管堂飛，楊鑫，洪燦輝，肖培云，張成桂，何正春

大理大學藥學院 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000

美洲大蠊為蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，是一種世界公認的衛(wèi)生害蟲。美洲大蠊入藥始載于《神農本草經》，現為云南彝族民間常用的傳統動物藥［1］。美洲大蠊可內外兼用，具有促進傷口愈合、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效［2］。研究顯示，美洲大蠊提取物含有豐富的蛋白質、肽、氨基酸、核苷以及多種類型的有機小分子，具有抗纖維化、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等諸多生物活性［3］。根據“膽堿能損傷假說”，在神經退行性疾病阿爾茨海默?。ˋD）中，神經遞質乙酰膽堿減少是其關鍵致病因素之一［4］。隨著年齡的增長，氧化應激反應增加是導致與年齡相關疾病尤其是神經退行性疾病發(fā)生的主要因素，而富含抗氧化劑的飲食和藥物在抗衰老過程中發(fā)揮重要作用［5］。美洲大蠊提取物PAS840是從美洲大蠊蟲體中提取，并經大孔樹脂分離純化后得到的精提物。本課題組前期研究發(fā)現，美洲大蠊提取物PAS840可減輕過氧化氫（H2O2）引起的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞損傷，提示其可能對氧化應激相關疾病甚至神經退行性疾病有效［6］。2022年10月—2023年5月，本研究觀察了美洲大蠊提取物PAS840對乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的抑制作用及其抗氧化活性，以期為美洲大蠊提取物在神經退行性疾病、氧化應激相關疾病治療中的應用提供科學依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 藥品：美洲大蠊提取物PAS840凍干粉提取自大理大學藥物化學教研室。主要試劑：AChE、牛血清蛋白（BSA）購自美國索萊寶公司，5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）、1%十二烷基硫酸鈉（SDS）均購自北京伊諾凱科技有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購自上海思域化工科技有限公司，磷酸緩沖鹽溶液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.38）購自武漢賽維爾科技有限公司。

1.2 美洲大蠊提取物PAS840對AChE活性的抑制作用觀察

1.2.1 體外AChE活性檢測模型建立 采用改良的Ellman法進行酶促反應［7-8］。AChE活性檢測原理：AChE在一定pH條件下，可催化水解底物ATCI生成產物硫代膽堿，而硫代膽堿可迅速與溶液中的顯色劑DTNB反應，生成黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽，其在412 nm波長處有最大吸收；而當AChE活性被部分抑制時，其水解ATCI的能力下降，生成的黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽減少，其在412 nm波長波長處的光密度值降低。參照文獻［9］確定AChE的濃度為0.85 U/mL，PAS840濃度為15.625 μg/mL，加入不同濃度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的ATCI作為底物，檢測作用0、10、20、30 min時5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽在412 nm波長處的光密度值。結果顯示，隨著作用時間的延長和底物ATCI濃度的增加，5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽在412 nm波長處的光密度值均呈升高趨勢，提示該模型可穩(wěn)定可靠地反映AChE活性，可用于后續(xù)實驗。見OSID碼圖1。

1.2.2 最佳酶促反應時間確定 采用光密度—時間曲線。取PBS 150 μL，37 ℃水浴預熱5 min，再依次加入0.85 U/mL的AChE 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、15 mmol/L ATCI 20 μL，37 ℃水浴反應不同時間（0、5、10、15、20、25、30 min）。使用酶標儀檢測412 nm波長處的光密度值，扣除ATCI因非酶催水解所產生的光密度值，確定酶促反應處于初速度的時間，即為酶促反應時間。結果顯示，光密度值隨著酶促反應時間的延長而升高，但當反應時間達到20 min后光密度值也未見減小，基于反應時間長短以及參考相關文獻［8］，選擇最佳酶促反應時間為20 min。見OSID碼圖2。

1.2.3 最佳AChE酶促反應濃度確定 采用光密度—酶活曲線。取PBS 150 μL，37 ℃水浴預熱5 min，依次加入不同濃度（0.106 25、0.212 5、0.425、0.850、1.700 U/mL）的AChE 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、15 mmol/L ATCI 20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應20 min。使用酶標儀檢測412 nm波長處的光密度值，扣除ATCI因非酶催水解所產生的光密度值，確定是否可以用光密度值代表AChE活性。結果顯示，該酶促反應體系的光密度值隨著AChE濃度的升高而升高；但當AChE濃度超過0.425 U/mL時，該酶促反應體系的光密度值趨于平穩(wěn)，提示底物的水解產物含量趨于穩(wěn)定，反應達到相對平衡；因此，選擇最佳AChE酶促反應濃度為0.425 U/mL。見OSID碼圖3。

