趙平 劉慶靜 楊光 郭瑩瑩 鄒積宏

摘要? 對3個(gè)發(fā)酵批次的紅茶菌發(fā)酵液進(jìn)行宏基因組序列分析，采用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)紅茶菌發(fā)酵液中存在短乳桿菌、植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌、發(fā)酵乳桿菌、戊糖乳桿菌、融合魏斯氏菌、羅伊氏乳桿菌、檸檬明串珠菌、類植物乳桿、副干酪乳桿菌、乳酸片球菌等具有益生功能的細(xì)菌。宏基因組注釋到的功能基因共有76 512個(gè)，其中與代謝過程注釋到的功能基因數(shù)最多，且這些代謝途徑上注釋得到的菌株多數(shù)是益生菌株，主要參與了與碳水化合物代謝相關(guān)的三羧酸循環(huán)、檸檬酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、糖酵解等；與氨基酸代謝相關(guān)主要有丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等代謝途徑。

關(guān)鍵詞? 紅茶菌；益生菌；宏基因組；分析

中圖分類號(hào)? TS272.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）09-0071-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.016

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Metagenomic Analysis of Kombucha Fermentation Broth

ZHAO Ping1，LIU Qing-jing2， YANG Guang3 et al

（1.Heilongjiang Green Food Science Research Institute， Harbin， Heilongjiang 150028;2.Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150008;3.Quality Supervision and Testing Institute of Heilongjiang Province， Harbin， Heilongjiang 150028）

Abstract? The metagenomic sequence analysis of the fermentation broth of three fermentation batches of kombucha was carried out， and the database was used for comparison. It was found that there were mainly Lactobacillus brevis， Lactobacillus plantarum， Weisseria sinusosus， Lactobacillus fermentatum， Lactobacillus pentosus， Weisseria fused， Lactobacillus reuteri， Nebulococci citronicum， Lactobacillus paracasei， Lococci lactate and other bacteria with probiotic function in the fermentation broth of tea fungus. A total of 76 512 functional genes were annotated by metagenomes， among which the most functional genes were annotated by metabolic processes. Most of the strains annotated by these metabolic pathways were probiotic strains， which were mainly involved in the tricarboxylic acid cycle， citric acid cycle， pentose phosphate pathway， glycolysis and so on related to carbohydrate metabolism. The metabolic pathways of alanine， aspartate and glutamate， glycine， serine and threonine are mainly related to amino acid metabolism.

Key words? Kombucha;Probiotics;Metagenome;Analysis

基金項(xiàng)目? 國家市場監(jiān)督管理總局技術(shù)保障專項(xiàng)項(xiàng)目（2020YJ010）；黑龍江省財(cái)政支持項(xiàng)目。

作者簡介? 趙平（1985—），男，黑龍江哈爾濱人，副研究員，從事生物產(chǎn)品開發(fā)、食品微生物檢測研究。

*通信作者，教授，從事食品和藥物物質(zhì)功能的挖掘及開發(fā)研究。

收稿日期? 2023-06-02；修回日期? 2023-07-08

紅茶菌是民間用茶糖水與微生物培育菌苔或菌液而成，因多用紅茶，菌液呈紅色而得名。由于自然發(fā)酵過程而產(chǎn)生對人體有益的活性物質(zhì)，不僅留有紅茶本身的飲用價(jià)值，而且還具有獨(dú)特的保健作用，曾風(fēng)靡一時(shí)作為飲品流行至今［1］。紅茶菌液發(fā)酵一定時(shí)間后，會(huì)形成苔狀似海蜇皮，又稱“海寶”［2］、“紅茶菇”等［3-4］。紅茶菌最早發(fā)現(xiàn)于約公元前220年，因具有解毒提神、助消化、抑菌、抗氧化、護(hù)肝、防癌、抗癌、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)血壓、分解有毒物質(zhì)等藥用價(jià)值被視為珍寶，稱為“胃寶”［5-24］。

紅茶菌的菌群結(jié)構(gòu)、發(fā)酵產(chǎn)物和化學(xué)成分隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展而被逐步深入研究。目前研究表明，紅茶菌是由多年來人工培養(yǎng)馴化多種共生益生菌組成，其中包括細(xì)菌和真菌［25］。在我國紅茶菌雖然有很長的飲用歷史，但仍停留在作坊式階段，易染雜菌、風(fēng)味變化大等問題導(dǎo)致無市場競爭力［26］。因此，探索紅茶菌發(fā)酵液中微生物的群落結(jié)構(gòu)，從基因?qū)用娼忉屛⑸锱c發(fā)酵液風(fēng)味及安全性之間的聯(lián)系十分重要。近年來，宏基因組（Metagenome）測序廣泛應(yīng)用于奶酪、普洱茶、可可豆、發(fā)酵香腸、酒、醬油、食醋等發(fā)酵食品，且取得了一系列的研究成果，這對研究菌群結(jié)構(gòu)及挖掘其功能基因至關(guān)重要［27］。

