邵瑞婷，丁學(xué)妍，姜 潔

（北京市食品檢驗研究院（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心），國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗室（食品安全重大綜合保障關(guān)鍵技術(shù)），北京 100041）

“三高癥”指高血壓、高血糖和高脂血癥?，F(xiàn)在已經(jīng)成為威脅人們身體健康的常見疾病[1]。“三高”癥狀既可能單獨(dú)存在，又常相互關(guān)聯(lián)，只要出現(xiàn)其中任何一種，后期都易形成“三高癥”[2-3]。為了降低患病概率，聲稱具有輔助調(diào)節(jié)“三高”功效的保健食品受到人們的追捧。不法分子為增強(qiáng)“療效”，向其中添加藥物，這些藥物的攝入可能會對人們的身體健康造成不可逆的危害[4-5]。

近幾年，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局連續(xù)頒布了補(bǔ)充檢驗方法和批準(zhǔn)件，針對“三高”的6 個官方標(biāo)準(zhǔn)中收載了28 種常見的降血壓、降血糖以及降血脂藥物[6-11]，鑒于治療“三高癥”的藥物使用品種增多，部分熟悉檢測標(biāo)準(zhǔn)、通曉藥理藥效的不法分子為了逃避監(jiān)管，存在添加非規(guī)定檢測標(biāo)準(zhǔn)涵蓋藥物的情況，同時鑒于補(bǔ)充檢驗方法中，藥物覆蓋面欠缺的問題，堅持以問題為導(dǎo)向，有必要根據(jù)藥物的療效，擴(kuò)充“三高癥”治療的常見化學(xué)藥物的高通量檢測方法，最大可能性避免漏檢，一定程度上擴(kuò)大對違法添加化學(xué)藥品的打擊面[12-13]。

本研究將上述原國家食品藥品監(jiān)督管理總局連續(xù)頒布的補(bǔ)充檢驗方法和批準(zhǔn)件的化學(xué)藥品納入同一方法進(jìn)行研究，并另選取文獻(xiàn)報道有檢出或者根據(jù)藥品療效及可獲得性、添加可能性較大的化學(xué)藥品總計59 種進(jìn)行同時測定研究。包括降高血壓藥物：布美他尼、吲達(dá)帕胺、妥拉唑林、酚妥拉明、育亨賓、哌唑嗪、特拉唑嗪、卡托普利、可樂定、阿替洛爾、硝苯地平、尼群地平、非洛地平、尼索地平、氨氯地平、尼莫地平、利血平、普萘洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、倍他洛爾、納多洛爾、卡維地洛、依普沙坦、厄貝沙坦、頡沙坦、坎替沙坦、莫西普利、替米沙坦、氯噻嗪、氫氯噻嗪、呋塞米、普伐他汀[14-15]；降血糖類藥物：二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、苯扎貝特、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、瑞格列奈、格列美脲、格列苯脲、格列喹酮、格列吡嗪、維達(dá)他汀、西他列汀、氯磺丙脲[16-17]；降血脂類藥物：煙酸、非諾貝特、洛伐他汀、辛伐他汀、脫羥基洛伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽、阿伐他汀鈣鹽、西立伐他汀鈉鹽[18-19]。前期通過檢索文獻(xiàn)可知，針對食品中違法添加的檢測方法主要有拉曼法[20]、毛細(xì)管電泳法[21]、熒光光譜法[22]、近紅外光譜法[23]、氣相色譜-質(zhì)譜法[24]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[25]、高效薄層色譜法[26]、高效液相色譜法[27-28]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[29-30]等?；谝合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用法較好的定性、定量能力，其在多組分農(nóng)殘和獸殘檢測中已得到廣泛應(yīng)用，建立了多項食品檢測國家標(biāo)準(zhǔn)[31-32]。而其在保健食品非法添加檢測上未有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)支持，為便于開展多組分非法添加藥物檢測，本研究旨在建立一個高效、快速的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，以期實(shí)現(xiàn)59 種違法添加“三高”類藥物的同時檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5982-4921 QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）管、5982-0028 QuEChERS管、5982-5122 QuEChERS管、Agilent 0.2 μm微孔濾膜（聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE））、0.2 μm微孔濾膜（尼龍）美國Agilent公司；Titan3 0.2 μm微孔濾膜（PTFE）、Titan3 0.2 μm微孔濾膜（尼龍）美國Thermo Fisher Scientific公司；聚丙烯（GH polypro，GHP）0.2 μm微孔濾膜 美國Waters公司；Agela 0.22 μm微孔濾膜（尼龍）天津Agela公司；xiboshi 0.20 μm微孔濾膜（尼龍）天津市希波氏科技有限公司；Jinteng 0.22 μm微孔濾膜（尼龍）天津市津騰實(shí)驗設(shè)備有限公司。

