張美娜，趙南南，廖思晴，王升厚，王 澤,3,*

（1.沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧省功能性蛹蟲草重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034；3.沈陽市功能性蛹蟲草產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 沈陽 110034）

機(jī)體的健康狀態(tài)取決于免疫功能是否能保持相對的平衡穩(wěn)定，免疫力低下會增加患侵襲性真菌感染、癌癥和艾滋病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]，免疫力過強(qiáng)則容易導(dǎo)致過敏反應(yīng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、類風(fēng)濕等自身免疫性疾病[3]。因此，針對不同的機(jī)體狀況，免疫系統(tǒng)通過正、負(fù)雙向的調(diào)節(jié)機(jī)制，產(chǎn)生匹配的免疫應(yīng)答，保證機(jī)體維持正常健康的狀態(tài)。免疫調(diào)節(jié)劑是指具有增強(qiáng)或調(diào)節(jié)免疫功能的一大類物質(zhì)，在臨床上廣泛用于感染性疾病、某些自身免疫病及腫瘤的輔助治療。研究顯示，食藥用真菌及其免疫調(diào)節(jié)蛋白、多糖等可以通過多途徑、多層面對免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，同時(shí)具有良好的食用安全性，被認(rèn)為是具有醫(yī)療潛力的天然免疫調(diào)節(jié)劑。

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）是一種食藥用真菌和新資源食品，其含有豐富的蟲草素、噴司他丁及多糖等生物活性成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤及抗炎活性[4-6]。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，蛹蟲草對免疫抑制小鼠具有良好的免疫激活作用，可提高其免疫器官指數(shù)、白細(xì)胞數(shù)量、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)程度和血清溶血素含量[7]，具有促進(jìn)脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖的作用，能夠促進(jìn)免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgM分泌[8]。蛹蟲草胞外多糖可提高免疫抑制小鼠的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6的水平[9]。同時(shí)，蛹蟲草對正常機(jī)體免疫狀態(tài)是否存在影響，目前主要集中在體外實(shí)驗(yàn)評估層面。研究顯示，蛹蟲草可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性[10]，蛹蟲草多糖可通過抑制PD-L1/PD-1軸，促進(jìn)免疫抑制性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為殺傷性巨噬細(xì)胞[11]，蛹蟲草的免疫調(diào)節(jié)蛋白可激活Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4/核因子（nuclear factor，NF）-κB通路，增加F-肌動蛋白表達(dá)，促進(jìn)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7對大腸桿菌的吞噬作用[12]。因此，本研究從體液免疫、細(xì)胞免疫及胃腸免疫3 個角度揭示蛹蟲草對正常小鼠免疫應(yīng)答的影響，同時(shí)，輔以環(huán)磷酰胺小鼠免疫抑制模型，進(jìn)一步探究蛹蟲草對免疫力低下機(jī)體的調(diào)節(jié)作用，以期為蛹蟲草在免疫調(diào)節(jié)劑方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級KM系小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0002），中國食品藥品檢定研究院檢疫合格，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，于室溫（24±2）℃、相對濕度（55±5）%、自然光照條件下飼養(yǎng)；小鼠及鼠糧均購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

蛹蟲草子實(shí)體由遼寧省功能性蛹蟲草重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，60 ℃烘干后粉碎，過80 目篩網(wǎng)，獲得蛹蟲草干粉，-20 ℃密封保存待用。灌胃前，用蒸餾水充分溶解制備蛹蟲草水溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

小鼠IL-2、IL-10定量酶聯(lián)免疫吸附測試（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；小鼠血清IgG、IgM定量ELISA試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的抗小鼠CD4單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗小鼠CD3單克隆抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記的抗小鼠CD8a單克隆抗體 美國BioLegend公司；RNAiso Plus 日本TaKaRa公司；GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒 美國Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F50型酶標(biāo)分析儀 瑞士帝肯公司；BD FACSCanto IIL流式細(xì)胞儀 美國碧迪醫(yī)療器械有限公司；ABI Q6實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正常小鼠的蛹蟲草灌胃處理

