林冬純，胡 蝶，陳 維，夏紅玲，喬小燕，苗愛清，馬成英

（廣東省農業(yè)科學院茶葉研究所，廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

紅碎茶是國際市場的大宗產品，我國從20世紀50年代開始試制生產，其品質主要受原料質量和加工工藝的影響。提高紅碎茶品質的研究報道很多，如桂香紅碎茶加工技術[1]、不同萎凋時間對CTC（crush，tear，curl）紅碎茶品質的影響[2]、高茶黃素大葉種紅碎茶的研制[3]等，但這些研究主要闡述加工過程對紅碎茶品質的影響，而關于茶青影響紅碎茶品質的研究甚少。

茶青是指從茶樹采摘下來的鮮活芽葉，是茶葉加工的原料，如果其在采摘、運輸和存放過程中保存不當會導致茶鮮葉劣變，最終影響其成品茶品質[4-5]。茶鮮葉劣變主要受葉溫、氧氣、茶青水分、茶青堆放時間和機械損傷等影響[6]，因此，為茶鮮葉貯放創(chuàng)造適宜的環(huán)境條件，延長茶鮮葉的保存時間，有助于長途運輸及適時加工。茶鮮葉的貯青保鮮與溫度密切相關，有研究表明10～13 ℃處理能對茶青起到較好的保鮮作用[7]。Hu Die等[8]發(fā)現(xiàn)不同處理溫度茶青釋放的揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）組分不同，多個與VOCs生物合成相關的基因在低溫和常溫處理下具有相似的表達趨勢，但是這些基因的表達變化在低溫環(huán)境會延遲出現(xiàn)。

鑒于目前關于貯青溫度及方式對紅碎茶品質影響的研究鮮有報道，因此，本研究以英紅九號茶鮮葉為原料，采用控溫15、25 ℃，常溫以及漚紅這4 種貯青處理制成的紅碎茶為研究對象，通過感官審評、生化成分測定及揮發(fā)性物質檢測，比較不同貯青方法對紅碎茶品質的影響，旨在為茶青管理及紅碎茶的品質提高提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶樣品采用英紅九號一芽二葉茶青進行紅碎茶加工，由廣東省農業(yè)科學院茶葉研究所英德基地提供。

C7～C30飽和正構烷烴、癸酸乙酯（均為色譜純）德國Merck公司；甲醇、福林-酚、乙酸乙酯、蒽酮（均為分析純）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YS-XCAB氣調實驗箱 杭州屹石科技有限公司；便攜式分光光度計 美國Datacolor公司；高速粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科學儀器有限公司；SC-3616離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；752N紫外-可見分光光度計上海菁華科技儀器有限公司；Milli-Q 凈水系統(tǒng)德國Merck Millipore公司；RTC12多功能自動進樣系統(tǒng)、DVB/CarbonWR/PDMS Smart SPME Arrow萃取頭（1.1 mm，120/20 μm）瑞士CTC Analytics AG公司；8890-5977B氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、DB-Wax毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮葉的處理

將40 kg茶鮮葉分成4 份，分別采用15、25 ℃，常溫和漚紅處理這4 種方法進行貯青，處理時間為8 h，環(huán)境相對濕度為65%～75%。15 ℃處理和25 ℃處理于調溫箱進行，茶鮮葉攤放厚度為10 cm；常溫處理于不控溫的加工廠房中進行，溫度范圍為22～28 ℃，攤放厚度為10 cm；漚紅處理采用竹框（25 cm×22 cm×18 cm）堆放茶鮮葉，其堆放葉量為270 kg/m3（GB/T 31748—2015《茶鮮葉處理要求》要求裝葉量不超過150 kg/m3），茶青溫度36～37 ℃。

當貯青結束時，采用紅碎茶工藝加工成毛茶：先用旋葉式滾切機進行滾切，通過篩子（4 mm方孔）篩選，然后將這些破碎的葉子發(fā)酵1 h；發(fā)酵結束后，先在100 ℃干燥0.5 h，然后在80 ℃干燥至含水量約為6%，所有實驗重復3 次。毛茶樣品編號分別為15 ℃貯青（BX-1）、25 ℃貯青（BX-2）、常溫貯青（BX-3）、漚紅貯青（BX-4）。