筆者利用宏基因組學(xué)，對紅茶菌發(fā)酵液中微生物進(jìn)行測序，對結(jié)果序列進(jìn)行優(yōu)化、組裝、去冗余后注釋物種，對微生物的群落結(jié)構(gòu)、功能基因、代謝通路進(jìn)行探索，從基因?qū)用嫣接懳⑸锱c紅茶菌發(fā)酵液中的碳水化合物、氨基酸等代謝通路，闡明微生物在風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生與形成過程中的作用。

1? 材料與方法

1.1? 主要材料

紅茶菌，黑龍江質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院微生物與分子生物學(xué)檢測研究中心保藏。

1.2? 主要儀器和設(shè)備

AOEA580型HiSeq 2 500 高通量測序系統(tǒng)，美國 Illumina 公司；2266型潔凈工作臺(tái)，上海拜艾斯凈化設(shè)備有限公司。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? 樣品檢測。

分別取3批次實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵7 d所得的紅茶菌發(fā)酵液，進(jìn)行宏基因組測序。

1.3.2? 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理及質(zhì)量評(píng)估。

測序數(shù)據(jù)預(yù)處理后將符合要求的產(chǎn)物用 Illumina HiSeq 高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序。篩查下機(jī)的原始數(shù)據(jù)質(zhì)量，去除非目的序列，獲得高質(zhì)量可用于宏基因組分析的數(shù)據(jù)集（Clean data），再對篩查出的Clean data拼接、校正與組裝，構(gòu)建宏基因組疊連群（Contigs）序列集，進(jìn)行去冗余基因預(yù)測，獲得非冗余氨基酸序列集，用于后續(xù)分析。

1.3.3? 紅茶菌微生物多樣性分析。

物種α分析時(shí)首先對全體樣本種水平的組成譜，在最低測序深度下進(jìn)行隨機(jī)重抽樣，從而校正測序深度引起的多樣性差異。隨后，利用QIIME軟件計(jì)算每個(gè)樣本上述4種多樣性指數(shù)（Chao1、ACE、Shannon、Simpson），對各樣本在不同測序深度下的種水平豐度分布隨機(jī)抽樣，以各深度下抽取到的序列數(shù)與其對應(yīng)的物種數(shù)繪制稀疏曲線。β多樣性分析法，主要采用主成分分析法，通過QIIME和R軟件對樣本進(jìn)行PCA分析，并描述樣本間的差異分布特征。根據(jù)各樣本在種水平的組成譜，使用R軟件可計(jì)算共有、獨(dú)有物種的數(shù)量，并通過Venn圖直觀地呈現(xiàn)各樣本所共有和獨(dú)有的物種數(shù)量。

1.3.4? 紅茶菌微生物功能基因分析。

1.3.4.1? 紅茶菌eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋。

將預(yù)測得到的蛋白序列集與EggNOG數(shù)據(jù)庫（http：//eggnog.embl.de/version_5.0/，v5.0）的參考蛋白序列進(jìn)行比對。比對軟件使用MMseqs2，設(shè)置靈敏度參數(shù)為5.7，選擇alignment得分最高的參考蛋白序列作為比對結(jié)果。通過eggnog-mapper將比對結(jié)果映射到EggNOG的數(shù)據(jù)庫中，提取其分類信息及后續(xù)的GO注釋結(jié)果。將注釋得到的eggNOG結(jié)果及基因的豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應(yīng)的eggNOG直系同源基因簇的豐度。再根據(jù)每個(gè)直系同源基因簇所屬的分類就能統(tǒng)計(jì)不同水平的EggNOG功能類群豐度。

1.3.4.2? 紅茶菌KEGG代謝通路注釋。

將預(yù)測得到的蛋白序列集與KOBAS軟件的蛋白數(shù)據(jù)庫（v2020_10_20）進(jìn)行相似比對，比對軟件使用MMseqs2，設(shè)置靈敏度參數(shù)為5.7，選擇alignment得分最高的參考蛋白序列作為比對結(jié)果。KOBAS參考序列帶有KO注釋，通過將蛋白序列與之比對，即可獲得蛋白序列的KO信息。將注釋得到的KO結(jié)果及基因的豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應(yīng)的KO豐度。最后再使用MinPath推斷存在的代謝通路（KEGG pathway），并統(tǒng)計(jì)其豐度。