乙腈、甲醇、乙酸銨（均為色譜純）美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸（質(zhì)譜級）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；煙酸、非諾貝特、洛伐他汀、辛伐他汀、脫羥基洛伐他汀、美伐他汀、阿伐他汀鈣鹽、西立伐他汀鈉鹽、二甲雙胍、丁二胍、苯扎貝特、格列齊特、吡格列酮、維達(dá)他汀、西他列汀、氯磺丙脲、布美他尼、吲達(dá)帕胺、妥拉唑林、酚妥拉明、哌唑嗪、卡托普利、可樂定、阿替洛爾、硝苯地平、尼群地平、非洛地平、尼索地平、氨氯地平、尼莫地平、普萘洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、倍他洛爾、納多洛爾、卡維地洛、依普沙坦、厄貝沙坦、頡沙坦、坎替沙坦、莫西普利、替米沙坦、氯噻嗪、氫氯噻嗪、呋塞米、普伐他汀（100 μg/mL）、洛伐他汀羥酸鈉鹽（純度98%）、苯乙雙胍（純度98%）、甲苯磺丁脲（純度99.9%）、羅格列酮（純度98%）、格列波脲（純度99.1%）、瑞格列奈（純度99.9%）、格列美脲（純度99.7%）、格列喹酮（純度98%）、格列吡嗪（純度98%）、利血平（純度99.4%）天津阿爾塔科技有限公司；格列苯脲（純度99%）、鹽酸育亨賓（純度99.4%）標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；特拉唑嗪（純度98%）標(biāo)準(zhǔn)品 德國Sigma-Aldrich公司；合輝安泰片（葡萄味）東營大振生物工程有限公司；口服液 上海大正力保健有限公司；茶包 北京同仁堂興安保健科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTMTQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀美國Waters公司；均質(zhì)器 德國IKA公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；超聲波提取儀 中國五洲東方公司；萬分之一電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

精確稱取各類固體標(biāo)準(zhǔn)品適量、精密量取各類液體標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解、混勻并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光、-18 ℃保存。

精密吸取各類外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇定容至10 mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中非諾貝特、洛伐他汀、辛伐他汀、苯扎貝特、布美他尼、吲達(dá)帕胺、酚妥拉明、育亨賓、哌唑嗪、特拉唑嗪的質(zhì)量濃度為1 μg/mL；煙酸、脫羥基洛伐他汀、美伐他汀、阿伐他汀鈣鹽、西立伐他汀鈉鹽、二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、瑞格列奈、格列美脲、格列苯脲、格列喹酮、格列吡嗪、維達(dá)他汀、西他列汀、卡托普利、可樂定、阿替洛爾、硝苯地平、尼群地平、非洛地平、尼索地平、氨氯地平、尼莫地平、利血平、普萘洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、倍他洛爾、納多洛爾、卡維地洛、依普沙坦、厄貝沙坦、頡沙坦、坎替沙坦、莫西普利、替米沙坦的質(zhì)量濃度為2 μg/mL；氯噻嗪、氫氯噻嗪、呋塞米、氯磺丙脲、普伐他汀的質(zhì)量濃度為5 μg/mL；妥拉唑林的質(zhì)量濃度為4 μg/mL；脫羥基洛伐他汀的質(zhì)量濃度為50 μg/mL。避光、-18 ℃保存。

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL用甲醇定容至10 mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL，于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度線，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，混勻，備用。

1.3.2 樣品前處理

稱取0.5 g試樣（精確0.01 g）置于10 mL具塞玻璃比色管中，加入8 mL甲醇，渦旋振蕩，超聲提取20 min，冷卻至室溫后，用甲醇定容至刻度線，搖勻，取5 mL提取液于10 mL塑料離心管中，以10 000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液過QuEChERS管凈化，收集1 mL凈化液，氮吹至近干，用1 mL 40%甲醇溶液復(fù)溶，過0.2 μm PTFE濾膜后進(jìn)行儀器檢測。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：稱取8 份0.5 g（精確0.01 g）的同一試樣，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mL，采用與試樣相同的前處理方法，得到基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，備用。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A相為乙腈、B相為0.1%甲酸溶液（5 mmol/L乙酸銨溶液）；梯度洗脫程序：0～1 min，5% A、95% B；1～2 min，5%～30% A、95%～70% B；2～5 min，30%～90% A、70%～10% B；5～6.5 min，90% A、1 0% B；6.5～8 min，9 0%～5% A、10%～95% B；8～10 min，5% A、95% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：650 L/h；錐孔氣流速：150 L/h；碰撞氣流速：0.15 mL/min。其他質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

表1 59 種非法添加藥物質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for detection of 59 illegally added drugs

