熊雄，薛晗玥，費(fèi)延堻，王詩慧，謝普軍

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211800；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇南京 210042）

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000 年由Notomi 等[1]首次公開的一種核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)在靶標(biāo)的6 個區(qū)域上設(shè)計4 條特異性引物，并利用具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶在等溫條件下進(jìn)行反應(yīng)。自公開以來，LAMP 技術(shù)憑借快速、高效、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在食品摻假檢測[2-3]、人類流行病檢測[4-5]、植物病害檢測[6-7]等方面已得到廣泛應(yīng)用。

LAMP 反應(yīng)需要使用多對引物，集中在體系時容易相互作用形成二聚體結(jié)構(gòu)。此外，內(nèi)引物的長度較長，導(dǎo)致自身錯配易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)[8]，最終產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增[9]。染料法等傳統(tǒng)方法無法區(qū)分由非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽性，造成結(jié)果誤判。而序列特異性檢測方法則是通過使用靶標(biāo)特異性探針或修飾引物作為生物識別元件來進(jìn)行結(jié)果判斷，能夠準(zhǔn)確檢測出擴(kuò)增子且不受非特異性產(chǎn)物的影響[10]。目前，基于LAMP 所設(shè)計的探針包括同化探針[11]、熒光雙向位移探針[12]、自淬滅探針[13]和分子信標(biāo)[14-15]等。其中，自淬滅探針具有設(shè)計簡單、靈敏度高等特點(diǎn)，在LAMP 中逐漸受到關(guān)注[13]。

自淬滅探針是熒光基團(tuán)修飾在內(nèi)引物或環(huán)引物3′端第2、3 位的寡核苷酸序列，其中內(nèi)引物和環(huán)引物以G、C 堿基結(jié)尾并盡可能保證3′端存在豐富的G 堿基[13]。自淬滅探針利用氧化電位低的堿基發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（photoinduced electron transfer，PET）淬滅熒光，僅當(dāng)結(jié)合靶標(biāo)后淬滅才會消失[16]。目前，由于自淬滅探針在反應(yīng)后陽性和陰性表現(xiàn)出肉眼無法區(qū)分的熒光，因此利用自淬滅探針進(jìn)行LAMP 檢測的方法主要包括實(shí)時熒光或結(jié)合其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)可視化。如Gadkar等[13]將環(huán)引物設(shè)計成自淬滅探針檢測水痘-帶狀皰疹病毒，反應(yīng)后根據(jù)實(shí)時熒光曲線判斷是否檢出靶標(biāo)。而在可視化檢測中，Li 等[17]將自淬滅探針與聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）結(jié)合，反應(yīng)后根據(jù)是否出現(xiàn)具有熒光的聚沉物來實(shí)現(xiàn)結(jié)果判斷。

關(guān)于自淬滅探針背景熒光的研究，Nazarenko等[18-19]介紹了一種與自淬滅探針結(jié)構(gòu)類似的熒光標(biāo)記鏈，其與互補(bǔ)序列結(jié)合后出現(xiàn)熒光淬滅，同時利用互補(bǔ)序列淬滅熒光設(shè)計了具有鈍端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光引物，實(shí)現(xiàn)了多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的可視化檢測。然而，在LAMP 的可視化研究中，利用互補(bǔ)序列降低自淬滅探針背景鮮見報道。

因此，本研究以自淬滅探針為研究對象，評估其背景熒光強(qiáng)度和淬滅效率，通過對比不同互補(bǔ)序列對自淬滅探針的淬滅效率，篩選得到設(shè)計簡單且淬滅效率高的互補(bǔ)序列。最終，構(gòu)建出具有低背景熒光的LAMP 體系，為實(shí)現(xiàn)基于自淬滅探針的LAMP 可視化檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BstDNA 聚合酶、100 mmol/L MgSO4、10×Thermo-Pol Buffer：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；dNTP預(yù)混液：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；自淬滅探針和引物合成：通用生物（安徽）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S1010 掌上離心機(jī)：美國賽洛捷克公司；MS-100 恒溫混勻儀：杭州奧盛儀器有限公司；Gentier 96 全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)：西安天隆科技有限公司；F-4700 熒光分光光度計：日本Hitachi 公司；BleEye 藍(lán)光切膠儀（藍(lán)光LED，波長470 nm）：蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 互補(bǔ)序列的設(shè)計

