安 瓊，魏 媛，李 倩，王江文，岳國(guó)仁，王貞香

（河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000）

新生兒高膽紅素血癥又稱新生兒黃疸，是新生兒常見(jiàn)的臨床問(wèn)題，我國(guó)高膽紅素血癥新生兒的發(fā)病率為50%～80%，該病由于膽紅素（主要指間接膽紅素（indirect bilirubin，IB））代謝異常，引起血中膽紅素水平升高，出現(xiàn)以皮膚、黏膜及鞏膜黃染為特征的癥狀。新生兒黃疸早期癥狀不明顯，后期出現(xiàn)典型的神經(jīng)功能異常，并留有后遺癥。因此盡早預(yù)測(cè)膽紅素對(duì)神經(jīng)組織的損傷有助于臨床預(yù)防膽紅素腦病的發(fā)生，對(duì)降低新生兒病死率及致殘率具有重要的意義[1-4]。

新生兒體內(nèi)膽紅素代謝主要經(jīng)肝臟代謝，而新生兒肝功能發(fā)育不完善，造成肝細(xì)胞攝取膽紅素的能力低下；并且新生兒酶系統(tǒng)不成熟，其中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶含量低且活力不足，不能有效地將IB與葡萄糖醛酸結(jié)合形成直接膽紅素（結(jié)合膽紅素）；新生兒膽紅素產(chǎn)生過(guò)多或其他陰離子含量增加都會(huì)引起膽紅素排泄發(fā)生障得，尤其是早產(chǎn)兒，會(huì)暫時(shí)出現(xiàn)肝內(nèi)膽汁淤積[5]。目前，對(duì)新生兒黃疸的治療主要是通過(guò)藥物治療、照射治療、換血治療等方法[6]。這些方法對(duì)新生兒黃疸有一定的療效，但對(duì)機(jī)體有一定的影響[7-8]。因此有必要探究治療新生兒黃疸的新方法。

蘋果是薔薇科落葉喬木的果實(shí)，原產(chǎn)于歐洲及亞洲中部，在我國(guó)遼寧、河北、甘肅、四川和西藏等地常見(jiàn)栽培[9]，廣受人們喜愛(ài)。在我國(guó)《名醫(yī)別錄》中記載，蘋果果實(shí)入藥[10]，其作為一種藥食兩用水果，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蘋果中含有大量的黃酮類、酚酸類和三萜類等生物活性物質(zhì)。黃酮類主要有黃酮類、黃酮醇類、黃烷醇類、花色苷類、查耳酮類等。目前，已從蘋果中發(fā)現(xiàn)黃酮類35 種，如兒茶素、表兒茶素、槲皮素等；酚酸類21 種，如對(duì)香豆?？崴?、奎尼酸、綠原酸、咖啡酸等；三萜類24 種，如熊果酸、β-谷甾醇等。這些生物活性成分使蘋果具有多種藥理活性，但是對(duì)于蘋果是否對(duì)膽紅素的代謝有影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它可預(yù)測(cè)中藥活性成分和其作用機(jī)制，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”的作用網(wǎng)絡(luò)，為疾病作用機(jī)制的研究、新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)[11]。因此，本研究采用中藥復(fù)方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，預(yù)測(cè)蘋果活性成分與高膽紅素血癥的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，探究蘋果活性成分的作用靶點(diǎn)與高膽紅素血癥患者內(nèi)源性蛋白和信號(hào)通路之間的作用關(guān)系。并用分子對(duì)接驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析的可靠性，然后用制備的蘋果醇提取物干預(yù)溶血性黃疸大鼠模型，測(cè)定總膽紅素（total bilirubin，TB）、IB等相關(guān)指標(biāo)，探究蘋果對(duì)溶血致高膽紅素血癥代謝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SD（SPF級(jí)）雄性大鼠60 只，體質(zhì)量180～220 g。每籠3～4 只，飼養(yǎng)在室溫（24±1）℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。所有動(dòng)物研究均按照天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理委員會(huì)制定的指南進(jìn)行，整個(gè)項(xiàng)目方案由南開大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（津）2019-0003。

