彭素娟， 溫鎮(zhèn)榕， 馮真英， 陳丹， 王建文， 黃麗平

（1.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東湛江 524001；2.嶺南師范學院，廣東湛江 524048）

高良姜，姜科植物高良姜Alpinia officinarumHance 的干燥根莖，又名南姜、蜜姜，具有溫胃散寒、消食止痛的功效，主要治療脘腹冷痛，胃寒嘔吐，噯氣吞酸。但高良姜辛辣刺鼻，患者依從性差，而微囊是一種由聚合物壁殼和微型容器或包裝物組成的載體，可以防止高良姜受到環(huán)境的影響，降低其毒性并掩蓋其難聞的氣味，提高藥物穩(wěn)定性和大眾接受度。高良姜乙醇提取物作為一種天然黃酮類化合物，具有良好的生物安全性和藥用價值，但其黃酮母核的平面結(jié)構(gòu)造成了水溶性差的特點，嚴重影響了其在腸道內(nèi)的代謝吸收，導致口服生物利用度較低，在一定程度上限制了藥效作用的發(fā)揮。微囊通過用聚合物基質(zhì)或殼包裹固體小顆粒、液體液滴或固體在液體中的分散體，制造粒徑在1～1 000 μm 之間的微膠囊，能夠有針對性地控制核心活性物質(zhì)的釋放，掩蓋藥物的不良口味和氣味，減少胃腸道刺激和潛在毒性。以特定囊材制備微囊，可以做到定向給藥，避免首過效應(yīng)等破壞藥效，有效提高了藥物的活性和穩(wěn)定性。因此，采用微囊包裹高良姜乙醇提取物，促進藥物活性及穩(wěn)定性，從而增強療效，具有理論依據(jù)及研究前景。本研究以阿拉伯膠（GA）-殼聚糖（CS）為壁材，高良姜乙醇提取物為芯材，采用復合凝聚法制備高良姜乙醇提取物微囊，并優(yōu)化制備工藝，進行表征分析，考察釋放性能，以期為相關(guān)制劑的研究提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 儀器AL104 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SN-OES-100SH懸臂式電動攪拌器（上海尚普儀器設(shè)備有限公司）；Nicolet6700 傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀（美國Fisher Scientific 公司）；XL-30掃描電子顯微鏡（荷蘭PHILIPS 儀器有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州榮華儀器制造有限公司）；80-2 電動離心機（常州澳華儀器有限公司）；KQ-700E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；1MA-70 制冰機（常熟市雪科電器有限公司）；E200生物顯微鏡（尼康儀器有限公司）；L600-1高效液相色譜（HPLC）儀（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑高良姜飲片由廣東豐硒良姜有限公司提供，經(jīng)嶺南師范學院周中流教授鑒定，保存于天然藥物化學實驗室。高良姜乙醇提取物由課題組實驗室制備。殼聚糖（CS）、阿拉伯膠（GA）、冰醋酸、氫氧化鈉、吐溫-80、甲醛、乙腈、磷酸、甲醇等試劑，均為分析純，均購買于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 高良姜乙醇提取物的制備方法取適量高良姜飲片粉碎成粗粉，脫脂24 h，揮干石油醚。依次加入40 倍量95%、60%乙醇，每次回流提取4 h，過濾，合并所得的濾液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味。將粗提物加適量的水混勻，煮沸，加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至10～11，煮沸1 h，過濾，重復2次，合并濾液。濾液加入1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至1～2，水浴保溫30 min，放置7 ～24 h。析出沉淀，離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水抽洗2～3 次，40 ℃真空干燥，即得高良姜乙醇提取物。

2.2 高良姜乙醇提取物微囊的制備方法準備濃度為0.05%、2%的阿拉伯膠水溶液，45 ℃恒溫水浴，攪拌，待用。將高良姜乙醇提取物與80%的乙醇溶液以1∶10的比例進行計量混合（誤差不超過0.1%），再與阿拉伯膠水溶液相結(jié)合，吐溫-80（濃度為1.06～1.10 g/mL）用作乳化劑放入上述溶液中。將混合液放入45 ℃的恒溫浴缸中，攪拌45 min，同時緩緩滴入殼聚糖溶液，得均勻的混合乳液[1-3]。用10%氫氧化鈉溶液將其pH值調(diào)整到低于阿拉伯膠等電點（將系統(tǒng)pH 值調(diào)整到3.8～4.2），形成微囊。加入一倍體系量蒸餾水（蒸餾水提前置于水浴中，使蒸餾水溫度與混合液溫度相近），將燒杯從水浴鍋中取出，自然冷卻至30～35 ℃，后移至冰水?。?～10 ℃）中攪拌，冷卻至10 ℃。量取一定量的甲醛，用蒸餾水將甲醛稀釋一倍，再緩慢滴加至上述溶液中。此后，將上述溶液pH 值調(diào)整到8 ～9，并攪拌2 h。12 h 預(yù)凍后，置于真空凍干器中烘干24 h即得高良姜乙醇提取物微囊[4-7]。