5 種自淬滅探針來自前期研究，包括BIP-FAM[20]、ZJ-FAM[21]、R-FIP-FAM[17]、S-LB-6-FAM[22]和R-LBFAM[17]。該5 種自淬滅探針均可應(yīng)用于對應(yīng)物種的LAMP 擴(kuò)增，滿足基于實(shí)時熒光的LAMP 檢測。同時，根據(jù)自淬滅探針的堿基排列順序進(jìn)行反向互補(bǔ)得到互補(bǔ)序列[16]，并分別對互補(bǔ)序列進(jìn)行引入錯配堿基、延長5′端、縮短5′端和縮短3′端的改造，具體見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences

1.3.2 熒光強(qiáng)度測定

將2.5 μL 的10×ThermolPol Buffer、2 mmol/L MgSO4、0.8 μmol/L 或0.4 μmol/L 的自淬滅探針（其中BIP-FAM、ZJ-FAM 和R-FIP-FAM 為0.8 μmol/L，S-LB-FAM 和RLB-FAM 為0.4 μmol/L）以及0.8 μmol/L 或0.4 μmol/L的互補(bǔ)序列混合，并使用無菌水補(bǔ)足20 μL。利用全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)收集35～97 ℃范圍內(nèi)的熒光，并對35 ℃的熒光強(qiáng)度進(jìn)行記錄。

全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)能夠測定的最低溫度為35 ℃，因此使用熒光分光光度計測定不同溫度混合體系熒光。將配制的20 μL 體系添加至480 μL 滅菌水中稀釋，充分混合。稀釋好的體系分別在-4 ℃、室溫、35 ℃和45 ℃內(nèi)處理30 min。熒光分光光度計的激發(fā)波長設(shè)置為470 nm，掃描速度為1 200 nm/min，光譜帶寬為10 nm，測定不同處理條件下的體系熒光強(qiáng)度。熒光淬滅效率（Kq，%）計算公式如下。

式中：A為起始自淬滅探針熒光強(qiáng)度；B為結(jié)合互補(bǔ)序列后的熒光強(qiáng)度。

1.3.3 LAMP 可視化反應(yīng)體系構(gòu)建

20 μL LAMP 反應(yīng)體系，各成分含量：內(nèi)引物FIP、BIP 各0.8 μmol/L，外引物F3、B3 各0.2 μmol/L，環(huán)引物L(fēng)F、LB、自淬滅探針R-LB-FAM 和互補(bǔ)序列R-LBFAM-HP4 各0.4 μmol/L，0.45 mmol/L dNTP，2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，2 mmol/L MgSO4、8 UBstDNA 聚合酶、1 μL 虹鱒魚DNA（20 ng/μL），用無菌水補(bǔ)足20 μL。LAMP 擴(kuò)增條件為63 ℃恒溫擴(kuò)增60 min[3]。反應(yīng)結(jié)束后體系恢復(fù)至室溫，利用藍(lán)光切膠儀觀察體系熒光，判斷反應(yīng)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)利用Excel 和SPSS 27 軟件進(jìn)行處理統(tǒng)計，并使用Duncan 法多重比較及差異顯著性分析，P＜0.05 認(rèn)為具有顯著差異。采用Origin 2022 軟件繪制分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 互補(bǔ)序列對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響

自淬滅探針與互補(bǔ)序列結(jié)合后熒光強(qiáng)度會發(fā)生降低[18]。為探究自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響因素，測定不同自淬滅探針的熒光強(qiáng)度及結(jié)合互補(bǔ)序列后的熒光強(qiáng)度變化，分析影響自淬滅探針熒光強(qiáng)度的原因。不同自淬滅探針和其互補(bǔ)序列結(jié)合的熒光強(qiáng)度見圖1。

圖1 不同自淬滅探針和其互補(bǔ)序列結(jié)合的熒光強(qiáng)度Fig.1 Fluorescence intensity of different self-quenching fluorogenic probes combined with their complementary sequences

由圖1 可知，根據(jù)Gadkar 等[13]所述方法設(shè)計的自淬滅探針均存在較高的背景熒光，表明基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的熒光淬滅效果較弱。其中，添加量相同時，BIP-FAM 熒光強(qiáng)度顯著高于R-FIP-FAM（P＜0.05），說明熒光基團(tuán)修飾位置越靠近3′末端G 堿基，自淬滅探針的淬滅效果越強(qiáng)，背景熒光強(qiáng)度越低。而ZJ-FAM的熒光強(qiáng)度顯著高于R-FIP-FAM（P＜0.05），說明當(dāng)3′末端為G 堿基時，自淬滅探針的熒光強(qiáng)度更低，G 的淬滅效果更好。