KM系小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為空白組（ZC組）、低倍組（DB組）及高倍組（GB組），每組10 只。按中華人民共和國衛(wèi)生部公告（2009年第3號）中正常成人蛹蟲草推薦服用劑量2 g/60 kgmb計(jì)算[13]，根據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算小鼠服用基礎(chǔ)劑量，DB組灌胃劑量為0.61 g/kgmb，GB組為1.52 g/kgmb，蛹蟲草水溶液連續(xù)灌胃21 d，0.5 mL/只，ZC組灌胃同等體積的蒸餾水。

1.3.2 小鼠的日常狀態(tài)觀察及解剖

每天觀察記錄小鼠的毛發(fā)、精神、活動等日常狀態(tài)，記錄小鼠體質(zhì)量、日飲水量及日進(jìn)食量。末次灌胃結(jié)束后，各組小鼠眼球取血，分離血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。解剖并稱取肝臟、腎臟、脾臟及胸腺的質(zhì)量，按下式計(jì)算臟器指數(shù)：

1.3.3 小鼠血清細(xì)胞因子和Ig含量的檢測

隨機(jī)選用小鼠血清樣本（n＝3），分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)孔和空白孔，3 個復(fù)孔，其中IL-2和IL-10血清樣本按體積比1∶1稀釋至50 μL加入實(shí)驗(yàn)孔，IgG和IgM血清樣本1∶1稀釋至100 μL加入實(shí)驗(yàn)孔，空白孔為等體積的樣本稀釋液，按照試劑盒要求進(jìn)行ELISA檢測操作，酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.3.4 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測

取小鼠抗凝血100 μL，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解10 min；用磷酸鹽緩沖液洗2 次，取1×106個/mL細(xì)胞懸液500 μL，依次加入1 μL PE標(biāo)記的抗小鼠CD4單抗、2 μL FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3單抗、3 μL PerCP-Cy5.5標(biāo)記的抗小鼠CD8a單抗，避光染色30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量。

1.3.5 小鼠腸道菌群多樣性的高通量檢測

分別取ZC組、DB組和GB組盲腸內(nèi)新鮮糞便，置于無菌凍存管中，-80 ℃冰箱中保存。采用QIAGEN DNA提取試劑盒提取各組盲腸內(nèi)容物樣本總DNA，并通過核酸定量熒光計(jì)進(jìn)行總DNA質(zhì)檢；以通用上游引物（5’-3’）CCTACGGGNGGCWGCAG和下游引物（5’-3’）GACTACNVGGGTATCTAAT對各樣本腸道菌群16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，純化后的PCR產(chǎn)物通過Illumina平臺進(jìn)行Paired-End測序；利用Usearch軟件聚類分析并注釋操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）；R語言計(jì)算樣本組間共有和特有OTU，并進(jìn)行樣本間的主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA），α多樣性指數(shù)圖由QIIME軟件繪制。不同分類水平腸道菌群組成分析通過LEfSe軟件選取各組小鼠腸道重要菌群，并對優(yōu)勢菌群進(jìn)行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

1.3.6 小腸TLRs/NF-κB通路相關(guān)因子的檢測

取ZC組、DB組和GB組小鼠空腸組織，采用試劑盒提取總RNA，超微量分光光度計(jì)檢測其濃度和純度，取1 μg進(jìn)行電泳檢測，-80 ℃保存樣品。按照GoScript?逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒步驟得到cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃孵育5 min；42 ℃孵育1 h；70 ℃孵育15 min，終止反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參基因，擴(kuò)增目的基因TLR2、TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor，MyD88）、NF-κB的mRNA序列，其中引物見表1，realtime PCR體系：2×GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL、DEPC水8.2 μL。real-time PCR擴(kuò)增程序：每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min；共40 個循環(huán)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.7 免疫抑制小鼠的蛹蟲草灌胃與檢測