2.3 高良姜乙醇提取物微囊的單因素試驗在制備過程中發(fā)現(xiàn)壁材比（GA/CS）、芯壁比、凝聚時間、固化劑用量、固化時間和pH 值等多種因素對高良姜乙醇提取物微囊載藥量與包封率的影響，確定以壁材比、芯壁比、凝聚時間、固化劑用量為主要因素進行單因素試驗。供試品溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過后檢測微囊中高良姜乙醇提取物含量，根據(jù)公式1 和公式2 分別計算高良姜乙醇提取物微囊的載藥量和包封率。

2.3.1 壁材比（GA/CS） 固定芯壁比為1∶5，壁材濃度分別為阿拉伯膠液2%、殼聚糖0.5%，設(shè)定壁材比分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1和7∶1，測定載藥量和包封率。

由圖1可知，隨著阿拉伯膠在壁材中的含量的增加，高良姜乙醇提取物微囊的藥物含量即載藥量先是上升，然后是略微下降，包封率亦是先逐漸上升再下降。這是由于當壁材比為4∶1時，該系統(tǒng)具有最小的自由基密度，不利于阿拉伯膠與殼聚糖間靜電作用生成阿拉伯膠-殼聚糖；而當阿拉伯膠比增加時，系統(tǒng)的自由基密度增加，則有利于阿拉伯膠與殼聚糖間靜電作用生成阿拉伯膠-殼聚糖復合物。當壁材比為7∶1時，因為阿拉伯膠具有增稠性能，在阿拉伯膠含量增加時，體系的黏度變大，影響阿拉伯膠-殼聚糖復合物的形成，因此，包封率有所降低。綜合考慮高良姜乙醇提取物微囊的載藥量和包封率，選擇壁材比為6∶1 為最佳壁材比。

圖1 壁材比（GA/CS）對高良姜乙醇提取物微囊載藥量和包封率的影響Figure 1 Effect of wall material ratio（GA/CS）on drug loading and encapsulation efficiency of microcapsules of galangal ethanol extract

2.3.2 芯壁比 固定壁材比為3∶1，壁材濃度分別為阿拉伯膠液2%、殼聚糖0.5%，設(shè)定芯壁比分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1，測定載藥量和包封率。

由圖2可知，隨著芯壁比的增加，高良姜乙醇提取物微囊的載藥量一直升高，包封率先逐漸升高后降低。這可能的原因是，當增加高良姜乙醇提取物的比例時，阿拉伯膠和殼聚糖包封高良姜乙醇提取物的概率增大，因此載藥量一直升高。但隨著芯材的比例增加，壁材的比例相對減少，阿拉伯膠和殼聚糖發(fā)生電荷相互作用形成微囊的壁變薄，當芯壁比增大到2∶1時，形成的微囊變得不穩(wěn)定，可能使復合壁材破裂，原本包封的芯材釋放出來，導致包封率反而有所降低。綜合考慮載藥量和包封率，選擇芯壁比1∶1為最佳芯壁比。

圖2 芯壁比對高良姜乙醇提取物微囊載藥量和包封率的影響Figure 2 Effect of core to wall ratio on drug loading and encapsulation efficiency of microcapsules of galangal ethanol extract

2.3.3 凝聚時間 固定壁材比為3∶1，芯壁比為1∶3，壁材濃度分別為阿拉伯膠液2%、殼聚糖0.5%，設(shè)定凝聚時間分別為15、30、45、60 min，測定載藥量和包封率。

由圖3可知，隨著凝聚時間的增加，高良姜乙醇提取物微囊的載藥量先略微升高后又略微降低，包封率先逐漸升高后降低?？赡苁前殡S著凝聚時間的增長，阿拉伯膠和殼聚糖發(fā)生電荷相互作用形成微囊增多，但凝聚時間達到45 min 后，伴隨著凝聚時間的增長，溶液內(nèi)微囊變多，原本包封的芯材和壁材相對變少，比例也相對減少，阿拉伯膠和殼聚糖發(fā)生電荷相互作用形成微囊變得不穩(wěn)定，可能使復合壁材破裂，原本包封的芯材釋放出來，導致載藥量和包封率反而有所降低。綜合考慮載藥量和包封率，選擇凝聚時間為45 min為最佳條件。

