董文娟，陳 明，向妙蓮，陳金印，曾教科

（江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西 南昌 330045）

獼猴桃（ActinidiachinensisPlanch.）原產(chǎn)自中國，其在中國種植面積和產(chǎn)量均穩(wěn)居世界第一位，素有“VC之王”之稱[1-3]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，采后生理代謝旺盛，伴隨果實快速軟化，商品性喪失。應用保鮮技術可延緩獼猴桃后熟軟化，但消費者購買后往往無法即食，果實硬度較高、口感酸澀，放至完全軟化則易腐爛，這已成為獼猴桃產(chǎn)業(yè)采后貯運最為突出的問題[4]。因此，加深獼猴桃果實后熟軟化生理機制的研究，對促進獼猴桃綠色保鮮技術的開發(fā)利用和減少采后品質劣變具有重要的科學意義和經(jīng)濟意義。

對獼猴桃果實后熟軟化屬性的研究主要集中在乙烯合成及信號轉導、細胞壁結構及組分的變化、淀粉含量、淀粉降解酶活性及相關基因表達等方面[5-6]。其中，淀粉快速水解是獼猴桃貯藏前期軟化的主要原因[7-8]。淀粉水解成己糖后，經(jīng)過己糖激酶（hexokinase，HXK）（EC 2.7.1.1）的磷酸化作用才能參與下游的糖酵解和呼吸代謝[9-10]。因此，HXK在糖代謝和植物生命活動中發(fā)揮著重要作用[11]。目前，HXK基因已在多種植物中被分離和鑒定。番茄中至少有4 個HXK基因[12]，擬南芥中有6 個HXK基因[13]，梨中有10 個HXK基因[14]，蘋果中有9 個HXK基因[15]，桃中有5 個HXK基因[16]。Nardozza等[17]從獼猴桃EST數(shù)據(jù)庫中鑒定出3 個HXK基因，其中HK3與己糖磷酸化有關，并參與獼猴桃果實早期發(fā)育。然而，獼猴桃基因組發(fā)表后，關于獼猴桃HXK基因家族成員的研究和報道卻相對較少。

HXK是一種雙功能酶，可磷酸化己糖或作為葡萄糖信號感應器，在糖酵解、淀粉降解、細胞壁合成途徑和戊糖磷酸途徑等代謝途徑中發(fā)揮作用[18-20]。HXK可調控植物生長發(fā)育以及各種生物和非生物脅迫過程，如環(huán)境和營養(yǎng)脅迫[21-22]、植株生長[23-24]、種子發(fā)育[25]和果實病害防御[16,26]等。HXK也被報道能夠影響果實生理代謝和后熟軟化過程[27]。Hu Dagang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，外源葡萄糖激活MdHXK1的表達，使下游轉錄因子MdbHLH3磷酸化，進而上調MdMYB1和ANS等基因表達，促進蘋果花青苷合成。在碳源缺乏的情況下，花青苷合成抑制子MYB27被顯著激活，果肉花青苷積累受抑制[29]。李成梁等[30]研究發(fā)現(xiàn)，香蕉后熟過程中甘露糖上調HXK活性和HXK基因的表達，而N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）（HXK抑制劑）則抑制HXK活性的升高和內(nèi)源乙烯的合成，說明HXK在果實后熟軟化中發(fā)揮重要作用。然而，目前有關HXK參與獼猴桃后熟軟化的報道較少。

本實驗以‘紅陽’獼猴桃為試材，研究10 mmol/L NAG處理對獼猴桃果實常溫貯藏期間軟化特性、品質、呼吸速率和乙烯釋放量、HXK活性以及AcHXKs基因表達的影響，進一步闡釋獼猴桃后熟軟化調節(jié)機制，以期為獼猴桃果實采后貯藏保鮮技術的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紅陽’獼猴桃采自江西宜春奉新縣獼猴桃果園，果實采摘時為八成熟（平均單果質量62.81 g，硬度73.64 N，總可溶性固形物（total soluble solid，TSS）質量分數(shù)8.29%），當天運回江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，挑選無病蟲害、無機械損傷、大小均勻的獼猴桃果實作為實驗材料。