1.3.2 感官審評

根據GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中的紅碎茶審評法進行審評，感官評價得分是加權平均值，以標準中外形（20%）、湯色（10%）、香氣（30%）、滋味（30%）和葉底（10%）這5 項因子的綜合評分作為樣品品質高低的判定依據，綜合評分大于90 分的樣品為高等級，低于90 分的樣品判定為低等級。感官評價由3 位審評專家獨立進行。

1.3.3 茶葉樣品處理

茶葉樣品處理與茶湯色差、揮發(fā)性物質的檢測條件參考文獻[9-10]的方法稍作改進；可溶性糖采用比色法[11]測定；茶色素采用系統(tǒng)分析法[12]測定；茶多酚、氨基酸的測定分別參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》。所有實驗重復3 次。

樣品處理：研磨成細粉末，在-80 ℃密封保存，用于化學檢測。

茶湯色差測定：茶湯采用GB/T 23776—2018中紅碎茶審評標準制得，再采用便攜式分光光度計對樣品的顏色坐標（CIE Lab）進行定量。

揮發(fā)性成分測定前處理：稱取茶粉（1.000±0.005）g置于20 mL頂空瓶中，加入100 μg/mL癸酸乙酯-正己烷溶液2 μL并迅速擰緊瓶蓋，各樣品重復3 次；接著將頂空瓶置于加熱振蕩器中，60 ℃平衡5 min；隨后使用DVB/CarbonWR/PDMS萃取頭進行萃取，萃取溫度60 ℃，萃取時間40 min。

1.3.4 氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測

色譜分析條件：載氣為高純氦氣（99.9%），流量為1 mL/min；程序升溫的初始柱溫為35 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至250 ℃，不保持?？偡治鰰r間為45 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度和離子源溫度均為230 ℃，四極桿溫度150 ℃；運行全掃描模式，質量掃描范圍m/z35～350；溶劑延遲時間7.5 min。

1.4 數據處理與分析

茶湯色差數據處理：測量后，計算9 個值的平均值作為每個樣品的平均顏色數據。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，采用Duncan多量程檢驗。

茶色素數據處理：所測定的吸光度按照系統(tǒng)分析法中的公式進行換算，得到茶黃素（theaflavin，TF）、茶紅素（thearubigin，TR）和茶褐素（theabrownine，TB）的含量。

氨基酸、茶多酚、可溶性糖數據處理：配制5 個以上不同質量濃度的標準溶液，以標準溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制氨基酸、茶多酚、可溶性糖的標準曲線，得出回歸方程，然后根據標準曲線進行計算分析。

揮發(fā)性成分數據處理：由GC-MS檢測所得的原始數據利用Masshunter工作站中的未知物分析軟件10.0進行處理?；衔锏亩ㄐ砸再|譜數據（匹配度得分大于70.0）和線性保留指數（偏差在10 個單位內）為依據，兩者均與NIST 17數據庫比對。揮發(fā)性物質含量通過下式以癸酸乙酯為內標校正求得：

對定性和定量后的化合物數據依次進行以下前處理：1）按每種化合物最小值的1/5執(zhí)行缺失值填充；2）以每種化合物為一組執(zhí)行均值方差歸一化[13]。

采用Simca軟件、Graphpad Prism 7.0軟件和TBtools軟件作圖，采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析，采用Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同貯青處理對紅碎茶感官品質的影響

如表1所示，25 ℃控溫箱的BX-2和在常溫條件下的貯青樣BX-3茶樣的外形特征相近，BX-4外形尚烏褐勻整，BX-1外形烏褐勻整。漚紅貯青樣BX-4湯色較差，呈紅略暗；隨著控溫溫度的升高（15～25 ℃），茶樣湯色由較紅艷明亮（BX-1）逐漸轉為尚紅艷明亮（BX-2）；BX-3色澤紅艷明亮，優(yōu)于其他處理。BX-4茶樣香氣低悶且略帶異氣，BX-2和BX-3香氣較甜香，BX-1香氣甜香且高長。BX-4茶樣滋味濃醇較強，稍有異味，BX-1和BX-2鮮濃較強，帶苦，BX-3鮮濃較強。BX-4茶樣葉底紅暗，較勻整柔軟，BX-2與BX-3葉底特征相近，呈紅亮，且較勻整柔軟，BX-1葉底紅亮且勻整柔軟。在4 種茶青貯青處理方法中，采用15 ℃控溫貯青的紅碎茶綜合評分為90.4，高于其他貯青處理的茶樣。