1.3.4.3? 紅茶菌GO功能注釋。

蛋白編碼基因的GO注釋采用eggnog-mapper軟件完成，得到的GO編號(hào)通過map2slim得到GOSlim注釋結(jié)果，這一注釋過程參考了記錄GO信息的go-basic.obo文件（http：//purl.obolibrary.org/obo/go/go-basic.obo）。將注釋得到的GO結(jié)果及基因豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應(yīng)的GO豐度。再根據(jù)每個(gè)GO所屬的分類，可以統(tǒng)計(jì)不同水平的GO功能類群豐度。

1.3.4.4? 紅茶菌CAZy功能注釋。

將預(yù)測得到的蛋白序列集與dbCAN（DataBase for automated Carbohydrate-active enzyme Annotation）中的參考蛋白序列（v2021_09_24）進(jìn)行相似比對。比對軟件使用MMseqs2，設(shè)置靈敏度參數(shù)為5.7，選擇alignment得分最高的參考蛋白序列作為比對結(jié)果。將注釋得到的CAZy功能類群結(jié)果及基因的豐度矩陣整合，可以獲取各蛋白對應(yīng)的CAZy酶家族的豐度。再依據(jù)酶所屬的功能模塊統(tǒng)計(jì)不同模塊的CAZy酶家族豐度。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 紅茶菌微生物物種豐度及多樣性

2.1.1? 物種豐度。

圖1為選取種水平上的相對豐度柱狀圖，可直觀反映出A1、A2、A3種水平上豐度排名前20的物種及比例。由圖1可知，3個(gè)樣品主要包括短乳桿菌、植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌、亞洲腸球菌、香腸乳桿菌等。其中，短乳桿菌豐度最高，占總菌數(shù)的70.46%，A1、A2、A3中短乳桿菌分別占70.48%、70.34%、70.57%，說明發(fā)酵不同批次的短乳桿菌豐度差異較小，也再次證明了紅茶菌發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。紅茶菌發(fā)酵液中還包含植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌、亞洲腸球菌，分別占總菌數(shù)的13.34%、3.19%、0.65%，除此之外還有香腸乳桿菌、類食品乳桿菌、萊蒂亞駒形桿菌等。表1為對應(yīng)圖1整理出的相對豐度前十并被世界公認(rèn)的益生菌。益生菌是一類對人體有益，可在腸道定殖并在腸道具有益生功能的一類微生物。由表1可知，紅茶菌中的益生菌主要集中在短乳桿菌、植物乳桿菌、類植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌，在人體中主要起抑菌、降膽固醇、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、維持腸道菌群等作用；食竇魏斯氏菌、副干酪乳桿菌、乳酸片球菌主要起抗氧化作用；戊糖乳桿菌可降血脂血糖、降尿酸，羅伊氏乳桿菌也可防潰瘍、緩解過敏等癥狀。

2.1.2? Alpha 多樣性。

為比較3個(gè)發(fā)酵批次紅茶菌發(fā)酵液的多樣性與豐富度，對Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行比較分析，結(jié)果見表2和圖2。由表2和圖2可知，3個(gè)樣本中，A3樣本菌群中實(shí)際存在的物種數(shù)最多，菌群豐度和多樣性指數(shù)相對較高，A2的Simpson指數(shù)最高，這說明紅茶菌菌種穩(wěn)定，發(fā)酵條件控制較好。

2.1.3? Beta 多樣性。

β多樣性分析主要用于從菌群功能以及物種組成2個(gè)層面考察樣本之間的差異。對宏基因組樣本在數(shù)據(jù)庫中注釋得到的種水平的組成譜分別進(jìn)行PCA分析。PCA分析將原始的高維數(shù)據(jù)通過線性變換組合，投影到維度較低的空間坐標(biāo)系（即主成分）中，從而達(dá)到降維、簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的目的，展現(xiàn)樣本的自然分布，樣品的組成越

近，在PCA圖中反映的距離就越近（圖3）。前2個(gè)主成分

貢獻(xiàn)率分別是96.11%、3.89%，符合主成分分析要求。圖中3個(gè)點(diǎn)之間距離較近，表明2個(gè)樣本的物種組差異較小，有較高相似度。Venn圖顯示，3個(gè)樣本之間存在組間差異，但差異較小。