KM系小鼠隨機(jī)分為空白組（CK組）、模型組（MD組）和蛹蟲草灌胃組（MDY組），每組10 只，MD組和MDY組分別腹腔注射80 mg/kgmb環(huán)磷酰胺溶液（0.5 mL/只），連續(xù)3 d，誘導(dǎo)小鼠免疫抑制[14]?；趯φＰ∈蠊辔笇?shí)驗(yàn)結(jié)果，MDY組采用DB組灌胃劑量標(biāo)準(zhǔn)，0.61 g/kgmb蛹蟲草水溶液連續(xù)灌胃21 d（0.5 mL/只），CK組和MD組灌胃同等體積蒸餾水。在灌胃0、7、14、21 d分別開展免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測，具體操作見1.3.2～1.3.4節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行整理，采用SPSS 20.0軟件中單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，顯著性檢驗(yàn)水平α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠免疫狀態(tài)的影響

2.1.1 對基礎(chǔ)免疫狀態(tài)的影響

如圖1所示，相較于ZC組，GB組進(jìn)食量、飲水量出現(xiàn)顯著降低的情況，各組小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)之間均無顯著差異（P＞0.05）。蛹蟲草灌胃第21天，小鼠血清IgG和IgM水平出現(xiàn)較為明顯的升高，其中DB組血清IgG水平由ZC組的（105.63±15.31）ng/mL上升為（136.26±20.41）ng/mL，GB組上升至（120.95±10.97）ng/mL，但均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。與ZC組相比，DB組外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群含量小幅度升高，但無顯著差異（P＞0.05），各組間CD4+/CD8+值也無顯著差異（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組IL-2和IL-10血清水平均未產(chǎn)生明顯改變（P＞0.05）。

圖1 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠基礎(chǔ)免疫狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of different doses of C.militaris on the basal immune status of normal mice

2.1.2 對小鼠腸道菌群的影響

α多樣性分析顯示，ZC組Shannon指數(shù)及Chao1指數(shù)最低，ZC、DB、GB 組的Chao 1 指數(shù)分別為317.11±18.54、330.27±13.13、355.36±6.31，Shannon指數(shù)分別為6.17±0.24、6.66±0.22、6.76±0.07，蛹蟲草灌胃處理后小鼠腸道菌群豐富程度和多樣性均上升（圖2A、B）。PCoA結(jié)果顯示，各組樣本位于不同的象限，相對于組間距離，組內(nèi)距離較小，3 組小鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)存在明顯差異（圖2C）。3 組共有OTU 328 個，其中ZC組特有OTU 1 個、DB組3 個、GB組10 個（圖2D），GB組與ZC組間OTU數(shù)量存在顯著差異。測序所得OTU主要分布在7 個門、12 個綱、15 個目、20 個科、38 個屬，F(xiàn)irmicutes、Bacteroidetes及Proteobacteria為各組豐度最高的三大菌門；與ZC組相比，DB組和GB組Firmicutes豐度顯著下降，DB組和GB組Bacteroidetes豐度顯著升高（圖2E、F）。圖2G為各組相對豐度＞1%的前20 名菌屬，其中Lactobacillus、ClostridiumXIVa、Lachnospiracea_incertae_sedis、Alistipes、Helicobacter為各組相對豐度最高的5 個菌屬，各實(shí)驗(yàn)組中Lactobacillus和Alistipes相對豐度均顯著升高（P＜0.05），ClostridiumXIVa、Helicobacter及Lachnospiracea_incertae_sedis顯著降低（P＜0.05）。依據(jù)LDA得分＞2，共獲得5 個對組間腸道細(xì)菌差異具有顯著影響的菌屬，其中，Helicobacter為3 組的共有菌屬，各實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道Helicobacter的豐度顯著降低（P＜0.05），GB組出現(xiàn)Bifidobacterium、Ruminococcus和Turicibacter的富集，未檢測到Clostridium_sensu_stricto（圖2H）。

圖2 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠腸道菌群的影響Fig.2 Effects of different doses of C.militaris on the intestinal flora of normal mice