圖3 凝聚時間對高良姜乙醇提取物微囊載藥量和包封率的影響Figure 3 Effect of coacervation time on drug loading and encapsulation efficiency of microcapsules of galangal ethanol extract

2.3.4 固化劑用量 固定壁材比為3∶1，芯壁比為1∶3，壁材濃度分別為阿拉伯膠液2%、殼聚糖0.5%，設(shè)定固化劑用量分別為1.5、3、4.5、6 mL，測定載藥量和包封率。

由圖4可知，隨著固化劑用量增加，高良姜乙醇提取物微囊的載藥量先略微增高后基本保持穩(wěn)定，包封率先增加后基本保持穩(wěn)定。其主要原因是甲醛中的醛基與殼聚糖中氨基發(fā)生Schiff 堿作用，使其與殼聚糖分子間產(chǎn)生了化學交聯(lián)，具有了較好的包封性。提高固化劑的用量，有利于微囊的形成。體系中氨基大部分已反應(yīng)，因此繼續(xù)增加固化劑用量對形成微囊的影響便不再顯著。綜合考慮載藥量和包封率，選擇固化劑用量3 mL為最佳條件。

圖4 固化劑用量對高良姜乙醇提取物微囊載藥量和包封率的影響Figure 4 Effect of curing agent dosage on drug loading and encapsulation efficiency of microcapsules of galangal ethanol extract

2.4 正交試驗法探究高良姜乙醇提取物微囊的最佳制備工藝

2.4.1 正交試驗設(shè)計 采用正交試驗法探究復合凝聚法制備高良姜乙醇提取物微囊的最佳條件，確定影響微囊載藥量和包封率的顯著因素。綜合前述的單因素試驗結(jié)果，確定本次正交試驗的模型為L9（34），即包括4 個因素[壁材比（A）、芯壁比（B）、凝聚時間（C）和固化劑用量（D）]和3 個水平，并選擇載藥量和包封率作為評價指標來安排試驗，所選因素和水平見表1。

表1 復合凝聚法制備工藝的因素和水平Table 1 Factors and levels of preparation process of composite coacervation method

以載藥量為評價指標，從表2 中極差R值大小可以看出，各因素作用主次均為A＞B＞C＞D，對載藥量的影響最小者為D項，所以把D項作為誤差相處理，進行方差分析；以包封率為評價指標，從表2 中極差R值大小可以看出，各因素作用主次均為B＞A＞D＞C，對包封率的影響最小者為C項，所以把C項作為誤差相處理進行方差分析。

表2 正交試驗法制備高良姜乙醇提取物微囊的試驗結(jié)果及分析Table 2 The experimental results and analysis of the preparation of microcapsules of galangal ethanol extract by orthogonal test

從表3 可知，以載藥量為評價指標時，A、B、C的P值均小于0.05，因此，A、B、C三個因素對高良姜乙醇提取物微囊的載藥量影響均有顯著性意義，以A3B3C3D2為最佳。以包封率為評價指標時B因素的P值小于0.05，因此，B因素對高良姜乙醇提取物微囊包封率的影響具有顯著性意義，以A3B3C3D2為最佳。對藥物的載藥量和包封率進行全面分析，最終確定A3B3C3D2為最優(yōu)制備條件。即壁材比為6∶1，芯壁比為1∶1，凝聚時間為45 min 和固化劑用量為3 mL。

表3 正交試驗法制備高良姜乙醇提取物微囊的方差分析Table 3 Analysis of variance of microcapsules of galangal ethanol extract prepared by orthogonal test

2.4.2 高良姜乙醇提取物微囊最優(yōu)制備工藝的驗證試驗 根據(jù)正交試驗所得數(shù)據(jù)進行分析，以高良姜乙醇提取物微囊的載藥量和包封率為指標，篩選出最優(yōu)工藝，根據(jù)該工藝平行制備3 組樣品，以進一步驗證最優(yōu)工藝的準確性。由表4可知，本研究選取A3B3C3D2最佳制備工藝進行最佳制備工藝驗證，載藥量為27.17%（±2%），包封率80.07%（±2%），綜合考慮包封率與載藥量，最佳制備工藝條件下所制得高良姜乙醇提取物微囊的載藥量與包封率均高于單因素試驗與正交試驗中的微囊。

表4 高良姜乙醇提取物微囊的驗證試驗結(jié)果Table 4 The verification test results of microcapsules of galangal ethanol extract

