關(guān)鍵詞： 施氮量； 全氮； 碳氮比； 酶活性； 微生物群落結(jié)構(gòu)

微生物是陸地生態(tài)功能的重要影響因素，在調(diào)控土壤養(yǎng)分的“源”和“庫(kù)”過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[ 1 ? 3 ]。不同土壤微生物類群能感知土壤性質(zhì)的改變，從而做出差異化的響應(yīng)[4?5]。氮肥的持續(xù)施用雖然提高了土地生產(chǎn)力，但也顯著改變微生物棲息的微環(huán)境[6]。近年來(lái)，雖然我國(guó)實(shí)行了氮肥增效減施行動(dòng)，但2022 年中國(guó)氮肥施用量仍高達(dá)1654.1 萬(wàn)t[7]。因此，探究施氮條件下微生物群落的變化有助于農(nóng)田土壤培肥和健康措施的制定。

細(xì)菌和真菌可以調(diào)控土壤生物化學(xué)過(guò)程和生態(tài)系統(tǒng)功能，但氮肥對(duì)細(xì)菌和真菌群落的影響尚未明確。有報(bào)道指出，細(xì)菌和真菌多樣性均隨氮肥施用量增加呈降低趨勢(shì)[8]，且施氮量越高多樣性的降低幅度越大[9]。也有部分研究發(fā)現(xiàn)短期施氮降低細(xì)菌多樣性，對(duì)真菌多樣性無(wú)顯著影響[10]，但也存在施氮顯著增加細(xì)菌和真菌多樣性的結(jié)論[11]。此外也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)施氮對(duì)細(xì)菌和真菌多樣性均無(wú)顯著影響[12]。對(duì)于細(xì)菌和真菌群落組成而言，施氮增加肉座菌目、被孢霉目等真菌及放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)等細(xì)菌的豐度，降低變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的豐度[13]，但也有研究指出施氮降低放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等細(xì)菌豐度，增加厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)等細(xì)菌豐度[14]，另有部分關(guān)于施氮在門(mén)水平對(duì)細(xì)菌和真菌群落組成無(wú)顯著影響的報(bào)道[12]。此外，施氮對(duì)細(xì)菌和真菌各類群間關(guān)系的影響研究，也存在降低共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性[10]與提高共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性[15]的不一致報(bào)道。

黃土高原水土流失嚴(yán)重，土壤肥力匱乏，大量氮肥投入土壤中以保證糧食產(chǎn)量[16]。但是，黃土區(qū)細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)和功能對(duì)長(zhǎng)期施氮的響應(yīng)并不清楚。本研究基于長(zhǎng)期氮肥管理試驗(yàn)，測(cè)定不同施氮量（0、45、90、135、180 kg/hm2） 的細(xì)菌和真菌特性、土壤微生物活性（7—9 月休閑季土壤呼吸量）、碳氮養(yǎng)分含量等理化性質(zhì)；分析土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)施氮的響應(yīng)特征；辨析土壤理化性質(zhì)與微生物特性、碳代謝功能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)及長(zhǎng)期定位試驗(yàn)概況

陜西長(zhǎng)武農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站長(zhǎng)期氮肥管理試驗(yàn)于1984 年建立。該試驗(yàn)地點(diǎn)位于黃土高原溝壑區(qū)長(zhǎng)武縣十里鋪村（107°40′E，35°12′N，海拔1200 m），屬于典型旱作雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，無(wú)灌溉條件；1 9 5 7—2 0 1 8 年年均降水量為580 mm，7—9 月份降水量占年降水量的49.0% 左右；平均氣溫為9.1℃，年日照時(shí)數(shù)2230 h，日照率為51.0%，年輻射總量為484 kJ/cm2。土壤為黏壤質(zhì)黑壚土，1984 年布設(shè)試驗(yàn)時(shí)土壤有機(jī)碳6.5 g/kg，全氮0.6 g/kg，pH 8.4，CaCO3 含量10.5%，黏粒（lt;0.002 mm） 含量24.0%。試驗(yàn)共設(shè)24 個(gè)肥料處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，共72 個(gè)小區(qū)，區(qū)組隨機(jī)排列，小區(qū)長(zhǎng)6 m，寬4 m，小區(qū)間距0.3 m，區(qū)組間距0.8 m，四周路寬1 m。種植制度為冬小麥（Triticumaestivum L.） 連作，所用化肥為尿素、重過(guò)磷酸鈣，不施用鉀肥，氮磷肥全部在播種前撒施地表后耕翻入土，后期不再追肥。

