS為0.79左右時，將37個黑平菇單核菌株分為兩大類。說明酯酶同工酶技術(shù)以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以用于單核菌株遺傳多樣性分析，為平菇雜交育種過程中優(yōu)良親本單核體的選擇提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：平菇；單核菌株；酯酶同工酶；ISSR分子標(biāo)記

中圖分類號：S646.1+40.32? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0041-07

平菇是具有食用性和藥用性的可食用性大型子實體真菌，生長周期短收益快，且含有人體所需的大量生物活性物質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素，蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，具有非常高的營養(yǎng)價值，已成為人們的重要蔬菜。平菇是典型的四極性異宗結(jié)合菌。四極性異宗結(jié)合菌，交配型是由A、B這2對因子控制，同一菌株產(chǎn)生的擔(dān)孢子分為4種不同交配型：A1B1、A2B2、A1B2、A2B1，只有A、B這2個因子各不相同時才能進(jìn)行交配［1-2］。原生質(zhì)體單核菌株只有2種交配型。平菇雙核菌株通過單核化技術(shù)回到質(zhì)配前的單核狀態(tài)，是擔(dān)子菌獨特的生物學(xué)現(xiàn)象，原生質(zhì)體單核化是平菇遺傳育種上的一個重要節(jié)點，單核菌株具有遺傳多樣性，是研究平菇遺傳性狀以及基因定位的重要材料，同時單核菌株也為平菇雜交育種提供了重要的種質(zhì)資源。

酯酶同工酶技術(shù)是從蛋白質(zhì)水平上研究單核菌株之間的遺傳差異性，廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定以及遺傳差異研究中［1-2］。但酯酶同工酶僅僅只能從蛋白質(zhì)水平研究單核菌株遺傳差異，不能分析DNA水平上單核菌株遺傳差異，因此要更進(jìn)一步采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對單核菌株遺傳差異性進(jìn)行研究［3-4］。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是基于SSR發(fā)展起來的新技術(shù)，具有穩(wěn)定性及多態(tài)性，能夠更好地分析單核菌株之間的遺傳差異性［5-7］。筆者采用酯酶同工酶以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對白色變異平菇菌株的24個單核菌株以及黑色出發(fā)菌株的37個單核菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為食用菌育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2023年2—5月在河北工程大學(xué)食用菌研究室內(nèi)進(jìn)行，試驗所需平菇白色變異菌株是在平菇系統(tǒng)選育過程中發(fā)現(xiàn)的白色變異菌株，試驗所需變異白平菇原生質(zhì)體單核體，分別編號為B1～B24，黑色出發(fā)菌株原生質(zhì)體單核體H1～H37，由河北工程大學(xué)食用菌研究室鑒定、保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

將變異的白色平菇以及黑色出發(fā)菌株接種于PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 單核菌株收集

通過原生質(zhì)體制備獲得單核菌株，將單核菌株接種至鋪有玻璃紙的PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，菌絲長滿平板后刮取菌絲備用。

1.2.3 酯酶同工酶分析

將備用菌絲放入研缽中，加入液氮快速研磨，取0.5 g菌絲加入700 μL pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液，混勻后加入離心管19 ℃ 12 000 r/min 離心5 min取上清液。使用DYC2-24EN型雙垂直電泳儀進(jìn)行垂直電泳。

1.2.4 ISSR分子鑒定

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取單核菌株DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度及質(zhì)量，進(jìn)行凝膠成像拍照，剩余DNA放在-20 ℃保存?zhèn)溆?，后期進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見表1。所采用的ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用NTSYS-PC軟件進(jìn)行聚類分析，打開Ntsys 軟件中的ntedit.exe程序以及NTSYS-PC程序，用非加權(quán)組平均法（UPGMA）構(gòu)建各菌株的親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶分析

2.1.1 白色變異平菇酯酶同工酶

酯酶同工酶分析結(jié)果表明，24個白色變異平菇原生質(zhì)體單核菌株共檢測到7條不同遷移率的酶帶，相對遷移率（Rf）在0.23～0.63之間，各個單核菌株酶帶數(shù)量在4～7條，多態(tài)性帶型占65.8%，部分平菇白色變異單核菌株酯酶同工酶圖譜見圖1。

2.1.2 白色變異平菇酯酶同工酶聚類分析

聚類分析樹狀圖見圖2。由圖2可知，供試的24個白色變異平菇單核菌株間的遺傳相似系數(shù)（GS）為0.6～1.0，當(dāng)GS為0.685時可將菌株分為2組，根據(jù)樣本量依次分為A、B 2組。A組為B1、B2等20個菌株，B組為B17、B18、B19、B20等4個菌株。