NAG 上海源葉生物科技有限公司；HXK活性檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；植物淀粉含量測試盒 南京建成生物工程研究所；獼猴桃總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒和實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混液 翌圣生物科技（上海）股份有限公司。其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TMS-Touch 質構儀 美國F TC公司；糖度計日本ATAGO公司；SpectraMax190酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；Check point便攜式O2/CO2測定儀丹麥PBI Dansensor公司；GC-2014氣相色譜儀 日本島津公司；BioDrop超微量核酸蛋白分析儀 英國柏點公司；CFX96TMPCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 果實處理

將獼猴桃果實隨機分成兩組，即處理組（NAG組，10 mmol/L NAG浸泡10 min）和對照組（CK組，清水浸泡10 min），每組210 個果實。果實室溫晾干后分裝入低密度聚乙烯袋（39 cm×30 cm，厚度0.03 mm）中，置于（20±1）℃、相對濕度85%的環(huán)境下貯藏12 d，每2 d取樣測定果實硬度、呼吸速率、乙烯釋放量和TSS含量。同時取果肉組織（去除果皮、中柱和帶籽部分）放于液氮中速凍，在-80 ℃條件下貯藏，用于后續(xù)測定可滴定酸（titritable acidity，TA）、VC、淀粉、果膠、還原糖含量、HXK活性和提取總RNA。10 個果實為1 個重復，共3 個生物學重復。

1.3.2 硬度測定

每組隨機抽取30 個果實，使用質構儀測定硬度（質構剖面分析模式）。單個獼猴桃果實在赤道面去皮后，測定赤道面180°兩個點的果肉硬度。質構儀參數(shù)設置為探頭直徑2 mm、穿刺距離8 mm、測試速率100 mm/min、起始力0.5 N。以每次測定的最大力值為硬度，取平均值，單位為N。

1.3.3 呼吸速率和乙烯釋放量測定

每組隨機選取15 個果實，分3 次放入1 L的容器中，密封2 h后在容器頂部抽取氣體測定呼吸速率和乙烯釋放量，測定重復3 次，取平均值。使用Check point便攜式O2/CO2測定儀測定CO2體積分數(shù)，以CO2釋放速率表示呼吸速率，單位為mL/（kg·h）。抽取密封容器頂部1 mL氣體，使用氣相色譜儀測定乙烯釋放量，單位為nL/（kg·h）。

1.3.4 TSS、TA和VC含量測定

將測硬度的30 個果實隨機分成3 組，即3 個生物學重復。每組取位于果實赤道部的外果肉混合榨汁，采用手持數(shù)字糖度計測定TSS含量。

TA含量測定參照曹建康等[31]的方法。將2.0 g果肉于液氮中研磨成粉末，后加入25 mL蒸餾水，靜置30 min后吸取上清液10 mL于三角瓶中，加入2～3 滴質量分數(shù)1%酚酞溶液，用已標定的NaOH溶液滴定至溶液變粉紅色且30 s內(nèi)不褪色。

VC含量測定參照曹建康等[31]的方法。將2.0 g果肉于液氮中研磨成粉末，后加入25 mL 20 g/L的草酸溶液混合，過濾后吸取10 mL濾液于三角瓶，用已標定的2,6-二氯靛酚溶液滴定至微紅色且15 s內(nèi)不褪色，記錄滴定液體積，VC含量單位為mg/100 g。

1.3.5 淀粉、果膠和還原糖含量測定

淀粉含量采用植物淀粉含量測試盒進行測定。利用酸水解法將淀粉分解成葡萄糖，再使用蒽酮比色法進行定量，測定620 nm波長處的吸光度，從而計算淀粉的含量，結果表示為淀粉質量分數(shù)。

果膠含量的測定用咔唑比色法，還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法，具體步驟參照曹建康等[31]的方法。

1.3.6 HXK活性測定

HXK活性使用HXK活性檢測試劑盒測定，以每克果肉每分鐘生成1 nmol的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸定義為1 個酶活力單位。HXK活性單位為U/g。

1.3.7HXKs基因篩選與序列分析

利用Kiwifruit Genome Database（https://kiwifruitgenome.org/organism/5）從紅陽獼猴桃基因組中篩選獲得14 個HXKs基因。通過獼猴桃基因組序列比對，查找到這14 個HXKs的氨基酸序列，利用鄰接法聯(lián)配后通過Clustal X（v1.81）軟件進行比對，再導入到FigTree（v1.3.1）軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.8HXKs基因表達分析