1.2.4 最佳底物濃度確定 取150 μL的PBS，37 ℃水浴預熱5 min，依次加入不同濃度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的ATCI 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、0.425 U/mL AChE 20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應20 min，使用酶標儀檢測412 nm波長處的光密度值。結果顯示，在AChE濃度為0.425 U/mL時，該酶促反應體系的光密度值隨著底物ATCI濃度的升高而升高；當底物ATCI濃度大于15 mmol/L時，該酶促反應體系的光密度值趨于平穩(wěn)；因此，選擇最佳底物ATCI濃度為15 mmol/L。見OSID碼圖4。

1.2.5 不同濃度PAS840對AChE活性的抑制作用觀察 采用改良的Ellman法［8-10］，按照上述已篩選出的最佳AChE、ATCI濃度進行實驗。在96孔板中依次加入37 ℃預熱5 min后的PBS 150 μL，加入最佳濃度為0.425 U/mL的AChE 20 μL，15 mmol/L的DTNB 20 μL，再分別加入濃度為7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250 μg/mL的PAS840，以及最佳濃度為15 mmol/L的底物ATCI各20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應不同時間（0、5、10、15、20、25、30 min）；加入1% SDS 20 μL終止反應，酶標儀檢測412 nm波長處的光密度值，記為OD樣。每個濃度做3個平行，每個平行設置樣品、空白和本底三個對照。由于本實驗的樣品PAS840有顏色，所以每個樣品同時做一個本底扣除，用PBS 20 μL替代ATCI底物溶液，酶標儀檢測其412 nm波長處的光密度值（以OD值表示），記為OD底。用PBS代替AChE作為空白對照，酶標儀檢測其412 nm波長處的光密度值，記為OD空。繪制不同作用時間加入不同濃度的PAS840后AChE催化ATCI分解的光密度—時間曲線，以其斜率反映AChE催化ATCI分解的速率。

1.2.6 不同濃度PAS840的AChE抑制率測定 參照文獻［4］的方法，按照“1.2.2”“1.2.3”“1.2.4”篩選出的最佳條件進行實驗，加入PAS840的濃度為15.625、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL，按照“1.2.5”的方法測定光密度值，并計算各濃度PAS840對AChE活性的抑制率［11］。AChE活性抑制率=（OD空-OD樣+OD底）/OD空×100%。繪制不同濃度PAS840作用后的AChE抑制率曲線，采用GraphPad Prism5軟件得到PAS840抑制AChE催化ATCI分解的半數抑制濃度（IC50）。

1.2.7 PAS840對AChE活性的抑制類型分析 確定AChE濃度為0.425 U/mL，選擇不同濃度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的底物ATCI，采用改良的Ellman法測定光密度值，繪制AChE催化ATCI分解的反應速率（V）隨底物濃度（S）變化的曲線，即米氏方程曲線。結果顯示，在相同底物濃度條件下，隨著PAS840濃度的升高，AChE催化ATCI分解的反應速率降低，即PAS840的抑制活性增強，見OSID碼圖5。該反應體系酶促反應速率增加的原因是底物濃度的非線性增加，這種趨勢符合米氏方程規(guī)律，可采用米氏方程相關的酶動力學實驗測定PAS840對AChE的抑制類型［12］。采用雙倒數作圖法，繪制不同濃度PAS840作用后，AChE催化ATCI分解反應速率的倒數（1/V）隨底物濃度的倒數（1/S）變化的曲線，即不同濃度PAS840對AChE抑制作用的雙倒數曲線，通過雙倒數曲線判斷抑制類型，包括競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合性抑制［13］。