1.2 土壤樣品采集

于2022 年7 月小麥?zhǔn)斋@后，選取同一施磷水平（P 39 kg/hm2） 下5 個(gè)氮肥施用量處理：N 0、45、90、135、180 kg/hm2 （N0、N45、N90、N135、N180）小區(qū)，采集0—20 cm 土層樣品。每個(gè)小區(qū)以“S”形采樣法采集5 鉆土樣，制成混合樣品，共計(jì)15 個(gè)樣品。新鮮土樣通過(guò)2 mm 篩后，剔除根系殘?bào)w，用冷藏箱帶回實(shí)驗(yàn)室：一部分樣品在?80℃ 保存供土壤微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定；另一部分樣品4℃ 保存供微生物量碳、土壤酶活性、硝態(tài)氮（NO3?-N） 等理化性質(zhì)的測(cè)定；剩余樣品在室溫下風(fēng)干，用于土壤pH、有機(jī)碳、氮素含量等理化性質(zhì)的測(cè)定。根系在小麥成熟后，利用根鉆在行間和行上各采集三鉆，將根系揀出，沖洗干凈，70℃～80℃ 烘干至質(zhì)量恒定，再分別稱量和記錄[17]。

1.3 土壤理化性狀分析

土壤有機(jī)碳（soil organic carbon，SOC） 測(cè)定利用H2SO4–K2CrO7 外加熱法[18]，全氮（total nitrogen，TN） 測(cè)定利用凱氏定氮法[19]，土壤微生物量碳（soilmicrobial biomass carbon，SMBC） 采用氯仿熏蒸―萃取法[20]，土壤NO3?-N 用2 mol/L KCl 溶液浸提鮮土樣后，用流動(dòng)分析儀測(cè)定（SAN++，Skalar，Holland）。土壤微生物量碳的測(cè)定方法中未用氯仿熏蒸步驟測(cè)定的碳含量即為土壤可溶性有機(jī)碳（dissolved organic carbon，DOC）。土壤酶活性采用微孔板熒光法測(cè)定[21]。土壤水分采用恒溫箱烘干法，有機(jī)質(zhì)芳香程度（SUV254） 采用紫外?可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定254 nm 處的紫外吸光度[22]。

土壤微生物活性為7—9 月土壤呼吸速率的平均值。7 月到9 月為休閑季節(jié)，土壤呼吸值為微生物呼吸，可表征微生物活性[23]，選擇晴好天氣在9：00—11：00 利用土壤碳通量測(cè)量系統(tǒng)LI-8100 （LI-COR，Lincoln，NE，USA） 測(cè)定土壤呼吸速率，大約每10 天測(cè)定1 次。

1.4 DNA 提取和高通量測(cè)序

采用Fast DNA SPIN Kit for soil 試劑盒和MPFastPrep-24 核酸提取儀提取土壤中的DNA，使用帶B a r c o d e 的特異引物進(jìn)行P C R 擴(kuò)增： 3 3 8 F（5′?ACTCCTACGGGAGGCAGCAG?3′） 和806R（5′?GGACTACHVGGGTWTCTAAT?3′） 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)域，ITS1 （5′?ACTCCTACGGGAGGCAGCAG?3′） 和ITS2 （5′?GGACTACHVGGGTWTCTAAT?3′） 擴(kuò)增真菌ITS 基因區(qū)域[ 2 4 ]。純化擴(kuò)增產(chǎn)物并制備序列文庫(kù)，然后用Qubit@2.0 Fluorometer （Thermo Scientific） 和AgilentBioanalyzer 2100 系統(tǒng)檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量。在北京諾禾致源科技股份有限公司利用Illumina HiSeq2500PE250 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。將雙末端序列根據(jù)Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物標(biāo)簽拆分出各個(gè)樣品的數(shù)據(jù)，將每個(gè)樣品的序列借助FLASH （V1.2.7，http：//ccbjhu.edu/software/FLASH） 進(jìn)行拼接，然后根據(jù)QⅡME[25]質(zhì)控流程進(jìn)行質(zhì)量控制。根據(jù)UCHIME算法[ 2 6 ]去除嵌合體序列，然后將剩余的序列利用UParse 軟件[27]以97% 的相似度聚類劃分OTU。對(duì)于OTU 的每一個(gè)代表序列，使用RDP Classifier 算法與Green Gene 數(shù)據(jù)庫(kù)以80% 的置信閾值進(jìn)行物種注釋分析。最后以數(shù)據(jù)量最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)得到的OTU 豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的alpha 和beta 多樣性分析均基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。此外，細(xì)菌的功能預(yù)測(cè)是通過(guò)PICRUSt 生物信息軟件包實(shí)現(xiàn)，根據(jù)16S 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的功能預(yù)測(cè)[28]。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 2.0 軟件對(duì)土壤性狀和微生物群落α-、β-多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并進(jìn)行F 顯著性檢驗(yàn)。采用R （4.3.0） 對(duì)微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，通過(guò)ggplot2 包繪制門(mén)、綱水平排名前10 的細(xì)菌和真菌群落相對(duì)豐度圖和土壤微生物群落豐富度（Chao1 指數(shù)） 及多樣性（Shannon 指數(shù)）、功能結(jié)構(gòu)，利用“vegan”包繪制主坐標(biāo)分析圖（PCoA），用“corrplot”數(shù)據(jù)包繪制微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性狀的相關(guān)關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮對(duì)土壤生物理化性質(zhì)的影響