2.1.3 對腸道TLRs/MyD88/NF-κB信號通路的影響

如圖3所示，相較于ZC組，不同劑量蛹蟲草灌胃均引起小鼠空腸TLR4mRNA表達(dá)量的顯著降低（P＜0.05），DB組TLR2、MyD88mRNA表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），說明低劑量蛹蟲草顯著激活TLR2/MyD88信號通路；但GB組TLR2表達(dá)處于抑制狀態(tài)（P＜0.01），MyD88表達(dá)量未發(fā)生顯著改變（P＞0.05）。同時(shí)，DB組和GB組NF-κBmRNA的表達(dá)量均處于下調(diào)狀態(tài)，GB組顯著低于DB組（P＜0.05），并具有劑量依賴性。

圖3 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠腸道TLRs/NF-κB信號通路的影響Fig.3 Effects of different doses C.militaris on the intestinal TLRs/NF-κB signaling pathway in normal mice

2.2 蛹蟲草對免疫抑制小鼠免疫狀態(tài)的影響

2.2.1 對免疫抑制小鼠基礎(chǔ)生理狀態(tài)的影響

如圖4A～C所示，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量顯著下降，毛發(fā)明顯稀疏，脾臟和胸腺指數(shù)顯著減小（P＜0.05）。蛹蟲草灌胃期間，MD組和MDY組小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量一直顯著低于CK組。至21 d，MDY組毛發(fā)狀態(tài)接近CK組，MD組毛發(fā)稀疏仍然明顯（圖4D）。如圖4E～H所示，相對于MD組，MDY組各臟器指數(shù)更接近CK組。灌胃第7天，MD組和MDY組肝臟及脾臟指數(shù)顯著上調(diào)（P＜0.05），并達(dá)到峰值。此后MD組和MDY組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均呈現(xiàn)降低的趨勢，至灌胃第14天，MDY組和MD組小鼠脾臟、腎臟和胸腺指數(shù)與CK組無顯著差異（P＞0.05）；灌胃21 d，MD組小鼠肝臟指數(shù)仍顯著高于CK組（P＜0.05），MDY組已恢復(fù)正常水平。

圖4 蛹蟲草對免疫抑制小鼠基礎(chǔ)生理狀態(tài)的影響Fig.4 Effects of C.militaris on the basic physiological state of immunosuppressed mice

2.2.2 對免疫抑制小鼠免疫狀態(tài)的影響

如圖5所示，環(huán)磷酰胺處理導(dǎo)致正常小鼠血清IgG、IgM和IL-2含量，及外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和CD4+/CD8+值顯著降低（P＜0.05），血清IL-10含量顯著升高（P＜0.05），小鼠處于典型的免疫抑制狀態(tài)。灌胃期間，MDY組和MD組的小鼠血清IgG及IgM含量均呈現(xiàn)緩慢上升的狀態(tài)，灌胃第7天，均與CK組已無顯著差異（P＞0.05），至灌胃第21天，MDY組IgG質(zhì)量濃度由CK組的（78.40±32.82）ng/mL上升至（118.39±15.31）ng/mL，IgM質(zhì)量濃度由CK組的（1.86±0.26）ng/mL上升至（2.67±0.40）ng/mL，顯著高于其他兩組（P＜0.05）。蛹蟲草灌胃期間，MDY組外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群數(shù)量始終高于MD組，并早于MD組恢復(fù)至CK組的水平。灌胃14 d開始，MD組IL-2質(zhì)量濃度持續(xù)降低，由CK組的（103.62±9.15）pg/mL下降至（88.61±2.28）pg/mL，MDY 組I L-2 含量在灌胃第7 天與CK 組無顯著差異（P＞0.05）。至灌胃結(jié)束，各實(shí)驗(yàn)組血清IL-10含量始終高于CK組（P＞0.05）。

圖5 蛹蟲草對免疫抑制小鼠免疫狀態(tài)影響Fig.5 Effect of C.militaris on immune status in immunosuppressed mice