2.1.3 黑色出發(fā)平菇酯酶同工酶分析

酯酶同工酶分析結(jié)果表明，37個黑色平菇原生質(zhì)體單核菌株共檢測到8條不同遷移率的酶帶，相對遷移率在014～0.47之間，各個單核菌株酶帶數(shù)量在3～7條，多態(tài)性帶型占75%，部分黑平菇單核菌株酯酶同工酶圖譜見圖3。

2.1.4 黑平菇酯酶同工酶聚類分析

由圖4聚類分析樹狀圖可知，供試的37個平菇單核菌株間的遺傳相似系數(shù)（GS）為0.58～1.00，當(dāng)GS為0.66時可將菌株分為2組，根據(jù)樣本量依次分為A、B 2組。A組為H1、H2等33個菌株，B組為H13、H14、H15、H16等4個菌株。

2.2 ISSR引物篩選及聚類分析

2.2.1 DNA檢測

24株白色變異平菇單核菌株DNA質(zhì)量檢測結(jié)果如圖5所示，有明顯的DNA條帶，可進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增試驗。黑色出發(fā)菌株部分DNA檢測結(jié)果如圖6所示，有明顯DNA條帶，可進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增試驗。

2.2.2 ISSR引物篩選

從28個引物（表2）中篩選出5個擴(kuò)增條帶清晰的引物，對24個白色變異單核菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出清晰的條帶，分別是P2、P4、P5、P9、P22、P22、P9的擴(kuò)增圖譜分別如圖7、圖8所示，5個引物對24個平菇白色變異單核菌株共擴(kuò)增出73條清晰條帶。擴(kuò)增條帶最多的引物是P22，擴(kuò)增條帶最少的引物是P5，擴(kuò)增出14條條帶。多態(tài)性位點占78.5%。

2.2.3 24個平菇單核菌株的ISSR聚類分析

將24個平菇單核菌株的DNA擴(kuò)增圖譜轉(zhuǎn)化成GS矩陣圖，再利用NTSYS-PC軟件UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建單核菌株親緣關(guān)系圖。由圖9可知，24個單核菌株GS在0.58～1.00之間，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.75時可將24個平菇單核菌株分為兩大類，A類有B1、B2等20個菌株，B類有B17、B18、B19、B20等4個菌株，與酯酶同工酶分析結(jié)果一致。

2.2.4 黑平菇菌株ISSR引物篩選

從28個引物（表2）中篩選出4個擴(kuò)增條帶清晰的引物（P6、P11、P19、P22），對37個黑平菇原生質(zhì)體單核菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增均能擴(kuò)增出清晰的條帶。P22、P6的擴(kuò)增圖譜分別如圖10、圖11所示。 4個引物對37個平菇單核菌株共擴(kuò)增出64個清晰的條帶。擴(kuò)增條帶最多的引物是P22，擴(kuò)增出16條條帶，擴(kuò)增條帶最少的是P5，擴(kuò)增出5條條帶。多態(tài)性位點占63%。

2.2.5 37個黑平菇單核菌株的ISSR聚類分析

將37個平菇單核菌株的DNA擴(kuò)增圖譜轉(zhuǎn)化成GS矩陣圖，再利用NTSYS-PC軟件UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建單核菌株親緣關(guān)系聚類分析圖。由圖12可知， 供試的37個單核菌株GS在?0.78～1.00之間，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.79時可將37個平菇單核菌株分為兩大類，A類有H1、H2等33個單核菌株，B類有H13、H14、H15、H16等4個菌株，與酯酶同工酶分析結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