表1 不同貯青處理的紅碎茶感官審評結果Table 1 Sensory evaluation results of broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

2.2 不同貯青處理對紅碎茶茶湯色差的影響

茶葉品質色差分析法是應用亨特-Lab表色系，其中L代表明度，正、負a值分別表示紅、綠色度，正、負b值分別表示黃、藍色度[14]。由表2可知，L、a、b均為正值，與張楊波等[15]對紅碎茶茶湯的色差值研究結果一致。BX-1茶湯L值顯著高于其他3 個處理樣（P＜0.05），BX-4的L值最低；BX-1、BX-2、BX-3茶湯a值顯著高于BX-4（P＜0.05）；BX-1茶湯b值顯著低于其他3 個處理樣（P＜0.05）。綜合而言，茶青貯放方式顯著影響紅碎茶茶湯色差，茶青采用15 ℃處理的紅碎茶樣湯色明亮度較高，茶湯顏色較紅艷。

表2 不同貯青處理的紅碎茶湯色差值比較Table 2 Comparison of color parameters among infusions of broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

2.3 不同貯青處理對紅碎茶茶色素的影響

如表3所示，TF作為紅碎茶中色澤橙紅、具有收斂性的一類色素，對紅茶湯色“亮”有貢獻作用[16]，BX-1和BX-2的TF相對含量分別為0.75%和0.78%，顯著高于BX-3和BX-4（P＜0.05）。TR是一類復雜的紅褐色酚類化合物，對茶湯滋味和湯色濃度有重要的貢獻作用[17]，BX-1、BX-2和BX-3的TR相對含量在6.5%～7.0%之間，顯著高于BX-4（P＜0.05）。TF和TR含量與紅碎茶品質呈顯著正相關[18]。TB是造成紅茶茶湯發(fā)暗、無收斂性的重要因素，其含量與紅茶品質高度負相關[19-20]。在4 種貯青處理的紅碎茶中，BX-1和BX-3的TB相對含量顯著低于其他紅碎茶樣品（P＜0.05）。綜合而言，采用15 ℃貯青的紅碎茶更能促進紅碎茶形成較好的品質。

表3 不同貯青處理的紅碎茶茶色素相對含量Table 3 Pigment relative contents in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments%

2.4 不同貯青處理對紅碎茶兒茶素、氨基酸和可溶性糖的影響

如表4所示，茶多酚是構成茶葉滋味物質的重要成分，與茶湯滋味的苦澀、濃強以及收斂性相關，在紅茶加工過程中茶多酚經酶促氧化反應而呈減少趨勢[21-22]。BX-1和BX-4的茶多酚含量顯著低于BX-2和BX-3（P＜0.05），即低溫（15 ℃）處理和漚紅劣變的茶青會降低紅碎茶的茶多酚含量。

表4 不同貯青處理的紅碎茶兒茶素、氨基酸和可溶性糖含量Table 4 Contents of catechins,amino acids and soluble sugar in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments mg/g

氨基酸是組成茶葉鮮爽和鮮甜滋味的重要物質之一，在茶葉加工過程中參與茶葉香氣的形成[23-24]。如表4所示，BX-2的氨基酸含量最高，為34.14 mg/g，BX-4最低，BX-1和BX-3介于兩者中間。不同的貯青處理會影響紅碎茶的氨基酸含量，漚紅劣變的茶青不利于紅碎茶氨基酸含量的積累。

可溶性糖能給茶湯帶來甜醇的味道，是紅碎茶重要的滋味物質[25-26]。BX-1、BX-2和BX-3可溶性糖的含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于BX-4（P＜0.05）。茶葉中的可溶性糖含量受鮮葉呼吸作用的影響而減少，在加工過程中其含量也隨著單糖的氧化和多糖的水解而變化[27]。茶青采用15 ℃處理有助于紅碎茶可溶性糖含量的積累，而漚紅劣變的茶青可能因加工前加快了鮮葉的呼吸作用而促進了可溶性糖的消耗，使得其可溶性糖的含量低于其他貯青處理的紅碎茶。