3 討論與結(jié)論

免疫應(yīng)答是由免疫器官、免疫細(xì)胞、體液因子和細(xì)胞因子組成的、相互協(xié)作的功能網(wǎng)絡(luò)。本實(shí)驗(yàn)首先從臟器指數(shù)、血清IgG、IgM、IL-2和IL-10水平及外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量幾個方面評價(jià)了蛹蟲草對正常小鼠免疫應(yīng)答的影響，研究結(jié)果顯示，雖然不同劑量蛹蟲草對上述檢測指標(biāo)均未產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05），但是檢測到DB組小鼠血清IgG及IgM水平、外周血CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量均出現(xiàn)不同程度的升高。這說明低劑量蛹蟲草從某種程度上可以影響正常機(jī)體的抗體分泌和T淋巴細(xì)胞增殖，但是不會引起機(jī)體免疫狀態(tài)的失衡。因此，選用DB組蛹蟲草灌胃劑量開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為了進(jìn)一步探討蛹蟲草對機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究利用環(huán)磷酰胺建立了小鼠免疫抑制模型[15]。結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠肝臟、脾臟以及胸腺均受到明顯的損傷，血清IgG和IgM水平及T淋巴細(xì)胞含量顯著降低（P＜0.05），小鼠處于典型的免疫抑制狀態(tài)。灌胃期間MDY組CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量始終高于MD組，灌胃第14天開始，蛹蟲草已有效抑制了環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的IL-2水平持續(xù)降低；灌胃結(jié)束，MDY組IL-2含量已恢復(fù)至CK組水平（P＞0.05）。CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞又稱輔助性T細(xì)胞，其分泌的IL-2不僅可以正反饋刺激T淋巴細(xì)胞的持續(xù)增殖，同時(shí)能夠促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化和抗體分泌[16]。李丹等[17]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草可提高正常小鼠脾臟CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞含量，顯著促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)因子IL-2的表達(dá)。蛹蟲草發(fā)酵液不僅能夠有效提高環(huán)磷酰胺抑制小鼠的脾細(xì)胞增殖活性，同時(shí)能夠恢復(fù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的IL-2、干擾素（interferon，INF）-γ、TNF-α和IL-10水平的下降，發(fā)揮免疫激活的作用[18]。蛹蟲草胞外多糖可明顯增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖，提高血清IL-6，IL-2，IFN-γ及TNF-α的水平，其免疫調(diào)節(jié)效果顯著[9]。此外，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蛹蟲草對免疫抑制小鼠Ig的分泌具有明顯的促進(jìn)作用。MDY組小鼠IgG和IgM水平早于MD組接近CK組狀態(tài)；在灌胃21 d，兩種Ig水平出現(xiàn)大幅上升，IgG質(zhì)量濃度上升至（118.39±15.31）ng/mL，IgM上升至（2.67±0.40）ng/mL，遠(yuǎn)高于CK組水平（P＜0.05）。Ig是體液免疫的主要功能執(zhí)行分子，血清IgG和IgM水平的降低是判斷體液免疫功能缺陷的常用標(biāo)準(zhǔn)[19]，Yu Yue等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草胞外多糖AESP-II可以促進(jìn)免疫抑制小鼠T、B細(xì)胞的增殖，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞IgA、IgG和IgM的分泌，日糧中添加蛹蟲草菌絲體可促進(jìn)大鼠血清IgG、IgM水平的提升[20]，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。因此，結(jié)合蛹蟲草對正常小鼠免疫狀態(tài)的影響分析可知，蛹蟲草可以促進(jìn)IL-2、B淋巴細(xì)胞IgG和IgM的分泌。蛹蟲草對機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫均具有激活作用，參與機(jī)體免疫抑制狀態(tài)的修復(fù)。