2.2? 紅茶菌發(fā)酵液微生物功能基因

2.2.1? eggNOG數(shù)據(jù)庫功能注釋。

為了探索紅茶菌發(fā)酵液微生物群落的遺傳組成和功能，利用eggNOG數(shù)據(jù)庫序列對宏基因組學(xué)鑒定的基因進(jìn)行了分析，由圖4可知，共有19 390個(gè)基因被注釋。從圖4中可觀察到代謝功能較為豐富，說明發(fā)酵液中微生物代謝較為旺盛，是與發(fā)酵液風(fēng)味形成最直接的功能分類，共有5 607條基因被注釋，其中氨基酸運(yùn)輸和代謝（1 351個(gè)基因，6.97%）、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化（920個(gè)基因，4.74%）和碳水化合物運(yùn)輸和代謝（1 638個(gè)基因，8.45%）是前三大功能分類，說明氨基酸代謝與碳水化合物代謝均是發(fā)酵的重要過程，功能不明為 4 770條，占 24.60%。

2.2.2? KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋。

將KEGG 代謝通路與蛋白序列利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可以對預(yù)測得到的基因進(jìn)行代謝通路注釋分類，具體信息如圖5所示。從圖5可知，紅茶菌發(fā)酵液在糖代謝（carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）和核苷酸代謝（nucleotide metabolism）中發(fā)揮重要作用，并且碳水化合物相關(guān)的基因數(shù)目最多，高達(dá)2 971條。注釋到翻譯（translation）和復(fù)制和修復(fù)（replication and repair）的基因占遺傳信息分類基因比例高達(dá)80.69%。發(fā)酵液中在 KEGG 代謝通路注釋信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3可知，與新陳代謝相關(guān)的基因數(shù)高達(dá)10 087條，其次為遺傳信息傳遞（2 211）、環(huán)境信息處理（1 800）、人類疾?。?25）、細(xì)胞過程（878）、生物體系統(tǒng)（512），表明在發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的微生物具有代謝活動(dòng)旺盛的特點(diǎn)。

2.2.3? GO數(shù)據(jù)庫功能注釋。

基于GO數(shù)據(jù)庫對發(fā)酵液樣品功能統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示，注釋到53個(gè)功能類別共有38 309個(gè)基因。其中，生物學(xué)途徑（biological process）包括26個(gè)分支，代謝過程（metabolic process）、細(xì)胞過程（cellular process）、發(fā)育（growth）注釋到的基因數(shù)目排名前3，分別為4 055（28.13%）、3 996（27.72%）、1 034（7.17%）個(gè)；細(xì)胞組件（cellular component）包括17個(gè)功能類別，細(xì)胞（cell）和細(xì)胞部分（cell part）共注釋到11 971條基因，占該部分的83.06%；催化活性（catalytic activity）在分子功能（molecular function）中注釋到3 160條基因。

2.2.4? CAZy 蛋白功能注釋。

圖7為CAZy 數(shù)據(jù)庫的具體注釋信息。由圖7可知，CAZy 數(shù)據(jù)庫將這些碳水化合物活性酶分為六大蛋白功能模塊：輔助氧化還原酶（AA）、碳水化合物酯酶（CE）、糖苷水解酶（GH）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）、多糖裂解酶（PL）以及碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）。碳水化合物活性酶中GH的占比最高，其次為GT。GH可以分解碳水化合物分子之間的糖苷鍵，在生物體中多糖的水解和合成中發(fā)揮重要作用。GT則能夠催化活化的糖連接到蛋白、核酸、寡糖等不同的受體分子上產(chǎn)生具有很多生物學(xué)功能的糖基化產(chǎn)物。