2.5 高良姜乙醇提取物微囊的HPLC分析

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Pgrandsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液（57∶43）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10μL。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取高良姜乙醇提取物33.30 mg 置于10 mL 量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解后，定容。分別量取該溶液0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 并置于10 mL 容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液，避光冷藏備用。

2.5.3 供試品溶液的制備 準確稱量0.1 g干燥高良姜乙醇提取物微囊置于10 mL容量瓶中，加入甲醇超聲至微囊壁完全破裂，冷卻后用甲醇補足定容，搖勻即得供試品溶液。

2.5.4 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液10 μL 進樣，測定其峰面積，根據(jù)測定結(jié)果建立以峰面積為縱坐標（y）、以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（x）的標準曲線，可得到回歸方程為y=42 983x+4 827.3（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，高良姜乙醇提取物的濃度在3.33 ～166.50μg/mL 時，其濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。見表5、圖5。

表5 高良姜乙醇提取物標準曲線數(shù)據(jù)Table 5 Standard curve data of galangal ethanol extract

圖5 高良姜乙醇提取物的標準工作曲線Figure 5 Standard working curve of galangal ethanol extract

2.5.5 高良姜乙醇提取物微囊的HPLC分析 HPLC測定微囊中高良姜乙醇提取物有效成分含量，1 峰為高良姜素，結(jié)果表明：高良姜乙醇提取物微囊中有效成分和助劑等雜質(zhì)完全分離，峰形對稱，且保留時間較短，節(jié)約了分析時間。與標樣色譜圖對比，微囊包裹的高良姜乙醇提取物含量更高，證明高良姜乙醇提取物微囊的穩(wěn)定性更佳。HPLC色譜圖見圖6。

圖6 高良姜乙醇提取物微囊（A）與標樣（B）的HPLC色譜圖Figure 6 HPLC chromatograms of microcapsules of galangal ethanol extract（A）and standard samples（B）

2.5.6 溶出度的測定 稱取高良姜乙醇提取物微囊適量，置于溶出度測定儀，設(shè)定溫度為（37 ±0.5）℃，溶出介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.8）[8]900 mL，以100 r/min 轉(zhuǎn)速攪拌，分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h 各取5 mL 溶出液（同時向溶出杯中補加5 mL PBS），用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液3 批（批號為樣品A、樣品B、樣品C）在254 nm 波長處測定吸光度，按“2.5.4”項下標準曲線計算累積溶出度。

由圖7可知，高良姜乙醇提取物微囊在試驗開始的0.5 h 內(nèi)未出現(xiàn)明顯的突釋現(xiàn)象，1 h 內(nèi)囊壁中的藥物與部分囊芯藥物釋放，1 ～12 h 囊芯藥物釋放較為平穩(wěn)，避免了普通藥物制劑的峰谷波動情況出現(xiàn)，說明此工藝條件下制備的高良姜乙醇提取物微囊具有一定的緩釋性能。

圖7 高良姜乙醇提取物的溶出度曲線Figure 7 Dissolution profiles of galangal ethanol extract

2.6 方法學考察

2.6.1 穩(wěn)定性 取同一份高良姜乙醇提取物微囊供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h時進樣，按“2.5.1”項下的色譜條件進行測定保留時間和峰面積。并計算峰面積的相對標準偏差（RSD）值。

表6可知，峰面積的RSD 為1.43%，結(jié)果表明該供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表6 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 6 Stability test results（n=6）

2.6.2 精密度 精密吸取某一濃度的對照品溶液，連續(xù)進樣6次測定保留時間和峰面積，峰面積的RSD 為1.70%，結(jié)果表明該儀器的精密度良好。具體結(jié)果見表7。

表7 精密度考察結(jié)果Table 7 Precision test results（n=6）

2.6.3 重復性 精密稱取供試品溶液6 份，分別進樣，測定保留時間和峰面積，峰面積的RSD 為0.81%，結(jié)果表明該方法具有良好的重復性。見表8。

表8 重復性考察結(jié)果Table 8 Repeatability examination results（n=6）

2.6.4 加樣回收率 取已知含量的高良姜乙醇提取物6份，精密加入一定量的對照品，制備成供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率和RSD 值。由表9 可知回收率的RSD 為1.26%，結(jié)果說明加樣回收率良好，方法可行。