施氮顯著影響土壤生物理化性質(zhì)（表1）。土壤有機(jī)碳、可溶性有機(jī)碳、全氮和NO3?-N 隨施氮量的增加呈上升趨勢(shì)；土壤碳氮比（C/N） 隨施氮量增加而降低。與N0 處理相比，N180 處理土壤有機(jī)碳和可溶性有機(jī)碳的上升幅度最高，分別提高13.0% （6.50 νs.7.35 g/kg） 和55.0% （22.43 νs. 34.87 mg/kg）；而N180 處理顯著降低C/N （13.0%）。N45、N90 與N135 處理下微生物量碳較N0 處理（112.96 mg/kg） 分別升高79.0% （202.58 mg/kg）、73.0% （195.65 mg/kg）和107.0% （234.00 mg/kg）。土壤微生物活性（土壤呼吸量） 隨著施氮量的增加而增加，與N0 相比，N45、N135、N90、N180 處理分別提高18.0%、29.1%、35.4%、47.6%；施氮使木糖苷酶活性提高了13.5%～39.3%，纖維二糖水解酶活性提高了50.3%～126.8%（圖1）。施氮使土壤pH 顯著降低。

2.2 施氮對(duì)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及功能的影響

氮肥施用量影響細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，對(duì)真菌群落無(wú)顯著影響（圖2）。N45 和N180 處理顯著降低細(xì)菌豐富度（Chao1），分別降低4.0% 和12.3%。細(xì)菌多樣性（Shannon） 隨著施氮量的增加而降低，降低幅度為1.6%～1.8%，其中N180 處理的降幅達(dá)到顯著性水平。對(duì)于群落結(jié)構(gòu)而言，長(zhǎng)期施氮改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且施氮量之間存在顯著差異，但真菌群落結(jié)構(gòu)在各施氮量間無(wú)顯著差異（圖3）。與N0 處理相比，施氮量越高對(duì)細(xì)菌的影響越大（圖4、圖5），N180 處理顯著降低變形菌門(mén)（Proteobacteria，2.4%～16.4%），芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes，2.1%～26.3%），擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，24.1%～50.0%），增加放線菌門(mén)（Actinobacteria，10.4%～34.7%） 和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria，37.8%～54.1%）及綠灣菌門(mén)（Chloroflexi，14.3%～28.6%） 的相對(duì)豐度。與細(xì)菌相比，真菌受氮肥影響較弱，不同施氮量之間對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響差異不大。施氮顯著提高子囊菌門(mén)（Ascomycota，8.3%～73.8%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，29.4%～58.8%）、傘菌綱（Agaricomycetes，44.4%～88.9%） 和銀耳綱（Tremellomycetes，18.2%～45.5%） 的相對(duì)豐度。此外，施氮也顯著影響了參與碳氮循環(huán)過(guò)程的相關(guān)功能菌的豐度。化能異養(yǎng)、好氧化能異養(yǎng)等功能菌豐度占據(jù)總功能菌豐度的30% 左右，且在不同施氮量處理中相對(duì)豐度變化存在差異，其中硝化作用菌豐度（14.3%～39.6%）、好氧氨氧化功能菌豐度（25.1%～48.2%） 和芳香烴降解功能菌豐度隨著施氮量的增加而升高（圖6）。