2.5 不同貯青處理對紅碎茶揮發(fā)性物質的影響

如圖1所示，4 組茶樣揮發(fā)性物質種類大致相同，但含量存在一定差異。由表5可知，不同貯青處理的紅碎茶共檢出已知揮發(fā)性物質70 種，BX-1、BX-2和BX-3揮發(fā)性物質的總含量均高于BX-4，約為BX-4的2 倍。參考宛曉春[28]對茶葉香氣的分類方法，不同貯青處理的紅碎茶揮發(fā)性物質包括醇類21 種、碳氫類10 種、醛類16 種、酮類7 種、酯類9 種、其他化合物7 種。其中芳樟醇相對含量較高，約占紅碎茶樣品的30%～40%。芳樟醇是紅碎茶典型的特征香氣，似鈴蘭的花香香氣[29]，其在BX-1含量為4 8 0 3.9 n g/g，顯著高于B X-2、B X-3 和B X-4（P＜0.05）。在特有揮發(fā)性物質組分上，己酸己酯（新鮮水果香）和N-己酸(反-2-己烯基)酯（青草味）為BX-1特有，BX-2和BX-3無特有揮發(fā)性物質組分，BX-4特有組分有3 種，分別為β-二氫紫羅蘭酮（花香）、二氫獼猴桃內酯（香豆素味）和2-乙基吡嗪（堅果香）。這表明貯青方法會影響紅碎茶總揮發(fā)性物質的含量，同時也影響特有組分的形成。

圖1 不同貯青處理的紅碎茶揮發(fā)性物質總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile substances in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

表5 不同貯青處理的紅碎茶揮發(fā)性物質Table 5 Contents of volatile substances in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

如圖2所示，不同貯青處理的紅碎茶揮發(fā)性物質中醇類相對含量較高，是構成紅碎茶的主體成分，其次是醛類、碳氫類、酯類，酮類。BX-1、BX-2和BX-3中相對含量最高的醇類差異不顯著，但顯著高于BX-4（P＜0.05），酮類揮發(fā)性物質在4 種樣品中差異不顯著（P＞0.05），而BX-4的碳氫類揮發(fā)性物質顯著高于BX-1、BX-2和BX-3（P＜0.05），其余各類揮發(fā)性的含量在各個樣品中的占比有所不同。可見，紅碎茶中揮發(fā)性組分中醇類貢獻較大，這與肖巧梅等[30]對紅茶揮發(fā)性成分的研究結果一致，但各類揮發(fā)性物質實際占比會受到貯青方法的影響，茶青漚紅會明顯降低紅碎茶的醇類物質占比，且會增加碳氫類揮發(fā)性化合物的比重。

圖2 不同貯青處理對紅碎茶揮發(fā)性物質相對含量的影響Fig.2 Effects of different storage treatments for fresh tea leaves on the relative contents of volatile substances in broken black tea

對不同貯青處理的紅碎茶揮發(fā)性物質含量進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），得分如圖3A所示。各茶樣在95%置信區(qū)間內均分布于不同區(qū)域，有明顯的區(qū)分，說明不同貯青處理對紅碎茶揮發(fā)性物質含量影響較大。分別表示第1主成分貢獻率（65.0%）和第2主成分貢獻率（14.9%），結果表明這2 個主成分可以反映揮發(fā)性物質數據差異，且從第1主成分貢獻率可知BX-4的揮發(fā)性物質與另外3 種貯青樣品存在明顯差異。參考徐春暉等[31]的方法，采用200 次響應的置換檢驗模型是否有過擬合現(xiàn)象，結果如圖3B所示，R2＝0.447，Q2＝-0.439，Q2與Y軸的截距為負值，說明本模型預測能力良好，并未產生過擬合現(xiàn)象，可用于特征揮發(fā)性物質的篩選。按變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值從大到小排列，篩選出VIP＞1且組間差異顯著（P＜0.05）的主要差異揮發(fā)性物質，如圖4所示。