表9 加樣回收考察結(jié)果Table 9 Results of sample recovery

2.7 掃描電鏡（SEM）分析由圖8 SEM 結(jié)果顯示，高良姜乙醇提取物微囊基本形狀為光滑的球形，幾乎不具有凹陷和不規(guī)則的表面以及不規(guī)則塊狀，未發(fā)現(xiàn)表面出現(xiàn)褶皺、裂縫的微囊，表明高良姜乙醇提取物已被較好地包覆在囊壁材料中[9-10]。

圖8 高良姜乙醇提取物微囊掃描電鏡圖Figure 8 Scanning electron micrograph of microcapsules of galangal ethanol extract

2.8 高良姜乙醇提取物微囊的傅里葉紅外光譜（FTIR）分析利用FTIR 光譜對阿拉伯膠（A）、殼聚糖（B）、高良姜素（C）、ABC 物理混合物（D）和高良姜乙醇提取物微囊（E）進行表征，結(jié)果如圖9所示。

圖9 阿拉伯膠（A）、殼聚糖（B）、高良姜素（C）、ABC物理混合物（D）和高良姜乙醇提取物微囊（E）的紅外光譜分析Figure 9 Infrared spectrum analysis of gum arabic（A），chitosan（B），galangin（C），ABC physical mixture（D）and microcapsules of galangin ethanol extract（E）

從圖9 中可以看到，ABC 物理混合物（D）的紅外光譜和高良姜乙醇提取物微囊（E）的紅外光譜有相似之處，如：與殼聚糖（B）相比，D 和E在1 525.69 cm-1處都有一個酰胺Ⅱ譜帶（N-H）的吸收峰消失；而且與阿拉伯膠（A）相比，D 和E在1 611.57 cm-1處的-COO-對稱伸縮振動和在1 422.97 cm-1處的非對稱伸縮振動吸收峰也都消失。這明顯表示阿拉伯膠中的-COO 和殼聚糖中的-NH2 之間發(fā)生了靜電相互作用[11]。但兩者又有明顯的區(qū)別，在高良姜乙醇提取物微囊（E）的FTIR譜圖中可觀察到在1 540.02 cm-1處C＝N 的伸縮振動吸收峰，這是因為加入甲醛后，甲醛中的醛基和殼聚糖中的氨基發(fā)生Schiff 堿反應(yīng)，生成的C=N鍵。此外，在1 071.95 cm-1處存在的C-O的伸縮振動吸收峰明顯增強，這是因為甲醛和殼聚糖反應(yīng)，使得體系中的C-O 鍵增多。這證明了殼聚糖和甲醛已發(fā)生反應(yīng)，表明甲醛成功對殼聚糖進行交聯(lián)。

3 討論

本研究采用單因素與正交設(shè)計法進行考察研究，因考慮到高良姜有效成分高良姜素不溶于水，而復合凝聚法具有不使用有機溶劑和化學交聯(lián)劑的優(yōu)勢，還可以將非水溶性液體微囊化，產(chǎn)率較高，所以采用以阿拉伯膠、殼聚糖為囊壁材料。高良姜素為囊芯材料，采用復合凝膠法制備高良姜乙醇提取物微囊，并對高良姜乙醇提取物微囊的制備工藝進行優(yōu)化研究。通過高效液相法進行含量測定發(fā)現(xiàn)2種工藝獲得的最優(yōu)工藝參數(shù)為：壁材比為6∶1，芯壁比為1∶1，凝聚時間為45 min，固化劑用量為3 mL。制備的高良姜乙醇提取物微囊，其載藥率和包封率分別達到27.17%和80.07%。通過傅里葉紅外光譜分析確定高良姜乙醇提取物微囊的囊材阿拉伯膠和殼聚糖在固化劑甲醇的交聯(lián)固化作用下交聯(lián)形成微囊，具有較好的包封性。

高良姜中含有多種有效成分，其中主要包括揮發(fā)油、黃酮類、姜油酮類、酚酸類、有機酸類等，對多種胃病的治療和改善腸胃微循環(huán)具有很好的作用。但高良姜乙醇提取物是從單一的高良姜中藥材中提取出來的，對其中活性單體的藥效學研究較少[12]。復合凝聚法制備條件較為溫和，生產(chǎn)效率高，制備的微囊具有較好的環(huán)境耐受性和可控釋放能力，對高良姜乙醇提取物的質(zhì)構(gòu)和穩(wěn)定性都具有重要的作用。因此，深入研究復合凝聚法微囊制備機理，可控制備不同特性的微囊化產(chǎn)品，對于中藥復方的深入研究，尤其是其中的化學成分，以及對其進行分離鑒定和對中藥復方的作用機理等方面的研究具有十分重要的理論意義和實踐價值[13]。