王鵬 胥維昌 王遠(yuǎn)

(沈陽化工研究院，遼寧 沈陽 110000)

引言

甘草屬(Glycyrrhiza)是多年生草本植物，隸屬于豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)[1]。甘草是我國傳統(tǒng)中藥，具有鎮(zhèn)痰去咳、清熱解毒、抗炎、抗變態(tài)和抗腫瘤等效果[2]。研究表明，甘草黃酮在上述效果中均發(fā)揮著重要作用[3]。由于甘草黃酮種類繁多、含量低、水溶性較差，目前市場上缺少甘草黃酮的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品。超臨界二氧化碳萃取技術(shù)是一種先進(jìn)的萃取分離技術(shù)，利用超臨界CO2流體具有的特殊溶解能力進(jìn)行天然植物有效成分的提取，較傳統(tǒng)溶劑提取具有操作溫度低近于室溫，壓力不高，萃取劑回收方便，臨界點(diǎn)容易達(dá)到，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[4]。與以往研究超臨界二氧化碳萃取甘草黃酮的試驗(yàn)不同的是，本次試驗(yàn)全面優(yōu)化了可能對結(jié)果產(chǎn)生影響的所有因素，并對萃取液成分進(jìn)行了分析，分離鑒定主要化合物，對深入研究甘草黃酮的提取分離有重要作用。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

10L超臨界萃取裝置，購于貴州航天烏江機(jī)電公司；UV-1800型紫外可視分光光度計(jì)，Agilent1260系列液相色譜儀等。

1.1.2 材料

寧夏固原人工種植的烏拉爾甘草，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%以上的二氧化碳，其余試劑均購于國藥。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘草總黃酮含量的測定方法

采用硝酸鋁比色法測定黃酮含量[5]。以蘆丁作為對照標(biāo)品進(jìn)行黃酮含量測定，以吸光度為縱坐標(biāo)，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 黃酮萃取率和浸膏中黃酮含量計(jì)算

以黃酮萃取率和黃酮含量為標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化萃取參數(shù)，計(jì)算公式：

1.2.3 傳統(tǒng)溶劑提取

將甘草烘干粉碎，過40目篩，稱重后置于燒瓶內(nèi)，加入70%乙醇，物料比為甘草粉∶70%乙醇=1g∶20mL，85℃熱回流提取2h。

1.2.4 超臨界萃取工藝流程

將甘草烘干粉碎，過40目篩，稱重后進(jìn)行超臨界萃取，待萃取完成后接取萃取液，過濾后測定甘草黃酮萃取率。將萃取液旋蒸烘干至恒重，測定其浸膏中黃酮含量。

1.2.5 工藝優(yōu)化

1.2.5.1 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)主要考察上樣量、攜帶劑種類、攜帶劑用量比、萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間對甘草黃酮萃取率和浸膏中黃酮含量的影響。

1.2.5.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇萃取溫度、萃取壓力、攜帶劑種類、上樣量為響應(yīng)變量設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)得到最佳工藝條件。

1.2.6 HPLC分析

利用HPLC對浸膏進(jìn)行分析，色譜條件為流動(dòng)相為甲醇(C)和0.1%磷酸水溶液(D)，梯度洗脫程序：20%C和80%D，1min；100%C和0%D，80min；100%C和0%D，90min；20%C和80%D，95min；20%C和80%D，105min。進(jìn)樣量5μL，流速1.0mL·min-1，溫度30℃，檢測波長210nm。

1.2.7 主要化合物的分離鑒定

通過硅膠柱層析分離浸膏中主要化合物，將分離純化后的化合物通過核磁共振波譜法鑒定其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

初始萃取條件為上樣量200g，萃取時(shí)間3h，萃取溫度50℃，萃取壓力30MPa，攜帶劑為無水乙醇，攜帶劑用量比為1g∶5mL。本工藝參數(shù)除了在考察影響因素對萃取率的影響而變化外，其余參數(shù)固定同上。

2.1.1 上樣量的優(yōu)化

上樣量的試驗(yàn)結(jié)果見圖1a，浸膏中黃酮含量幾乎不受上樣量的影響；黃酮萃取率隨上樣量增大而減小，隨著上樣量增大，二氧化碳和攜帶劑與甘草粉的接觸幾率降低而使萃取率下降，在保證萃取率的同時(shí)要增大萃取的效率，在該試驗(yàn)條件下選擇200g的上樣量。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 攜帶劑種類優(yōu)化