圖3 不同貯青處理的紅碎茶揮發(fā)性物質OPLS-DA得分圖（A）和驗證圖（B）Fig.3 OPLS-DA score (A) and permutation test (B) plots for variations in volatile substances in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

圖4 不同貯青處理的紅碎茶VIP大于1的揮發(fā)性物質熱圖Fig.4 Heatmap of volatile substances with VIP greater than 1 in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

由圖4可知，4 種不同貯青處理的紅碎茶中共篩選出十二烷、己酸葉內酯和反式-2-辛烯-1-醇等20 種差異揮發(fā)性物質，結合表5可知，BX-1的萘、己酸己酯、N-己酸(反-2-己烯基)酯和(E,E)-2,4-庚二烯醛等物質含量顯著高于BX-2、BX-3和BX-4（P＜0.05），長葉烯、二氫芳樟醇和順式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯等物質在BX-1、BX-2和BX-3中的含量顯著高于BX-4（P＜0.05），BX-4的癸醛、壬醛和(Z)-脫水芳樟醇氧化物含量顯著高于其他茶樣（P＜0.05）。綜上，這20 種差異揮發(fā)性物質的構成是不同貯青處理紅碎茶香氣差異的主要原因。

葛曉杰等[32]通過嗅覺檢測器對呈香活性成分的鑒定表明脫氫芳樟醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-1,3,5辛二烯-2-酮在紅茶香型中呈香更顯著，是甜香型紅茶的關鍵因子。而本研究發(fā)現(xiàn)在15 ℃貯青的紅碎茶相對含量較高的揮發(fā)性物質有水果青香味的己酸己酯、堅果香的(E,E)-2,4-庚二烯醛、呈青草香的N-己酸(反-2-己烯基)酯等物質，結合感官審評結果（表1）可知這些香氣物質是影響紅碎茶甜香的主要成分，這也表明采用15 ℃貯青能更好地促進紅碎茶甜香味的形成。

茶葉香氣的形成受到環(huán)境因素的影響，在環(huán)境脅迫的條件下茶葉會收到的脅迫信號的傳導，相應地做出脅迫反應，調控某些香氣合成基因的表達，誘導某些香氣物質的合成釋放，從而使自身更加適應環(huán)境變化[33-34]。在茶葉加工中，可以通過對鮮葉進行適度低溫處理調控香氣的釋放，從而達到促進成品茶香氣愉悅的目的[35]。本研究結果表明：相較于其他貯青處理，15 ℃處理茶青對紅碎茶香氣成分有明顯影響，當貯青方式不同導致茶青保存溫度不同時，紅碎茶的特征香氣成分發(fā)生改變，從而造成不同貯青處理的紅碎茶揮發(fā)性成分差異。不同貯青處理的紅碎茶香氣的形成以及成分之間的相互轉化機理仍需進一步深入研究。

3 結論

茶多酚、氨基酸、可溶性糖和香氣物質等含量可作為判斷紅碎茶品質優(yōu)良的指標。不同貯青處理的紅碎茶中15 ℃貯青的紅碎茶綜合評分最高，為90.4，其湯色明亮度較高，茶湯顏色較紅艷；茶青采用15 ℃和漚紅處理降低了紅碎茶中茶多酚總含量；不同貯青處理會影響紅碎茶的氨基酸含量，漚紅劣變茶青不利于紅碎茶氨基酸的積累；茶青采用15 ℃處理有助于紅碎茶可溶性糖的積累，而漚紅劣變茶青可能會促進鮮葉的呼吸作用而加快可溶性糖的消耗；揮發(fā)性物質共測出70 種，醇類物質占比較大，主要差異物有十二烷、己酸葉內酯和反式-2-辛烯-1-醇等20 種物質，15 ℃貯青的紅碎茶相對含量較高的揮發(fā)性物質有堅果香的(E,E)-2,4-庚二烯醛、呈青草香的N-己酸(反-2-己烯基)酯、水果青香味的己酸己酯，能更好地促進紅碎茶甜香味的形成。綜合而言，15 ℃貯青能提高紅碎茶的鮮爽度、甜度及甜香揮發(fā)性物質的含量，更有利于品質形成，該溫度是紅碎茶貯青的適宜溫度，實驗結果可為茶青管理及紅碎茶品質的提升提供參考。