代謝和免疫是腸道菌群的兩大核心功能，腸胃存在人體約70%的免疫細(xì)胞和最大密度的微生物菌群，參與機(jī)體的免疫防御、物質(zhì)代謝等重要生理過程，被廣泛用于預(yù)測腸道健康與免疫狀態(tài)[21-23]。服用蛹蟲草后小鼠腸道菌群多樣性及豐富度都顯著升高，并呈劑量依賴性，同時(shí)菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，如Firmicutes/Bacteroidetes顯著降低。通過對各組相對豐度最高的前5 個菌屬進(jìn)行篩選比較，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草增加了腸道Lactobacillus和Alistipes相對豐度，降低了Clostridium XIVa、Lachnospiracea_incertea_sedis和Helicobacter相對豐度。Lactobacillus是臨床常用益生菌制劑的來源菌屬，可以幫助人體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)，通過抑制有害菌的繁殖維護(hù)腸道健康，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力[24]，Alistipes主要存在于健康人體的腸道中，在結(jié)腸炎、自閉癥譜系障礙、各種肝臟和心血管纖維化疾病中具有促進(jìn)健康的作用[25]。而ClostridiumXIVa、Lachnospiracea_incertea_sedis和Helicobacter均與腸道炎癥的發(fā)生具有一定正相關(guān)性[26-27]，ClostridiumXIVa能夠促進(jìn)Th17的增殖及IL-17、IL-22等免疫因子的分泌，直接誘導(dǎo)腸道炎癥的發(fā)生[28]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了對組間腸道菌群差異具有顯著影響的標(biāo)志性菌屬，高劑量蛹蟲草引起小鼠腸道富集了Bifidobacterium、Ruminococcus和Turicibacter3 個新的菌屬，同時(shí)抑制了具有潛在致病性Clostridium_sensu_stricto菌群的出現(xiàn)。蔡玟等[29]研究顯示，Bifidobacterium補(bǔ)充劑的使用可以增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫功能及NK細(xì)胞活性。在結(jié)腸炎誘導(dǎo)模型中，野生型小鼠模型腸道中Turicibacter的比例明顯高于Tnf-/-小鼠，這表明Turicibacter與TNF參與的抗炎過程有關(guān)[30]。蛹蟲草可以通過優(yōu)化腸道菌群參與腸道的免疫防御。

TLRs在炎癥反應(yīng)及免疫細(xì)胞調(diào)控方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，TLR2和TLR4可以特異性識別大部分已知的病原體相關(guān)分子模式，對于維持腸道黏膜完整性、調(diào)控腸道功能及菌群組成等具有積極的作用[31]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛹蟲草對空腸組織的TLR2和TLR4具有不同的激活模式，低劑量蛹蟲草激活了TLR2/MyD88信號通路，高劑量則呈現(xiàn)抑制作用。對TLR4的表達(dá)則具有穩(wěn)定的抑制作用。但整體而言，小鼠空腸NF-κB的表達(dá)量受到了明顯的抑制。研究顯示，TLR4是介導(dǎo)蛹蟲草免疫調(diào)節(jié)蛋白CMIMP誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化的真正受體，而非TLR2[12]。蛹蟲草多糖CMPB90-1則通過與TLR2結(jié)合，導(dǎo)致與M2腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1表型極化[10]。由于蛹蟲草生物活性成分的多樣性，TLR2和TLR4產(chǎn)生了不同的應(yīng)答效果。脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型經(jīng)蟲草酸和蟲草素處理24 h，TLR4、NF-κB的表達(dá)量均受到顯著抑制（P＜0.05）[32]。Zheng Hongmei等[33]研究結(jié)果顯示，蛹蟲草可下調(diào)豬結(jié)腸TLR4/MyD88/NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，顯著下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-12水平（P＜0.05），改善豬十二指腸免疫屏障功能。NF-κB是TLRs信號通路的效應(yīng)分子，廣泛參與炎性介質(zhì)和前炎性介質(zhì)的調(diào)控，拮抗NF-κB的活化或活性可起到有效抗炎的效果[34-35]。綜上，蛹蟲草可以通過影響機(jī)體腸道菌群改善腸道免疫功能，對于機(jī)體避免腸道炎癥發(fā)生具有積極的意義。