獼猴桃果肉RNA提取按照RNAprep Pure Plant Plus Kit（Polysaccharides &Polyphenolics-rich）RNA提取試劑盒說明書操作。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，利用BioDrop超微量核酸蛋白分析儀檢測總RNA純度和濃度后，用反轉錄試劑盒Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）反轉錄成cDNA。

基因表達研究采用實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）方法。利用Primer 3在線軟件設計引物，詳見表1，根據(jù)溶解曲線驗證引物的特異性。逆轉錄real-time PCR應用CFX96TMPCR儀，反應體系（10 μL）和反應程序參照試劑盒（HieffR qPCR SYBR Green Master Mix (NO ROX)）說明書進行?；虮磉_以獼猴桃AcActin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，將0 d設為1?；虮磉_設置3 個生物學重復。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 NAG處理對獼猴桃呼吸速率和乙烯釋放量的影響

呼吸和乙烯釋放是獼猴桃后熟軟化過程中主要的生理特性。如圖1A所示，對照與處理組的呼吸速率變化趨勢基本一致。貯藏前2 d呼吸速率呈下降趨勢，推測是因為果實較高的田間熱引起采收時的高呼吸作用。兩組果實呼吸速率均在貯藏第6天達到峰值，NAG處理可顯著降低呼吸峰前后的呼吸速率，但呼吸峰值無顯著差異。如圖1B所示，乙烯釋放量主要在貯藏后期呈上升趨勢，貯藏第8天開始，CK組與NAG組乙烯釋放量出現(xiàn)顯著差異，NAG處理顯著延緩了乙烯的釋放。由此可知，NAG處理可有效降低果實呼吸速率和乙烯釋放量。

圖1 NAG處理對獼猴桃果實呼吸速率（A）和乙烯釋放量（B）的影響Fig.1 Effect of NAG treatment on the respiration rate (A) and ethylene production (B) of kiwifruit

2.2 NAG處理對紅陽獼猴桃果實品質的影響

硬度作為果實后熟軟化的重要指標，是評價獼猴桃果實品質和可食性的關鍵因子之一。如圖2A所示，獼猴桃果實硬度隨著貯藏時間延長呈下降趨勢，與CK組相比，NAG處理可顯著延緩貯藏4～10 d硬度的下降。TSS主要由可溶性糖構成，TA則由果酸和酸式鹽組成，它們是評價果實風味品質的重要指標。如圖2B、C所示，與CK組相比，NAG組在貯藏2～12 d顯著抑制了果實TSS含量的上升，并顯著維持TA含量在較高水平，說明NAG處理有利于延緩獼猴桃果實糖酸轉變和維持品質。VC是獼猴桃果實重要的營養(yǎng)品質之一。如圖2D所示，NAG組和CK組VC含量隨著貯藏時間延長呈下降趨勢，處理間無顯著差異。

圖2 NAG處理對獼猴桃果實硬度（A）、TSS（B）、TA（C）和VC含量（D）的影響Fig.2 Effect of NAG treatment on the firmness (A),TSS (B),TA (C) and VC content (D) of kiwifruit

2.3 NAG處理對獼猴桃多糖含量的影響

獼猴桃果實后熟軟化伴隨著淀粉水解和細胞壁多糖的降解。從圖3可知，淀粉和原果膠質量分數(shù)隨著貯藏時間延長總體呈下降趨勢，與CK組相比，NAG處理可顯著延緩貯藏4～12 d獼猴桃果肉淀粉和原果膠的下降。兩組果肉中還原糖和可溶性果膠質量分數(shù)總體呈上升趨勢，且在貯藏過程中、后期NAG組的還原糖和可溶性果膠質量分數(shù)均顯著低于CK組。以上結果表明，獼猴桃在常溫貯藏過程中NAG處理能顯著抑制淀粉和果膠的水解，延緩果實的后熟軟化過程。

圖3 NAG處理對獼猴桃果實多糖含量的影響Fig.3 Effect of NAG treatment on the polysaccharide contents of kiwifruit

2.4 NAG處理對獼猴桃HXK活性的影響

HXK是己糖磷酸化的關鍵酶，葡萄糖和果糖經(jīng)過HXK磷酸化，進一步參與下游糖酵解和呼吸代謝過程[9]。如圖4所示，CK組HXK活性隨貯藏時間延長呈先上升后下降趨勢，而NAG處理后的獼猴桃HXK活性始終低于CK組，并在貯藏2 d后出現(xiàn)顯著差異。結果表明，NAG處理可以顯著抑制HXK活性，進而延緩淀粉水解和糖酵解過程。