在生產(chǎn)中，為達(dá)到育種目標(biāo)提高生產(chǎn)力，單核菌株遺傳差異研究在食用菌育種中起著非常重要的作用，為平菇雜交育種提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源［8-10］。酯酶同工酶分析、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食用菌雜交育種、種質(zhì)資源鑒定以及單核菌株遺傳差異研究［11］。本試驗在酯酶同工酶分析的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步研究了白色變異平菇單核菌株遺傳差異性，便于挑出優(yōu)良單核菌株用于育種工作。根據(jù)聚類分析圖來看，遺傳相似性基本一致。酯酶同工酶試驗在24個單核菌株中共檢測出7條遷移率不同的酶帶，多態(tài)性帶型占658%。24個平菇單核菌株間的遺傳相似系數(shù)（GS）在0.6～1.0之間，當(dāng)GS為0.685時可將菌株分為2組，根據(jù)樣本量依次分為A、B 2組。A組為B1、B2等20個菌株，B組為B17、B18、B19、B20等4個菌株，并且Rf為0.63的條帶為24個單核菌株所共有的，可以認(rèn)為是白色變異平菇單核體的特征譜帶。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)用篩選出的5條引物對24個平菇單核菌株的DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，24個平菇單核菌株共擴(kuò)增出73條清晰條帶。擴(kuò)增條帶最多的引物是P22，擴(kuò)增條帶最少的引物是P5，擴(kuò)增出14條條帶，多態(tài)性位點占78.5%。當(dāng)GS為0.75時，將24個菌株分為兩大類。平菇黑色出發(fā)菌株分別分離出單核菌株37個，平菇黑色出發(fā)菌株原生質(zhì)體單核菌株酯酶同工酶試驗共檢測出8條遷移率不同的酶帶，多態(tài)性帶占75%。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將平菇黑色出發(fā)菌株的原生質(zhì)體單核菌株從5個ISSR引物中分別擴(kuò)增出64條清晰的DNA多態(tài)片段，多態(tài)性位點分別占63%，兩類聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)GS為0.79左右時，將37個黑色出發(fā)菌株分[21]為兩大類。酯酶同工酶分析以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)均可以作為單核菌株遺傳差異研究的技術(shù)手段。通過酯酶同工酶以及分子標(biāo)記技術(shù)研究單核菌株遺傳差異大體分類相同之間的小分支還有所差異。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對黑色出發(fā)菌株以及白色變異菌株的單核菌株進(jìn)行了具體的遺傳多樣性分析，當(dāng)GS為0.75時，將白色變異菌株24個菌株分為兩大類。當(dāng)GS為0.79左右時，將黑色出發(fā)菌株37個菌株分為兩大類。酯酶同工酶試驗結(jié)果表明，平菇黑色出發(fā)菌株以及平菇白色變異菌株遺傳系相接近，在遺傳相似系數(shù)在0.75左右能將其分為兩大類。綜上所述，平菇白色變異菌株的單核菌株遺傳多樣性不同于黑色出發(fā)菌株。這為平菇擴(kuò)充種質(zhì)資源庫奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］?do Nascimento W F. Genetic diversity of yam （Dioscorea trifida L.） assessed with morphological，SSR and ISSR markers［D］. Sao Paulo：University of Sao Paulo，2013：1-24.

［2］孟 虎，孫國琴，睢 韡，等. ISSR技術(shù)在食用菌研究上的應(yīng)用［J］. 北方園藝，2016（5）：207-210.

［3］葉 明，王和平，潘迎捷. 利用酯酶同工酶技術(shù)檢測香菇雙單雜交后代［J］. 生物學(xué)雜志，1999，16（5）：21-22，47.

［4］宋小亞，肖 揚，邊銀丙. ISSR標(biāo)記在黑木耳單核體遺傳分析中的應(yīng)用［J］. 菌物學(xué)報，2007，26（4）：528-533.

［5］Bian Y B，Wu K Y，Wu C S. Genetic analysis of isozyme loci of intraspecific hybrid in Auricularia auricula［J］. Acta Genetica Sinica，2003，30（1）：76-80.

［6］Fernández M E，F(xiàn)igueiras A M，Benito C.The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism，genotype identification and genetic diversity among barley cultivars with known origin［J］. Theoretical and Applied Genetics，2002，104（5）：845-851.

［7］蘇秀麗，梁惠凌，劉寶玉，等. 基于ISSR分子標(biāo)記的黃花倒水蓮遺傳多樣性分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2022，38（3）：605-610.

［8］Capparelli R，Viscardi M，Amoroso M G，et al. Inter-simple sequence repeat markers and flow cytometry for the characterization of closely related Citrus limon germplasms［J］. Biotechnology Letters，2004，26（16）：1295-1299.

［9］Kumar K. Nutraceutical potential and processing aspects of oyster mushrooms （Pleurotus species）［J］. Current Nutrition & Food Science，2020，16（1）：3-14.

［10］史靈燕，張云龍，劉保衛(wèi)，等. 基于SRAP分子標(biāo)記的24個黑木耳栽培菌株遺傳分析［J］. 食用菌，2019，41（6）：20-23，33.

［11］劉曉雪，王 強(qiáng)，張彬彬，等. 基于酯酶和ISSR技術(shù)的平菇單核菌株遺傳多樣性分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（9）：27-32.

基金項目：河北省高等學(xué)校學(xué)科技術(shù)研究項目（編號：QN2021210）；邯鄲市科技技術(shù)研究與發(fā)展計劃（編號：21422012326）；河北省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目（編號：202360101010014）。

作者簡介：夏會楠（1998—），女，河北承德人，碩士，研究方向為食藥用真菌。E-mail：2199797807@qq.com。

通信作者：鄭素月，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事食用菌遺傳育種研究工作。E-mail：zhengsuyue@sina.com。