成熟的鮮蘋果品種為市售靜寧紅富士。

茵梔黃口服液（10 mL/支，含黃芩苷0.4 g）北京華潤(rùn)高科天然藥物有限公司；鹽酸苯肼 上海麥克林生物科技有限公司；氯化鈉注射液 華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司；75%醫(yī)用酒精 德州綠海醫(yī)療科技有限公司；碘伏消毒液 蘭州美爾康生物科技有限公司；甲醛 天津市百世化工有限公司；伊紅染液、蘇木精 珠海貝索生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；槲皮素對(duì)照品、沒(méi)食子酸對(duì)照品、表兒茶素對(duì)照品、根皮素對(duì)照品、β-谷甾醇對(duì)照品、白細(xì)胞介素-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試（interleukin-6 enzyme-linked immunosorbent assay，IL-6 ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒 上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

一次性使用負(fù)壓采血容器 山東省成武縣醫(yī)用制品廠；H12型血紅蛋白（hemoglobin，HB）分析儀 桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司；BCD-610普通冰箱 美的集團(tuán)；半自動(dòng)石蠟切片機(jī)、組織脫水處理機(jī)、自動(dòng)組織包埋機(jī) 德國(guó)SLEE公司；微量移液器 德國(guó)Sartorius公司；802B離心機(jī)無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司；高溫高壓滅菌鍋日本SANYO公司；干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；1681130酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；7600S全自動(dòng)生化分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果活性成分與靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)CNKI、PubMed查閱文獻(xiàn)資料搜集蘋果的活性組分，在本草組鑒、ECTM、Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swissadme.ch/）中輸入相關(guān)化合物的Canonical SMILES，選取胃腸吸收度高、類藥性優(yōu)的化合物作為目標(biāo)化合物，然后在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch./）中輸入目標(biāo)化合物的Canonical SMILES號(hào)，選擇物種為“Homo Sapiens”，篩選其中probability＞0.7的靶點(diǎn)為蘋果活性成分的目標(biāo)靶點(diǎn)[12]。

1.3.2 溶血所致高膽紅素血癥靶點(diǎn)的篩選

以“Hyperbilirubinemia”“Hemolytic jaundice”為檢索詞，分別從GeneCards、Drugbank、Therapeutic Target Database、OMIM等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得治療溶血所致高膽紅素血癥的作用靶點(diǎn)。

1.3.3 蘋果活性成分與溶血所致高膽紅素血癥網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

用Venny2.1.0在線軟件尋找蘋果活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的共同作用靶點(diǎn)，并繪制蘋果活性成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的Venn圖；將獲得的共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索篩選并且分析獲得的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，然后用Cytoscape 3.9.1軟件分析獲得網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3.4 核心靶點(diǎn)的基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

將1.3.3節(jié)中獲得的蘋果活性成分和疾病的共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG的富集分析。用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，分析潛在靶標(biāo)的相互作用。

1.3.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

根據(jù)蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果及潛在靶標(biāo)相互作用，分別篩選網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的活性成分和重要的潛在靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接。通過(guò)PubChem網(wǎng)站（http://zinc.docking.org/）獲取小分子的2D結(jié)構(gòu)，利用ChemBio3D軟件將其轉(zhuǎn)化為mol2文件備用；在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）查詢并獲取靶標(biāo)的3D結(jié)構(gòu)，用PyMOL軟件取小分子、加氫后保存?zhèn)溆?。將小分子和靶蛋白?shù)據(jù)導(dǎo)入Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，獲得對(duì)接結(jié)合能、氫鍵等信息，以此評(píng)價(jià)活性成分和潛在靶標(biāo)相互結(jié)合的穩(wěn)定性和網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果的可靠性。

1.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 蘋果醇提取物（apple alcohol extract，AE）的制備

稱取適量蘋果放入榨汁機(jī)中打碎，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液按液料比1∶1（mL/g）回流提取1.5 h，提取2 次，合并濾液補(bǔ)足質(zhì)量，用0.20 μm的濾膜過(guò)濾，采用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法，用高效液相色譜進(jìn)樣分析。采用Intersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。沒(méi)食子酸、表兒茶素、根皮素、槲皮素的分析采用程序1：檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的磷酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～10%A，95%～90% B；10～13 min，10%～67% A，90%～33% B；13～20 min，67%～61%A，3 3%～3 9% B；20～40 min，61%～55% A，39%～45% B。β-谷甾醇采用程序2：檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（體積比為98∶2），等度洗脫。進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，按制備方法同比例增加液料比，對(duì)獲得的提取液濃縮至所需濃度。