在添加與自淬滅探針完全互補(bǔ)的序列時（BIPHP1、ZJ-FAM-HP1、R-FIP-FAM-HP1、R-LB-FAM-HP1和S-LB-FAM-HP1），自淬滅探針的背景熒光均顯著降低（P＜0.05），與Nazarenko 等[18]的研究結(jié)果一致?？赡艿脑蚴钱?dāng)自淬滅探針與完全互補(bǔ)序列退火結(jié)合時，電子會沿著DNA 雙鏈進(jìn)行傳輸，產(chǎn)生比單鏈DNA 狀態(tài)下更強(qiáng)的淬滅[23]。

ZJ-FAM-HP1、R-LB-FAM-HP1 和S-LB-FAM-HP1對自淬滅探針具有良好的淬滅效果，Kq分別為79.73%、71.87%和68.14%。然而，BIP-HP1 和R-FIP-HP1 對自淬滅探針的淬滅效率Kq分別僅為45.08%和43.44%。該結(jié)果表明互補(bǔ)序列對熒光基團(tuán)修飾在3′端第2 位的自淬滅探針淬滅效果更強(qiáng)，印證了Nazarenko 等[18]關(guān)于熒光基團(tuán)距離3′末端GC 堿基對距離越遠(yuǎn)淬滅效率低的結(jié)論。而對于同樣修飾在熒光基團(tuán)3′端第2 位的自淬滅探針而言，由推導(dǎo)公式可得具有高背景熒光的自淬滅探針，添加互補(bǔ)序列后可對其表現(xiàn)出高淬滅效率。

由于自淬滅探針BIP-FAM 背景熒光信號高，且BIP-HP1 對其淬滅效率低。因此，選擇互補(bǔ)序列BIPHP1，進(jìn)行改造和后續(xù)試驗。

2.2 互補(bǔ)序列上的堿基錯配對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響

互補(bǔ)序列上的堿基錯配對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響見圖2。

圖2 互補(bǔ)序列上的堿基錯配對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of base mispairing on complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

如圖2 所示，調(diào)整BIP-HP1 中與熒光基團(tuán)修飾位點(diǎn)T 配對的堿基A 為T，C 和G，分別得到互補(bǔ)序列BIP-HP-1tbT、BIP-HP-1tbC 和BIP-HP-1tbG。當(dāng)自淬滅探針與此類互補(bǔ)序列結(jié)合時，熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05）。其中BIP-HP-1tbC、BIP-HP-1tbG 和BIPHP1 結(jié)合自淬滅探針后的熒光強(qiáng)度差異均不顯著（P＞0.05），說明BIP-HP-1tbC 和BIP-HP-1tbG 均可以表現(xiàn)出與完全互補(bǔ)序列相同程度的淬滅效果。

然而，BIP-HP-1tbT 雖然對自淬滅探針表現(xiàn)出顯著淬滅（P＜0.05），但其淬滅效率（Kq為34.77%）明顯低于BIP-HP1、BIP-HP-1tbC 和BIP-HP-1tbG（Kq分別為45.08%、47.50% 和43.02%）。由此可知，改造互補(bǔ)序列，形成存在錯配堿基對的雙鏈，難以提高對自淬滅探針的淬滅效果，并且當(dāng)錯配位點(diǎn)的堿基由A 顛換為T時，反而會降低淬滅效率。

2.3 互補(bǔ)序列的5′端延長對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響

研究提出，互補(bǔ)序列的5′端延長會對自淬滅探針熒光強(qiáng)度產(chǎn)生不同影響[16]。因此，分別以3 種方式對互補(bǔ)序列的5′端延長，探究不同類型互補(bǔ)序列對自淬滅探針的淬滅能力，結(jié)果見圖3。

圖3 互補(bǔ)序列的5′端延長對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of lengthened 5′end of the complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

如圖3 所示，首先在互補(bǔ)序列的5′端分別增加1 個和2 個A、T、C 堿基。延長后的互補(bǔ)序列結(jié)合自淬滅探針后熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出顯著下降（P＜0.05），互補(bǔ)序列延長2 個堿基比延長一個堿基后結(jié)合自淬滅探針呈現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。說明非互補(bǔ)區(qū)域增加的堿基會提高DNA 鏈的整體電阻，阻礙電子在DNA 雙鏈間的傳輸，使得互補(bǔ)序列對自淬滅探針的淬滅效果減弱[16]。