圖4 NAG處理對獼猴桃果實HXK活性的影響Fig.4 Effect of NAG treatment on the HXK activity of kiwifruit

2.5 獼猴桃HXK基因序列分析

從獼猴桃基因組中篩選獲得14 個AcHXKs基因，分別命名為AcHXK1～AcHXK14。將獼猴桃HXK與擬南芥、番茄的HXK基因進行聚類分析，如圖5所示，14 個AcHXKs基因分成2大類型。其中，A-型包括10 個AcHXK，分別與擬南芥的AtHXK3、AtHKL1、AtHKL2、AtHKL3和番茄SlHXK4同源；B-型包括4 個AcHXK，分別與擬南芥AtHXK1、AtHXK2和番茄SlHXK1、SlHXK2、SlHXK3同源。推測AcHXKs可能具有與其同源基因類似的功能。

圖5 獼猴桃與擬南芥、番茄的HXKs聚類分析Fig.5 Phylogenetic analysis of kiwifruit arabidopsis and tomato HXKs

2.6 NAG處理對獼猴桃AcHXKs基因表達的影響

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，AcHXKs呈現(xiàn)不同的表達趨勢。其中AcHXK1～AcHXK3相對表達量隨貯藏時間延長整體呈上升趨勢，與CK組相比，NAG處理可顯著抑制貯藏中、后期AcHXK1～AcHXK3的表達，說明AcHXK1～AcHXK3可能通過糖代謝介導獼猴桃后熟軟化。CK組果實AcHXK4～AcHXK6相對表達量在貯藏0～6 d逐漸上升，隨后開始下降，且NAG處理總體顯著降低了貯藏4～12 d果實AcHXK4～AcHXK6的相對表達量。CK組和NAG處理果實AcHXK7～AcHXK12相對表達量在貯藏0～10 d逐漸下降，NAG處理顯著上調了AcHXK7～AcHXK9基因的相對表達量，說明AcHXK7～AcHXK9可能作為糖信號分子參與獼猴桃后熟軟化。AcHXK13、AcHXK14基因表達量無規(guī)律性波動。

圖6 NAG處理對獼猴桃果實AcHXK基因表達活性的影響Fig.6 Effect of NAG treatment on the expression of AcHXK genes in kiwifruit

2.7 相關性分析

NAG處理后，獼猴桃果實后熟軟化特性、HXK活性和AcHXKs基因表達的相關性分析結果如圖7所示。果肉硬度與淀粉、AcHXK4、AcHXK7～AcHXK12基因表達顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01），與可溶性果膠含量、乙烯釋放量以及AcHXK3表達水平顯著負相關（P＜0.05，P＜0.01）。乙烯釋放量與可溶性果膠含量、AcHXK3表達水平顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01），與AcHXK10顯著負相關（P＜0.05）。淀粉含量與還原糖、TSS含量和AcHXK2、AcHXK3表達水平顯著負相關（P＜0.0 5，P＜0.0 1），與AcHXK4、AcHXK7～AcHXK10表達水平顯著正相關（P＜0.05，P＜0.001）。原果膠含量與AcHXK7、AcHXK8、AcHXK11、AcHXK12表達水平顯著正相關（P＜0.05）。由此說明，獼猴桃果實軟化與淀粉、果膠水解以及AcHXKs基因表達水平的變化密切相關。

圖7 獼猴桃后熟軟化特性與AcHXKs基因表達量的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between postharvest softening properties and AcHXKs gene expression

3 討論

獼猴桃后熟軟化是一個復雜的生理代謝過程，呼吸速率和乙烯釋放是衡量其生理代謝強弱的重要指標[5-6]。相關研究表明，獼猴桃果實達到可食成熟度（常溫貯藏8～12 d）時，呼吸速率和乙烯釋放量迅速增加，耐貯性下降[6,8]。HXK是糖酵解途徑的第一個限速酶，兼具催化和調節(jié)雙重功能，在呼吸代謝和乙烯信號中發(fā)揮重要的作用[33]。本實驗中，NAG處理顯著降低呼吸速率和貯藏后期內(nèi)源乙烯的釋放，且乙烯與硬度顯著負相關（P＜0.05）。說明HXK正向作用于內(nèi)源乙烯的生物合成，并參與獼猴桃后熟軟化過程，這與對香蕉的研究結果[30]一致。李成梁等[30]研究發(fā)現(xiàn)，NAG推遲內(nèi)源乙烯生物合成，且在香蕉后熟過程中乙烯和HXK之間存在相互作用。在擬南芥中也報道了HXK參與調控乙烯合成和信號反應[33]。