1.3.6.2 造模、分組與給藥

取SD雄性大鼠60 只，隨機(jī)分為6 組：空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（茵梔黃注射液）、AE低劑量干預(yù)組、中劑量干預(yù)組、高劑量干預(yù)組，每組10 只。參考楊李等[13]的方法，連續(xù)兩天以腹腔注射鹽酸苯肼建立溶血性高膽紅素血癥大鼠模型，初次注射量為50 mg/kgmb，第2次注射劑量減半，每天一次；在末次注射24 h后進(jìn)行干預(yù)。陽(yáng)性對(duì)照組給予茵梔黃注射液1.2 mL/kgmb，AE低劑量組40 g/kgmb，AE中劑量組80 g/kgmb，AE高劑量組160 g/kgmb，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水，每天一次，在干預(yù)過(guò)程中，取大鼠尾尖血，用HB儀測(cè)定HB水平。干預(yù)3 d后，腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，心臟采血，用重氮試劑法測(cè)定TB和IB水平，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）水平，用試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-6水平。切取肝左葉相同部位肝組織約2 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，在10%福爾馬林溶液中浸泡24 h，用小流水沖洗24 h，待組織固定完全后（沒(méi)有紅色或淡紅色的組織），取出用于蘇木精-伊紅染色[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果的活性成分

根據(jù)1.3.1節(jié)搜集整理蘋果成分的方法，獲得化學(xué)成分共44 個(gè)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選符合胃腸吸收度高、類藥性優(yōu)的化合物，確定17 個(gè)成分為蘋果的主要活性成分，具體信息見(jiàn)表1。

表1 蘋果的主要活性成分Table 1 Major active components of apples

2.2 蘋果活性成分潛在的靶標(biāo)

通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)查詢17 個(gè)化合物的成分靶標(biāo)，整理獲得288 個(gè)蘋果醇提物的成分靶標(biāo)。將蘋果活性成分的靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)通過(guò)Venny 2.1.0在線軟件取交集，獲得蘋果活性成分治療溶血性高膽紅素血癥的潛在靶標(biāo)81 個(gè)，如圖1所示。

圖1 蘋果活性成分靶標(biāo)與溶血所致高膽紅素血癥疾病靶標(biāo)交集后的Venn圖Fig.1 Venn diagram of the intersection between the targets of active ingredients in apples and those of hemolysis-induced hyperbilirubinemia

2.3 蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將2.2節(jié)獲得的潛在靶標(biāo)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“Multiple protein”“Homo sapiens”，設(shè)置置信水平為0.700，隱藏沒(méi)有關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)，涉及122 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中靶標(biāo)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、酪氨酸激酶（tyrosine kinase，SRC）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer andactivator of transcription 3，STAT3）、熱休克蛋白90A1（heat shock protein 90A1，HSP90A1）、早期原癌基因JUN、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）在網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)最大，顏色最深（圖2），可能與蘋果治療溶血所致高膽紅素血癥密切相關(guān)。

圖2 治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of potential target interaction for the treatment of hemolysis-induced hyperbilirubinemia

2.4 蘋果活性成分潛在靶標(biāo)KEGG與GO富集結(jié)果

將81 個(gè)潛在靶點(diǎn)通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG分析，獲得81 條信號(hào)通路，-lgP越大則表明富集的程度越高[15]。取KEGG分析的前20具體信號(hào)通路信息，結(jié)果見(jiàn)圖3。蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶點(diǎn)主要富集在膽汁分泌、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路等相關(guān)通路。

圖3 蘋果治療高膽紅素血癥潛在靶標(biāo)的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of potential targets of apples for the treatment of hyperbilirubinemia

由圖4可知，蘋果活性成分與溶血所致高膽紅素血癥潛在靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞前沿、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、細(xì)胞外膜等細(xì)胞組分中；蘋果的活性成分可能通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合，激活跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，與泛素-類蛋白連接酶結(jié)合等方式，參與細(xì)胞遷移正向運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)控、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、上皮細(xì)胞增殖調(diào)控、血管生成等生物過(guò)程，從而發(fā)揮蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥的作用。

圖4 蘋果治療高膽紅素血癥潛在靶標(biāo)的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets of apples for the treatment of hyperbilirubinemia