1.3 美洲大蠊提取物PAS840的抗氧化活性觀察

1.3.1 PAS840對DPPH自由基的清除能力觀察采用DPPH法。參照姚旭等［10］的方法并稍作改動，稱取1.971 6 mg的DPPH，加入無水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液，取不同濃度（3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250 μg/mL）的PAS840溶液或維生素C（VC）1 mL，再加入DPPH溶液1 mL，充分混合均勻。23 ℃避光放置30 min，0.25 μm微孔濾膜過濾，取濾液250 μL于96孔板中，517 nm處測定光密度值（以A表示），以此表示DPPH自由基含量，光密度水平越低表明清除的DPPH自由基越多，其抗化活性越強。DPPH自由基清除率=1-［（A樣-A底）/A空］×100%，其中A空為1 mL無水乙醇加1 mL DPPH溶液的光密度值、A樣為1 mL樣品溶液加1 mL DPPH溶液的光密度值、A底為1 mL樣品溶液加1 mL無水乙醇的光密度值。采用ELISA Calc回歸/擬合程序軟件計算PAS840清除DPPH自由基的IC50。

1.3.2 PAS840對鐵氰化鉀的還原能力觀察 采用總還原能力測定法。在4 mL離心管中分別加入濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.6），分別加入不同濃度（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL）的PAS840溶液或Vc 0.2 mL，加入1%鐵氰化鉀0.5 mL，混合均勻。50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸0.5 mL終止反應，0.25 μm微孔濾膜過濾。加入去離子水0.5 mL和0.1%三氯化鐵0.1 mL，渦旋儀混合均勻，靜置10 min。取250 μL混合液于96孔板中，檢測700 nm處的光密度值（以B表示）［10］。鐵氰化鉀還原率=（B空-B樣）/B空×100%，其中B空為空白對照液的光密度值、B樣為加入樣品溶液后的光密度值。采用ELISA Calc回歸/擬合程序軟件計算PAS840還原鐵氰化鉀的IC50。

1.3.3 PAS840對羥自由基的清除能力觀察 采用水楊酸法。取9 mmol/L FeSO41 mL，加入到4 mL離心管中，再加入10 mmol/L水楊酸—乙醇溶液1 mL，依次加入不同濃度（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL）PAS840溶液或Vc溶液1 mL，最后加入3% H2O21 mL作為顯色劑。37 ℃水浴反應30 min，以蒸餾水為參比，檢測510 nm下的光密度值（以C表示）。羥自由基清除率=1-［（C樣-C底）/C空］×100%，其中C空為空白對照液的光密度值、C樣為加入樣品溶液后的光密度值、C底為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的光密度值。采用ELISA Calc回歸/擬合程序軟件計算PAS840清除羥自由基的IC50。

2 結果

2.1 不同濃度PAS840對AChE的活性抑制作用比較 隨著PAS840濃度的升高，AChE催化ATCI分解的光密度—時間曲線斜率逐漸降低，提示PAS840對AChE催化反應進程具有抑制作用，且隨著作用濃度和時間的增加，其抑制作用更為明顯。見OSID碼圖6。

2.2 不同濃度PAS840的AChE抑制率比較 隨著PAS840濃度的增加，AChE抑制率先逐漸升高再趨于平緩；見OSID碼圖7。PAS840抑制AChE活性的IC50為22.30 μg/mL。

2.3 PAS840對AChE的活性抑制類型 雙倒數曲線分析結果顯示，不同濃度PAS840作用后，幾條直線均相交于第二象限，且在橫坐標軸和縱坐標軸的交點均不同，AChE的表觀米氏常數隨PAS840濃度的增加而增加，而最大酶促反應速率減??；這提示PAS840對AChE的活性抑制類型是混合性抑制。見OSID碼圖8。

2.4 不同濃度PAS840、Vc對DPPH自由基的清除率比較 隨著濃度的增加，PAS840、Vc對DPPH自由基的清除率均呈先升高后平穩(wěn)的趨勢；500 μg/mL PAS840對DPPH自由基的清除率為93.95%，同等濃度Vc的清除率為97.31%；見OSID碼圖9。PAS840清除DPPH自由基的IC50為43.21 μg/mL。

2.5 不同濃度PAS840、Vc對鐵氰化鉀的還原率比較 隨著濃度的增加，PAS840對鐵氰化鉀的還原率呈先升高后平穩(wěn)的趨勢，Vc對鐵氰化鉀的還原率呈比較高的平穩(wěn)趨勢；3.0 mg/mL PAS840對鐵氰化鉀的還原率為78.20%，同等濃度Vc的還原率為82.20%；見OSID碼圖10。PAS840還原鐵氰化鉀的IC50為0.498 mg/mL。