攜帶劑種類優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果見圖1b，黃酮萃取率與黃酮含量的趨勢一致，其中氨水與乙醇聯(lián)合使用時(shí)二者同時(shí)最高，85%乙醇作為攜帶劑對甘草黃酮的萃取率高于純乙醇，水作為攜帶劑對甘草黃酮的萃取率最低。不加入任何攜帶劑的超臨界二氧化碳流體僅能對極性較低的親脂性物質(zhì)及相對分子質(zhì)量較低的脂肪烴類物質(zhì)進(jìn)行萃取，黃酮類物質(zhì)極性較大，需使用攜帶劑調(diào)節(jié)極性。使用水作為攜帶劑能調(diào)節(jié)極性，但甘草黃酮水溶性較差，在萃取階段效果差，在分離階段要使黃酮溶于水一起流出也會(huì)使得萃取率低。黃酮能溶于一定濃度的醇溶液，因此85%乙醇較于純乙醇極性更大，更加適合甘草黃酮的萃取。氨水與乙醇聯(lián)合使用對甘草黃酮的萃取率最高的原因是甘草黃酮分子中多為酚羥基，顯酸性，易溶于堿性溶液。

2.1.3 萃取溫度對甘草黃酮萃取率的影響

萃取溫度優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果見圖1c，50℃為甘草黃酮的最佳萃取溫度，萃取率達(dá)到11.8%，增加或者降低溫度都會(huì)降低萃取率。隨溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，有效成分?jǐn)U散、傳質(zhì)速度加快，流體與有效成分締和機(jī)會(huì)增加，增大萃取率；溫度升高，CO2密度降低，溶解能力下降，使萃取率降低。

2.1.4 萃取壓力對甘草黃酮萃取率的影響

萃取壓力優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果見圖1d，30MPa為該試驗(yàn)條件下最佳萃取溫度，增加或減少萃取壓力都會(huì)降低甘草黃酮的萃取率。隨著萃取壓力的增大，二氧化碳的密度也會(huì)隨之增大，溶解能力增強(qiáng)，傳質(zhì)距離也會(huì)減小，甘草黃酮萃取率則相應(yīng)增加。但隨著萃取壓力的繼續(xù)上升，萃取率緩慢增加達(dá)到最大值，當(dāng)壓力超過一定值后，二氧化碳的擴(kuò)散率會(huì)下降，萃取率降低。

2.1.5 萃取時(shí)間對甘草黃酮萃取率的影響

萃取時(shí)間優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果見圖1e，甘草黃酮萃取率隨萃取時(shí)間的增長而增加，當(dāng)萃取時(shí)間在3h時(shí)，甘草中黃酮已基本被完全萃取，繼續(xù)增長時(shí)間黃酮萃取率提升緩慢反而使其他物質(zhì)被萃取出來，減少黃酮含量并增加試驗(yàn)所需能耗。

2.1.6 攜帶劑用量比對甘草黃酮萃取率的影響

攜帶劑用量比優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果見圖1f，浸膏中黃酮含量隨著攜帶劑用量比的增加而增大，甘草萃取率隨著攜帶劑用量比的增大先增大后減少。攜帶劑的量越多，超臨界二氧化碳流體的極性越大，其對黃酮的提取能力越強(qiáng)；過多的攜帶劑融入二氧化碳流體會(huì)使其對其余物質(zhì)的溶解能力降低。因此，攜帶劑用量比為1g∶5mL最佳。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)，結(jié)果如表1所示。以黃酮萃取率為指標(biāo)，其最佳萃取工藝為A2B2C2D2，以浸膏中黃酮含量為指標(biāo)，其最佳工藝條件為A1B3C2D2，由于A1B3與A2B2對黃酮含量影響較小，故確定最佳工藝條件為A2B2C2D2，即萃取溫度50℃，萃取壓力30MPa，攜帶劑為乙醇∶氨水=100∶5，上樣量為200g。在最佳條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，平均甘草萃取率為18.8%，平均甘草中黃酮含量為36.74%，符合預(yù)期結(jié)果。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同提取方法的比較

傳統(tǒng)溶劑加熱回流提取對甘草黃酮的提取率為43.7%，浸膏中黃酮含量為6.49%。傳統(tǒng)溶劑提取的提取率高于超臨界二氧化碳萃取，但超臨界二氧化碳萃取得到的浸膏中黃酮含量高于傳統(tǒng)溶劑提取，便于后續(xù)分離純化。將2種不同提取方法的萃取液在210nm波長下進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如圖2所示。超臨界二氧化碳萃取富集了化合物一、化合物二、化合物三，較傳統(tǒng)提取更具有選擇性，利于后續(xù)的二次分離。

圖2 2種方式提取浸膏液相色譜分析

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

提取化合物的極性相對較低，采用硅膠柱層析對化合物一、化合物二、化合物三進(jìn)行硅分離純化，并利用核磁波普鑒定其結(jié)構(gòu)。

2.4.1 化合物一

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：423[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.73(1H，D，H-6′)，6.33(1H，d，H-5′)，6.07(1H，s，H-8)，5.18(2H，m，CH)，4.15(1H，m，H-2)，3.87(1H，m，H-2)，3.32(1H，m，H-3)，3.65(3H，s，OCH3)，3.21，3.25(2H，m，CH2)，2.86，2.70(2H，m，H-4)，1.74，1.64(12H，d，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：157.37(C-5)，154.94(C-4″)，153.40(C-9)，153.41(C-2′)，130.07(C-3″′)，129.74(C-3″)，124.78(C-2″′)，124.14(C-2′)，120.20(C-1′)，116.43(C-3′)，113.61(C-6)，107.66(C-5′)，99.17(C-8)，69.88(C-2)，60.46(C-OCH3)，31.07(C-3)，26.88(C-5″)，26.70(C-4)，26.06(C-2″)，26.03(C-4″′)，22.99(C-1″′)，22.81(C-1″)，18.33(C-5″′)，18.21(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與Fukai等[6]研究結(jié)果基本一致，故鑒定化合物一為甘草西定。