3 討論

施氮對(duì)細(xì)菌和真菌多樣性的影響存在差異。長(zhǎng)期施氮顯著降低了細(xì)菌的多樣性和豐富度，但施氮條件下真菌的多樣性和豐富度并無(wú)顯著變化（圖2）。其原因可能與細(xì)菌比真菌具有更強(qiáng)的生境關(guān)聯(lián)性有關(guān)，而真菌具有更強(qiáng)的抵抗外界干擾的能力[29]。本研究中，施氮使土壤NO3?-N 含量從1.38 mg/kg 增加到1.78～2.25 mg/kg，C/N 值從8.90 降低到8.64～7.74 （表1），刺激了特定微生物類群大量繁殖，從而縮小其他物種的生存空間[30]，這種競(jìng)爭(zhēng)排斥作用降低了細(xì)菌多樣性。其次，施氮促進(jìn)植物生長(zhǎng)，根系生物量從1.73 t/hm2 提高到2.32～2.98 t/hm2 （表1），土壤水分含量從39.40% 降低到38.45%～36.72%，降低了土壤中可利用底物的運(yùn)移，而真菌具有更寬的碳/氮養(yǎng)分化學(xué)計(jì)量適應(yīng)范圍和水分適應(yīng)性[31?32]。上述土壤理化性狀變化對(duì)真菌無(wú)顯著影響。Xing 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，施氮不僅提高細(xì)菌多樣性，而且也顯著增加真菌的多樣性。這可能與土壤養(yǎng)分的背景值存在較大差異有關(guān)，Xing 等[33]研究中的供試土壤有機(jī)碳（13.83 g/kg） 和全氮（1.98 g/kg） 顯著高于本研究的相應(yīng)值（土壤有機(jī)碳6.50 g/kg，全氮0.6 g/kg），因此施用氮肥后沒(méi)有造成養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)引起的多樣性降低。

施氮肥對(duì)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響也存在差異。細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)不僅因施氮而變化，并且還會(huì)因施氮量而改變，但真菌群落并不因施氮而變化（圖3～圖5）。細(xì)菌和真菌群落組成變化的差異源于對(duì)土壤環(huán)境變化的敏感性不同。已有土壤性質(zhì)變化對(duì)細(xì)菌影響更大的報(bào)道[34]，證實(shí)了本研究中細(xì)菌群落發(fā)生顯著變化而真菌群落無(wú)明顯變化的結(jié)論。細(xì)菌群落的變形菌門(mén)相對(duì)豐度隨著土壤可溶性有機(jī)碳升高而降低，而放線菌門(mén)豐度隨著土壤有機(jī)碳、可溶性有機(jī)碳和NO3?-N 的升高而升高。施氮條件下可溶性有機(jī)碳含量的大幅升高促進(jìn)了放線菌、厚壁菌和子囊菌等主要利用易分解有機(jī)碳組分的微生物的生長(zhǎng)[35?36]。但真菌因?qū)ν寥拉h(huán)境變化不敏感，所以群落組成的變化（子囊菌升高，擔(dān)子菌降低） 與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系不顯著（圖7）。

施氮顯著改善了木糖苷酶和纖維二糖水解酶等與碳氮循環(huán)過(guò)程相關(guān)的胞外酶活性。本研究中木糖苷酶和纖維二糖水解酶分別升高13.5%～39.3% 和50.3%～126.8%，這與施氮改變細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有關(guān)。施氮增加了酸桿菌、放線菌和子囊菌等具有編碼纖維素酶、半纖維素酶和木糖苷酶功能基因的微生物類群豐度[37]；隨之分泌更多木糖苷酶和纖維二糖水解酶，從而提高了土壤微生物中與碳循環(huán)相關(guān)的功能菌豐度（芳香烴降解）。但是，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，施氮降低了土壤微生物分解木質(zhì)素的功能菌豐度，這可能與施氮降低了傘菌目等含木質(zhì)素分解的基因的微生物類群豐度有關(guān)[38]。在本研究中施氮提高了含有木質(zhì)素水解酶基因的變形菌、擬桿菌、子囊菌等微生物類群豐度。

本研究明確了不同施氮量下土壤微生物的活性、群落結(jié)構(gòu)組成和功能的變化，從微生物的角度解釋了氮肥用量對(duì)黃土區(qū)土壤質(zhì)量的影響。未來(lái)的研究將從功能基因變化以及真菌與細(xì)菌之間的相互作用方面，進(jìn)一步解釋不同施氮量引起的微生物群落結(jié)構(gòu)變化的原因。

4 結(jié)論

在黃土高原地區(qū)，長(zhǎng)期施氮顯著提高了土壤微生物量和活性，改變了土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成，細(xì)菌較真菌對(duì)施氮的響應(yīng)更敏感。細(xì)菌多樣性和豐富度隨施氮量增加而顯著降低，群落結(jié)構(gòu)也因施氮發(fā)生改變，而真菌豐富度、多樣性對(duì)施氮量無(wú)響應(yīng)，真菌群落結(jié)構(gòu)在不同施氮量間無(wú)顯著差異。細(xì)菌群落組成的變化與土壤有機(jī)碳、可溶性有機(jī)碳和NO3?-N 含量呈顯著正相關(guān)，與全氮含量和C/N 呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，氮肥施用增加了土壤中與碳循環(huán)相關(guān)的功能菌豐度，促進(jìn)了木糖苷酶和纖維二糖水解酶的分泌。