2.5 蘋果“疾病-通路-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建結(jié)果

蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)結(jié)果如圖5所示，圖中紅色三角形代表藥物，深藍(lán)色四邊形代表疾病，綠色橢圓形代表活性成分，紫色六邊形代表通路，粉色正方形代表靶點(diǎn)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析中度值標(biāo)識(shí)節(jié)點(diǎn)的大小評(píng)估貢獻(xiàn)，節(jié)點(diǎn)越大，所起的貢獻(xiàn)越大。在蘋果的17 個(gè)活性成分中，其中PG4（槲皮素：101）、PG11（2α-羥基熊果酸：74）、PG12（β-谷甾醇：56）、PG3（根皮素：47）、PG2（表兒茶素：45）在治療溶血所致高膽紅素血癥中起重要的作用。

圖5 蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)Fig.5 Disease-pathway-active component-target network for apples

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

在2.5節(jié)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中，網(wǎng)絡(luò)中度值篩選排名前5的活性成分（槲皮素、2α-羥基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表兒茶素）分別與網(wǎng)絡(luò)中較為重要的潛在靶標(biāo)（AKT1、VEGFA、EGFR、STAT3、SRC）進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)分子對(duì)接可以驗(yàn)證上述網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果的可靠性。結(jié)合能小于-1.2 kcal/mol，表示活性成分和靶標(biāo)結(jié)合良好；結(jié)合能大于-4.0 kcal/mol時(shí)，表示活性成分和靶標(biāo)有較強(qiáng)的結(jié)合能力[16]。從表2可以看出，蘋果篩選的活性成分和獲得的治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶標(biāo)有較強(qiáng)的親和能力，選擇這5 種活性成分與潛在靶標(biāo)分子結(jié)合最穩(wěn)定的對(duì)接結(jié)果繪制分子對(duì)接圖（圖6）。

圖6 蘋果活性成分與潛在靶標(biāo)分子部分對(duì)接Fig.6 Molecule docking diagrams of active components in apples with potential targets

表2 蘋果活性成分與潛在靶標(biāo)分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Molecules docking results of potential targets with active components of apples

2.7 AE成分分析

根據(jù)1.3.6.1節(jié)的方法及條件對(duì)樣品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，沒(méi)食子酸、表兒茶素、根皮素、槲皮素、β-谷甾醇能得到較好的分離，結(jié)果如圖7所示。

圖7 對(duì)照品色譜圖Fig.7 Chromatogram of references

2.8 AE干預(yù)溶血所致高膽紅素血癥大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖8所示，空白組大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好、毛色有光澤、尾部紅潤(rùn)，尿液略顯淺黃色；模型組大鼠反應(yīng)遲鈍、尾部成灰黃色、毛色晦暗、眼睛灰黃，尿液呈深黃色。

圖8 造模后與造模前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較Fig.8 Comparison of normal and hyperbilirubinemic rats

如表3所示，與空白組比較，模型組的HB水平均明顯降低（P＜0.01），TB、IB、ALT、AST水平均明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、AE高劑量組、AE中劑量組、AE低劑量組的HB水平均升高（P＜0.05），TB、IB、ALT、AST水平均顯著或極顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。肝臟組織染色結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 肝臟組織病理切片結(jié)果Fig.9 Pathological sections of liver tissues

表3 大鼠血液中HB、TB、IB、ALT、AST的指標(biāo)（n＝12）Table 3 Levels of HB,TB,IB,ALT and AST in the serum of rats (n=12)

如表4所示，與空白組比較，模型組的血液TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、AE高劑量組、AE中劑量組、AE低劑量組的TNF-α、IL-6水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 大鼠血液中的指標(biāo)TNF-α、IL-6水平（n＝12）Table 4 Levels of TNF-α and IL-6 in the serum of rats (n=12)

3 討論與結(jié)論

有研究表明，蘋果多酚可通過(guò)清除自由基抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)與再生，從而起到保肝利膽的作用[17-18]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，篩選出17 個(gè)符合胃腸吸收度高、類藥性優(yōu)的蘋果活性成分。其中槲皮素、2α-羥基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表兒茶素在治療溶血所致高膽紅素血癥起重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗衰老等生物活性[19]，從而能夠發(fā)揮抗溶血性黃疸的作用；槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗衰老、提高免疫力、抗肝病等作用[20]，故有助于溶血性黃疸的治療；表兒茶素具有抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、預(yù)防非酒精性脂肪肝和抗肝纖維化[21]，從而發(fā)揮抗溶血性黃疸的作用。