1.3.4 條件優(yōu)化

1.3.4.1 定容液的選擇

本研究以體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇溶液以及甲醇作為定容液，考察定容液對目標(biāo)物的影響。分別吸取定容液0.95 mL置于2 mL玻璃瓶中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05 mL，渦旋振蕩后供儀器檢測。

1.3.4.2 超聲時間優(yōu)化

稱取5 個0.5 g陰性片劑樣品置于10 mL玻璃具塞比色管中，渦旋振蕩，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.2 mL，加入8 mL甲醇溶液，渦旋混勻后，分別超聲提取10、20、30、40、50 min，冷卻至室溫后，定容至10 mL，取1 mL提取液氮吹至近干，用1 mL 40%甲醇溶液復(fù)溶后，以12 000 r/min離心5 min，取上清液供儀器檢測，用以考察超聲時間對目標(biāo)物提取效果的影響。

1.3.4.3 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）評估

采用下式對59 種化合物的ME進(jìn)行評價[33]：

1.3.4.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

考慮到離子掃描模式對目標(biāo)物響應(yīng)的影響，將混合標(biāo)準(zhǔn)使用液不接色譜柱直接注射，在正離子（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式。經(jīng)實(shí)驗考察，本研究選取正、負(fù)離子模式，并結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測模式采集目標(biāo)化合物的離子信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用TQ-XS MassLynx軟件進(jìn)行質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)采集和處理，采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 定容液的選擇

本研究對比5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇溶液以及甲醇作為定容液分離脫羥基洛伐他汀、氯噻嗪的效果，結(jié)果見圖1，以40%甲醇溶液作為定容液時，59 種非法添加藥物能夠更好地分離，峰型尖銳，且響應(yīng)值更高，其中，脫羥基洛伐他汀在低于40%甲醇溶液作為定容液時響應(yīng)值及峰型差異性顯著，高于40%甲醇溶液后無明顯差異；氯噻嗪在高于40%甲醇溶液后，隨著有機(jī)相比例升高峰型變差，而低于40%甲醇溶液時無明顯變化。故本研究中，選取40%甲醇溶液作為定容液。

圖1 不同定容液條件下脫羥基洛伐他?。╝）、氯噻嗪（b）離子色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of dihydroxylovastatin (a) and chlorthiazide (b) at different final solution volumes

2.2 微孔濾膜的選擇

分別吸取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液通過Titan3 PTFE、Titan3尼龍、GHP、Agela尼龍、Agilent PTFE、Agilent尼龍、xiboshi尼龍、Jinteng尼龍濾膜后進(jìn)行儀器檢測，通過8 種微孔濾膜后59 種非法添加藥物的回收率分別在＜60%、60%～120%、＞120% 3 種范圍的數(shù)量占比如圖2所示，采用Titan3 PTFE濾膜各物質(zhì)回收率在60%～120%范圍的占比最高。故在本研究中，選取Titan3 PTFE濾膜作為微孔濾膜。

圖2 不同微孔濾膜對59 種非法添加藥物的回收率范圍占比Fig.2 Recoveries of 59 illegally added drugs with different microporous membranes

2.3 超聲時間的選擇

如圖3所示，各組分在20 min的提取回收率相對較高，繼續(xù)延長超聲時間，無法進(jìn)一步顯著提升目標(biāo)物回收率，反而大多數(shù)目標(biāo)物的回收率會持平或降低，故本研究超聲時間選擇20 min。

圖3 不同超聲時間條件下59 種非法添加藥物的回收率Fig.3 Recoveries of 59 illegally added drugs under different sonication time conditions

2.4 凈化柱的選擇

ME是指樣品中除了目標(biāo)分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響。本研究主要針對口服液、片劑、茶包等成分復(fù)雜的保健食品，樣品可能存在較強(qiáng)的ME。一般而言，當(dāng)ME在80%～120%之間時，ME不明顯，在實(shí)際檢測中可忽略不計；反之則應(yīng)考慮ME的影響。以口服液樣品為例，59 種非法添加藥物在樣品中的ME分布情況如圖4a所示，多種化合物檢測受到ME的影響較大。為降低ME的影響，本研究通過對樣品提取液進(jìn)行凈化，選取便于批量操作、成本較低且普適性強(qiáng)的QuEChERS凈化法[34]，比較了5982-4921、5982-0028、5982-5122 3 種成品QuEChERS管對59 種非法添加藥物的凈化效果，結(jié)果見圖5。5982-0028管、5982-5122管對洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽等凈化效果均不理想；5982-4921管對59 種非法添加藥物凈化回收率均在70%～147.5%。故本實(shí)驗選用5982-4921 QuEChERS管對提取液進(jìn)行凈化處理，凈化后ME分布情況如圖4b所示，ME有明顯改善，但依舊明顯，為了能更準(zhǔn)確地測定目標(biāo)化合物，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步降低ME，如圖4c所示，ME得到明顯改善。