獼猴桃是典型的淀粉積累型水果，后熟軟化主要由淀粉水解和細胞壁降解所導致。其中，淀粉水解主要在貯藏前、中期影響果實軟化，而果膠水解則在貯藏中、后期果實軟化中發(fā)揮重要作用[8]。HXK是糖酵解途徑的關鍵酶，負責將淀粉水解后的己糖磷酸化成己糖-6-磷酸，為呼吸代謝和生命活動提供能量和中間代謝物[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，NAG可抑制HXK活性，顯著延緩獼猴桃貯藏中期淀粉向還原糖的轉變，以及貯藏中后期原果膠向可溶性果膠的轉變（圖3、4）。這與Han Peipei等[26]的研究報道一致，NAG處理顯著抑制HXK活性，延緩己糖含量的上升。此外，NAG處理可顯著延緩TSS含量的上升，并維持TA含量在較高水平，且TSS含量與淀粉含量極顯著負相關（P＜0.01）。說明NAG處理可延緩可溶性糖的積累，進而延緩后熟進程，該結果與NAG處理香蕉果實后熟延緩的結果相似[24]。說明HXK可正向調控獼猴桃淀粉、果膠的水解，促進后熟軟化過程。

HXK不僅調控多糖代謝，也直接參與糖信號感應和轉導[18-19]。植物根據(jù)亞細胞定位有4 種類型的HXK，其中A-型HXK定位于葉綠體，主要在高淀粉植物中積累，也是葡萄糖傳感器；B-型HXK定位于線粒體和細胞核，具有催化和調節(jié)活性的雙重功能。HXK不同類型對其活性和傳感器功能至關重要[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，AcHXK7～AcHXK9為A-型HXK，受NAG處理其表達上調，且表達量與硬度顯著正相關（P＜0.05）。聚類分析表明AcHXK7～AcHXK9與擬南芥AtHKL1等同源，而AtHKL1可能作為糖信號分子，通過抑制ACO基因的表達參與調控乙烯合成途徑[33]。AcHXK3為B-型HXK，與SlHXK1、SlHXK2、AtHXK1、AtHXK2等同源；并且受NAG處理其表達下調，且表達量與硬度、淀粉含量顯著負相關，與還原糖、可溶性果膠含量顯著正相關（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)HXK1顯著誘導番茄和擬南芥中β-淀粉酶和細胞壁松弛相關基因XTH等的表達下調，這表明HXK正向調控園藝植物成熟衰老的過程[21,32]。Kim等[35]也發(fā)現(xiàn)B-型NtHXK1對維持煙草呼吸代謝過程中的糖酵解至關重要，同時也調節(jié)淀粉的降解過程。說明AcHXK3具有類似的功能，可能通過調控淀粉和細胞壁代謝，參與獼猴桃后熟軟化。以上結果表明，AcHXK3、AcHXK7～AcHXK9可能是參與調控獼猴桃后熟軟化的關鍵基因。而這4 個基因是如何參與獼猴桃后熟軟化，還需要進一步的實驗證明。

4 結論

綜上，與對照相比，NAG處理可延緩獼猴桃硬度下降、淀粉和原果膠的水解，降低呼吸速率和乙烯釋放量，延緩TSS含量的上升，并維持較高的TA含量。說明NAG處理可延緩獼猴桃后熟軟化進程。一方面，NAG處理可能通過抑制AcHXK3的表達水平和HXK活性，延緩獼猴桃呼吸代謝和后熟進程；另一方面，NAG維持AcHXK7～AcHXK9相對較高的表達水平，而AcHXK7～AcHXK9可能作為糖信號分子，進而抑制乙烯的合成，或參與細胞壁和淀粉的降解，從而調節(jié)獼猴桃后熟軟化。因此，AcHXK3、AcHXK7～AcHXK9可能通過不同的代謝途徑參與調控獼猴桃后熟軟化過程。本研究結果有助于加深對獼猴桃后熟軟化機理的理解，同時為研發(fā)獼猴桃后熟軟化調控技術提供理論依據(jù)。