溶血所致高膽紅素血癥與蘋果活性成分的交集靶點(diǎn)有81 個(gè)，中度值排名前5的關(guān)鍵靶點(diǎn)為AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3。AKT1參與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol kinase 3，PI3K）、EGFR等多個(gè)通路，在炎癥、細(xì)胞增殖、遷移和纖維形成的肝損傷過(guò)程中起著獨(dú)特的作用[22]。VEGFA的表達(dá)可以促進(jìn)血管形成，在肝臟的再生和修復(fù)過(guò)程中起重要作用[23]。

GO的富集分析預(yù)測(cè)蘋果的活性成分可能通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合，激活跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，與泛素-類蛋白連接酶結(jié)合等方式，參與細(xì)胞遷移正向調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)控、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、上皮細(xì)胞增殖調(diào)控、血管生成等生物過(guò)程，從而發(fā)揮蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥的作用。

KEGG分析核心靶點(diǎn)通過(guò)膽汁分泌、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等通路發(fā)揮治療作用；有研究顯示，炎癥介質(zhì)既可作為NF-κB信號(hào)通路的靶向基因，又可激活NF-κB信號(hào)通路，當(dāng)肝臟損傷時(shí)，NF-κB信號(hào)通路可參與調(diào)控炎癥因子的產(chǎn)生主要信號(hào)通路[24-25]。有大量研究表明，NF-κB信號(hào)通路可被TNF-α、IL-1β等因子誘導(dǎo)激活，因此可通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β、IL-16等炎癥因子的表達(dá)，下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)蛋白改善肝臟損傷[26-27]。HIF-1的表達(dá)受氧濃度的影響，可通過(guò)調(diào)控下游蛋白，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程，作為內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的始動(dòng)因子和共同途徑。HIF-1與PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)系密切。有研究表明，右美托咪定可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路減少梗阻性黃疸的肝細(xì)胞凋亡[28-29]。

蘋果中篩選的活性指標(biāo)槲皮素、2α-羥基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表兒茶素分別和中度值排名前5的關(guān)鍵核心靶標(biāo)（AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3）進(jìn)行分子對(duì)接，大部分對(duì)接結(jié)果的結(jié)合能小于-4.0 kcal/mol，這表明蘋果篩選的活性成分和獲得的治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶標(biāo)有較強(qiáng)的親和能力。AE中有槲皮素、表兒茶素、根皮素、β-谷甾醇等活性組分，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，這些組分對(duì)溶血所致高膽紅素血癥起重要作用。

鹽酸苯肼進(jìn)入腹腔吸收入血后，能迅速與HB形成高鐵血紅蛋白并生成海因茲小體；生成的海因茲小體沉積在細(xì)胞膜上，使其流動(dòng)性下降、滲透性增加，并可裂解部分細(xì)胞膜功能，導(dǎo)致溶血發(fā)生[30]，而鹽酸苯肼本身并無(wú)明顯神經(jīng)毒性，故能較好地模擬新生兒溶血致高膽紅素血癥的生理過(guò)程。在人體中，膽紅素主要經(jīng)人體的肝臟代謝，代謝的過(guò)程中需要多種酶的參與完成。當(dāng)患高膽紅素血癥時(shí)，體內(nèi)三磷酸腺苷的活性和心肌細(xì)胞對(duì)氧的攝取受到抑制，導(dǎo)致大量氧自由基堆積，可造成心肌損傷[31]；ALT和AST是肝細(xì)胞受損、心肌受損的標(biāo)志，因此造模成功后大鼠的HB水平下降，TB、IB、ALT、AST的水平升高；肝組織病理切片顯示，模型組出現(xiàn)淤血和點(diǎn)狀壞死，其炎癥因子TNF-α、IL-6水平增高。用茵梔黃注射液和AE干預(yù)后HB水平升高，其他指標(biāo)下降，肝細(xì)胞輕度水腫。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明茵梔黃注射液和AE對(duì)溶血所致的高膽紅素血癥有治療作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了蘋果治療溶血所致高膽紅素血癥可能的活性成分、疾病靶點(diǎn)及通路、篩選的指標(biāo)性成分與蛋白的相互作用，AE對(duì)溶血所致高膽紅素血癥有治療作用，所得結(jié)果為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)、臨床研究提供了理論方向。但對(duì)于關(guān)鍵蛋白、預(yù)測(cè)的信號(hào)通路還需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。