2.4.2 化合物二

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：421[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：9.64(1H，s，4′-OH)，9.25(1H，s，8-OH)，6.90(1H，s，H-2′)，6.22(1H，s，H-5′)，6.13(1H，s，H-9)，5.45(1H，d，H-4)，5.20(1H，t，H-2″′)，5.11(1H，t，H-2″)，4.11(2H，m，H-2)，3.78(3H，s，OCH3)，3.14(2H，d，H-2)，2.85(1H，s，H-1″′)，2.69(1H，s，H-1″)，1.59-1.68(12H，d，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：159.94(C-6)，158.55(C-6′)，157.94(C-10)，155.87(C-8)，155.06(C-4′)，131.07(C-3″′)，130.35(C-3″)，125.35(C-2′)，124.21(C-2″′)，124.10(C-2″)，119.77(C-3′)，117.75(C-1′)，115.36(C-7)，106.21(C-5)，99.48(C-9)，97.63(C-5′)，75.46(C-4)，66.40(C-2)，62.61(5-OCH3)，39.20(C-3)，28.31(C-1″′)，26.16(C-5″′)，26.08(C-5″)，22.97(C-1″)，18.31(C-4″)，18.25(C-4″′)。以上數(shù)據(jù)與王英華等[7]研究結(jié)果基本一致，故鑒定化合物二為1-Methoxyficifolinol。

2.4.3 化合物三

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：437[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：9.04(s，1H，6′-OH)，8.20(s，1H，2′-OH)，6.74(d，1H，H-6′)，6.34(d，1H，H-5′)，6.24(s，1H，H-8)，5.15(m，1H，H-2″)，5.08(m，1H，H-2″)，4.13(ddd，1H，H-2)，3.90(t，1H，H-2)，3.71(s，3H，5-OCH3)，3.62(s，3H，7-OCH3)，3.27，3.30(d，2H，1″-CH2)，3.16(m，2H，，1″′-CH2)，2.80(m，1H，H-4)，2.66(dd，1H，H-4)，1.71，1.62(s，12H，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：162.83(C-5)，157.12(C-7)，155.05(C-4′)，153.94(C-2′)，153.52(C-9)，130.13(C-3″′)，128.09(C-3″)，124.45(C-6′)，124.32(C-2″′)，124.14(C-2″)，120.11(C-1′)，116.56(C-3′)，114.72(C-6)，108.67(C-10)，107.77(C-5′)，95.93(C-8)，70.06(C-2)，60.48(5-OCH3)，55.80(7-OCH3)，36.19(C-3)，31.10(C-4)，25.97(C-5″′)，25.90(C-5″)，23.03(C-1″)，22.73(C-1″′)，18.21(C-4″″)，17.98(C-4″)。以上數(shù)據(jù)與Tahara等[8]研究結(jié)果基本一致，故鑒合物三為甘草異黃烷甲。

2.4.4 3種化合物萃取率對比

超臨界二氧化碳萃取與傳統(tǒng)溶劑提取對化合物一、化合物二、化合物三的萃取率結(jié)果見表3，結(jié)果表明，超臨界二氧化碳萃取是一種高效的針對甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲的提取方法。

表3 2種方式提取主要化合物萃取率

2.5 結(jié)論

超臨界二氧化碳萃取針對甘草中甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲3種化合物的聯(lián)合提取效果優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑提取，是一種高效的提取方法，且提取后浸膏中雜質(zhì)組成較少，利于后續(xù)的分離純化，是適合用于制作相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的提取方式。超臨界二氧化碳萃取更具有選擇性，在總黃酮提取方面其提取率不如傳統(tǒng)溶劑提取，而針對甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲3種化合物的提取，超臨界二氧化碳萃取在萃取效率與浸膏中物質(zhì)含量都優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑提取，因此超臨界二氧化碳萃取更適合對這類物質(zhì)進(jìn)行提取。目前超臨界二氧化碳萃取主要用于植物揮發(fā)油的萃取，其組成成分大多為單萜類化合物，即由2個(gè)異戊二烯構(gòu)成的化合物，該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與其吻合，在甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)中都具備2個(gè)異戊二烯基，推斷異戊二烯基可能為在超臨界二氧化碳中的助溶基團(tuán)，對含有2個(gè)異戊二烯基的化合物的提取分離提供一個(gè)新思路。