2.6 不同濃度PAS840、Vc對羥自由基的清除率比較 隨著濃度的增加，PAS840對羥自由基的清除率呈比較中等的平穩(wěn)趨勢，Vc對羥自由基的清除率呈逐漸升高趨勢；1.8 mg/mL PAS840對羥自由基的清除率為45.72%，其后逐漸趨于平緩，同等濃度Vc的清除率為74.06%；3.0 mg/mL PAS840對羥自由基的清除率為47.83%，同等濃度Vc的清除率為89.73%；見OSID碼圖11。PAS840清除羥自由基的IC50為3.65 mg/mL。

3 討論

神經退行性疾病是一類認知能力下降且不可逆的選擇性與進行性神經元功能障礙疾病，其中研究最多的是AD。目前，針對AD的發(fā)病機制有多種假說，包括氧化應激假說、炎癥假說、膽堿能損傷假說、β淀粉樣蛋白級聯假說及Tau蛋白異常修飾假說等，其中最具代表性的是膽堿能損傷假說［14］。該假說認為，各種原因引起的大腦基底前腦膽堿能神經元損傷，以及大腦皮層及海馬等區(qū)域的膽堿能神經傳遞受損，在AD患者記憶及認知功能損傷過程中均具有重要作用［15］。AChE是人體大腦中生物信號傳導的關鍵酶之一，能催化神經遞質乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，進而阻礙大腦中神經信號的傳遞［16］。研究表明，癡呆程度與膽堿能含量有重要關系，而AChE活性與乙酰膽堿水平呈負相關關系［17］。因此，抑制AChE進而提高乙酰膽堿水平也就成了治療AD的重要途徑之一［18］。

我國是傳統中藥資源大國，傳統醫(yī)學對AD一類神經退行性疾病的預防及治療也有著悠久的歷史。中藥素以多組分、多靶點、多途徑發(fā)揮作用著稱，在許多病因不明的疑難雜癥中常收獲奇效。美洲大蠊提取物PAS840是從美洲大蠊乙醇提物中提取，經大孔樹脂吸附及水、醇水洗脫后，減壓蒸餾，冷凍干燥得到的。本研究結果顯示，美洲大蠊提取物PAS840具有較強的AChE活性抑制作用，IC50達22.30 μg/mL；PAS840對AChE的抑制類型為混合性抑制。這表明PAS840既可以和游離酶單獨結合，也可以與酶和底物復合物結合，從而抑制AChE的催化活性。

研究表明，AChE抑制劑可刺激膽堿能神經，從而減輕心肌梗死（MI）大鼠的交感迷走神經失衡、缺血性心律失常、炎癥、氧化應激和細胞凋亡［19］。氧化應激可能是許多疾病的誘發(fā)因素，被認為在衰老過程中具有重要作用。氧化損傷是衰老的標志，被認為可導致多種年齡相關疾病的發(fā)生，也包括AD等神經退行性疾病。研究表明，具有抗氧化或抗炎特性的多靶點定向化合物是治療AD的有效藥物，如作為抗氧化劑和抗神經炎癥劑的羽扇豆醇已被發(fā)現對AD的氧化應激反應具有積極影響［20］。

DPPH是一種較穩(wěn)定的自由基，文中通過測定DPPH自由基清除率為清除自由基活性的檢測提供了一個理想又簡單的藥理模型。研究表明，鐵物質在體內能產生最有害的自由基物質，即羥自由基，羥自由基在體內會引起氧化應激，從而導致一系列氧化應激相關疾病的發(fā)生［21］。羥自由基是體內最活躍的活性氧，作用于體內蛋白質、核酸、脂類等生物分子，可造成細胞結構和功能受損，進而導致體內代謝紊亂，如引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，并損傷膜結構和功能等。因此，羥自由基清除能力是檢測抗氧化能力的重要指標之一。本研究顯示，美洲大蠊提取物PAS840清除DPPH自由基的IC50為43.21 μg/mL，還原鐵氰化鉀的IC50為0.498 mg/mL，清除羥自由基的IC50為3.65 mg/mL。

綜上所述，PAS840具有較強的AChE活性抑制作用和抗氧化活性，對神經退行性疾病及其他因氧化應激而引起的疾病可能具有潛在的治療作用，其藥用價值仍需進一步的體內動物實驗進行驗證。