2.3? 營養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)代謝通路

2.3.1? 碳水化合物相關(guān)代謝通路及途徑。

通過KEGG注釋結(jié)果可知，注釋到碳水化合物代謝相關(guān)基因高達(dá)2 971條，碳水化合物是發(fā)酵液中發(fā)揮營養(yǎng)作用的主要物質(zhì)。表4中序號(hào)從大到小所注釋到的基因數(shù)越來越少，注釋到糖酵解/糖異生的基因數(shù)在碳水化合物代謝途徑中最豐富，因?yàn)榧t茶菌發(fā)酵液中都含有糖類物質(zhì)，分解為葡萄糖后通過糖酵解途徑生成發(fā)酵中產(chǎn)物乳酸（如圖8所示），乳酸對許多發(fā)酵食品的風(fēng)味形成有重要影響，除乳酸外，甲酸、乙醇乙酸和二氧化碳等也是糖酵解途徑的主要產(chǎn)物。此外，4-磷酸赤鮮糖和磷酸烯醇式丙酮酸也能參與芳香族氨基酸的合成。 另外，檸檬酸循環(huán)也是碳水化合物代謝中的主要途徑。研究表明，某些微生物能通過檸檬酸水解酶將檸檬酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸和乙酸酯，進(jìn)而產(chǎn)生乙酸等風(fēng)味物質(zhì)。此外，檸檬酸代謝中間產(chǎn)物也能夠參與氨基酸代謝途徑合成氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)。

2.3.2? 氨基酸代謝相關(guān)代謝通路及途徑。

氨基酸代謝是風(fēng)味形成途徑中最關(guān)鍵的途徑之一。KEGG 代謝通路注釋到的氨基酸代謝途徑見表5。在紅茶菌發(fā)酵過程中，代謝較為活躍的是天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸。由圖9可知，天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸之間能夠互相轉(zhuǎn)化，谷氨酸與草酰乙酸在天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化下轉(zhuǎn)氨基可形成天冬氨酸。而在氨基酸合成中，都是以天冬氨酸為前體。另外，谷氨酸在丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下可與丙酮酸形成 α-酮戊二酸和丙氨酸，而乙偶姻和雙乙酰等物質(zhì)可經(jīng)丙氨酸或天冬氨酸進(jìn)一步分解代謝生成，而且谷氨酸經(jīng)脫羧后能形成一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)——γ-氨基丁酸。 其次是絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸代謝，其中蘇氨酸和絲氨酸可參與合成蛋氨酸和甘氨酸，而甘氨酸會(huì)形成丙酮酸，從而促進(jìn)產(chǎn)生乙醇與乙酸等風(fēng)味物質(zhì)。紅茶菌發(fā)酵過程中，異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸降解途徑的相對豐度逐漸降低，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香氨基酸代謝途徑的相對豐度也逐漸降低。研究表明，支鏈氨基酸經(jīng)脫羧與轉(zhuǎn)氨后，可還原為 2-甲基丁醇、異丁醇和乙酸異戊酯等風(fēng)味物質(zhì)。而苯香草醛、苯乙酸、乙醛和苯乳酸等風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)主要為苯丙氨酸，酪氨酸降解可形成苯酚。

3? 結(jié)論

通過對紅茶菌發(fā)酵液微生物功能基因注釋結(jié)果可知，新陳代謝被注釋的基因數(shù)最多，且新陳代謝決定著紅茶菌發(fā)酵液的風(fēng)味和營養(yǎng)。該研究與 KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，找出紅茶菌發(fā)酵液中主要營養(yǎng)成分及風(fēng)味物質(zhì)的代謝通路，并對關(guān)鍵代謝通路中的酶、基因、微生物等進(jìn)行分析，從基因?qū)用?，揭示發(fā)酵液風(fēng)味與微生物及安全性之間的聯(lián)系，為紅茶菌發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)制提供參考。另外，發(fā)酵液中還發(fā)現(xiàn)了少量的真菌與噬菌體病毒，大多為發(fā)酵液中常見的微生物，如接合酵母菌屬（Zygosaccharomyces）添加到醬油釀造過程中，顯著提高醬油的風(fēng)味物質(zhì)成分；片球菌屬（Pediococcus）具有產(chǎn)生多種胞外多糖酶，提高抗氧化等作用。

通過對發(fā)酵液中微生物 KEGG 注釋的功能基因進(jìn)行分析得知，注釋功能最多的是代謝方面，其中參與碳水化合物代謝途徑相關(guān)的基因含量最多，氨基酸次之，得到相關(guān)代謝通路的具體信息，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、食竇魏斯氏菌是紅茶菌發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵菌種，說明該代謝通路微生物活動(dòng)最為旺盛，這也是構(gòu)成紅茶菌發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)的主要成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過 KEGG 代謝通路，注釋到的功能基因在Nr 數(shù)據(jù)庫中能夠匹配到相應(yīng)的菌種，但在發(fā)酵液中未找到該菌種，說明在菌種鑒定領(lǐng)域宏基因組數(shù)據(jù)庫存在著局限性。在基因組測序研究中還需更完善的數(shù)據(jù)庫及測序技術(shù)來完成研究。

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