圖4 不同處理后口服液樣品中59 種非法添加藥物的MEFig.4 ME of 59 illegally added drugs in oral liquid samples after different treatments

圖5 不同凈化柱對59 種非法添加藥物回收率的影響Fig.5 Effect of clean-up columns on recoveries of 59 illegally added drugs

2.5 色譜條件的優(yōu)化

2.5.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

如表1所示，氯磺丙脲、氯噻嗪、氫氯噻嗪、呋塞米、普伐他汀在負(fù)離子模式下離子化效率較高，靈敏度較好；其他54 種化合物均在正離子模式下，離子化效率較高，靈敏度較好。

2.5.2 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗比較了ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱和ACQUITY BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱在相同參數(shù)條件下以特拉唑嗪、苯乙雙胍、煙酸為例的離子色譜圖，如圖6所示，BEH C18色譜柱拖尾現(xiàn)象明顯，且無法實(shí)現(xiàn)多種化合物的基線分離；而HSS T3色譜柱的峰形尖銳，且分離效果明顯優(yōu)于BEH C18色譜柱。故在本實(shí)驗中選擇HSS T3色譜柱。

圖6 不同色譜柱條件下特拉唑嗪、苯乙雙胍、煙酸的離子色譜圖Fig.6 Ion chromatograms of 59 illegally added drugs on different columns

2.6 方法學(xué)實(shí)驗

2.6.1 檢出限、定量限與線性范圍

以待測化合物定性離子對的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比大于或等于3確定方法檢出限，以定量離子對的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比大于或等于10確定方法定量限。如表2所示，59 種非法添加藥物在線性范圍內(nèi)關(guān)系良好，決定系數(shù)（R2）均大于0.980，能滿足定量分析的要求。對于非諾貝特、洛伐他汀、辛伐他汀、苯扎貝特、布美他尼、吲達(dá)帕胺、酚妥拉明、育亨賓、哌唑嗪、特拉唑嗪線性范圍為0.25～10 ng/mL，檢出限（limit of detection，LOD）為5 μg/kg，定量限（limit of quantitation，LOQ）為10 μg/kg；煙酸、脫羥基洛伐他汀、美伐他汀、阿伐他汀鈣鹽、西立伐他汀鈉鹽、二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、瑞格列奈、格列美脲、格列苯脲、格列喹酮、格列吡嗪、維達(dá)他汀、西他列汀、卡托普利、可樂定、阿替洛爾、硝苯地平、尼群地平、非洛地平、尼索地平、氨氯地平、尼莫地平、利血平、普萘洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、倍他洛爾、納多洛爾、卡維地洛、依普沙坦、厄貝沙坦、頡沙坦、坎替沙坦、莫西普利、替米沙坦線性范圍為0.5～20 ng/mL，LOD為10 μg/kg，LOQ為20 μg/kg；氯噻嗪、氫氯噻嗪、呋塞米、氯磺丙脲、普伐他汀線性范圍為1.25～50 ng/mL，LOD為25 μg/kg，LOQ為50 μg/kg；妥拉唑林檢線性范圍為1～40 ng/mL，LOD為20 μg/kg，LOQ為40 μg/kg；洛伐他汀羥酸鈉鹽線性范圍為12.5～500 ng/mL，LOD為250 μg/kg，LOQ為500 μg/kg。

表2 59 種非法添加藥物線性參數(shù)、LOD與LOQTable 2 Calibration curve equations,LOD and LOQ of 59 illegally added drugs

2.6.2 方法回收率及精密度

分別稱取片劑、口服液、茶包陰性基質(zhì)樣品，按照定量限、2 倍定量限、5 倍定量限進(jìn)行3水平添加試驗（n＝8），計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），如表3所示，本方法所測得樣品的加標(biāo)回收率在60.2%～119.5%之間，RSD在1.2%～15.0%之間。

2.7 實(shí)際樣品檢測

隨機(jī)抽取市售的調(diào)節(jié)三高類保健食品5 份，應(yīng)用本方法進(jìn)行測定，檢測結(jié)果均為陰性。陰性樣品離子色譜見圖7。

圖7 陰性樣品離子色譜圖Fig.7 Ion chromatogram of negative samples

3 結(jié)論

本研究選用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，針對調(diào)節(jié)三高類保健食品中可能出現(xiàn)的非法添加成分，建立了同時測定59 種非法添加藥物的方法。通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)得到最優(yōu)的檢測條件；優(yōu)化樣品定容液、微孔濾膜、提取時間及凈化管對目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)了較好的提取和富集。該方法樣品前處理操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可為調(diào)節(jié)三高類保健食品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。