第2 種延長方式是在互補(bǔ)序列的5′端增加GTAG和GG 堿基[圖3（B）]。第3 種延長是從與自淬滅探針互補(bǔ)19 個堿基的互補(bǔ)序列BIP-HP13 開始，在其5′端添加GTAG 和GG 堿基[圖3（C）]。兩種延長方式得到的互補(bǔ)序列在結(jié)合自淬滅探針時不僅熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），而且淬滅后的熒光強(qiáng)度與完全互補(bǔ)序列淬滅的熒光強(qiáng)度相近，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。毛慧慧[16]提出熒光基團(tuán)的電子不僅可以沿著DNA 鏈傳輸，而且可以與互補(bǔ)序列中非互補(bǔ)區(qū)域的堿基進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移。G 最容易失電子，對熒光基團(tuán)淬滅作用最大，更易產(chǎn)生顯著降低的熒光強(qiáng)度。因此，推測在互補(bǔ)序列的5′端增加G 堿基，仍可保持對自淬滅探針熒光的淬滅。

2.4 互補(bǔ)序列的5′端縮短對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響

為確定能夠?qū)ψ源銣缣结槦晒猱a(chǎn)生淬滅的最短互補(bǔ)序列，從互補(bǔ)序列5′端開始進(jìn)行縮短，優(yōu)化互補(bǔ)序列的設(shè)計?；パa(bǔ)序列的5′端縮短對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響見圖4。

圖4 互補(bǔ)序列的5′端縮短對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of shortened 5′end of the complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

對互補(bǔ)序列的長短進(jìn)行優(yōu)化，從互補(bǔ)序列5′端開始逐個減少堿基，篩選合適的互補(bǔ)序列進(jìn)行對自淬滅探針的淬滅。如2.1 所述，在添加與自淬滅探針完全互補(bǔ)的序列BIP-HP1 時，自淬滅探針的背景熒光顯著降低（P＜0.05）。

當(dāng)添加互補(bǔ)序列BIP-HP2 至BIP-HP6 時，僅BIPHP2 與自淬滅探針結(jié)合，自淬滅探針背景熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著降低（P＜0.05），BIP-HP3、BIP-HP4 和BIP-HP5添加入自淬滅探針后，熒光強(qiáng)度無明顯差異，與自淬滅探針自身熒光強(qiáng)度相近。但BIP-HP6 退火結(jié)合自淬滅探針后，熒光強(qiáng)度反而出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。由于退火后形成的雙鏈末端不存在GC 堿基對，故此部分熒光強(qiáng)度發(fā)生變化可能是由PET 和雙鏈淬滅雙重因素引起的。

最后，BIP-HP7、BIP-HP8 和BIP-HP9 加入自淬滅探針后，熒光強(qiáng)度與自淬滅探針熒光強(qiáng)度差異不顯著（P＞0.05）。研究表明，PET 需要經(jīng)過范德瓦爾斯接觸才可發(fā)生，BIP-FAM 中熒光基團(tuán)修飾位點(diǎn)位于序列3′端第3 位，BIP-HP7 與熒光基團(tuán)修飾位點(diǎn)相距3 個堿基長度[24]。因此，BIP-HP7 及更短的互補(bǔ)序列與自淬滅探針結(jié)合后不影響PET 的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度不會表現(xiàn)出顯著差異。

2.5 互補(bǔ)序列的3′端縮短對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響

確定對自淬滅探針熒光產(chǎn)生顯著淬滅的最短互補(bǔ)序列，從3′端縮短互補(bǔ)序列，再對其與自淬滅探針結(jié)合的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5。

圖5 互補(bǔ)序列的3′端縮短對探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of shortened 3′end of the complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

從互補(bǔ)序列BIP-HP13 開始，按照梯度依次從3′端進(jìn)行縮短，得到互補(bǔ)序列BIP-HP16、BIP-HP17 和BIP-HP18。當(dāng)加入此類互補(bǔ)序列時，自淬滅探針的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），且各個組合之間的熒光強(qiáng)度與完全互補(bǔ)序列結(jié)合自淬滅探針時的熒光強(qiáng)度相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明對BIP-FAM 而言，與3′端互補(bǔ)10 個堿基的序列也可以對自淬滅探針熒光強(qiáng)度產(chǎn)生顯著淬滅。

對自淬滅探針R-FIP-FAM、ZJ-FAM 和S-LB-FAM分別設(shè)計與3′端互補(bǔ)10 個堿基的互補(bǔ)序列。由圖5（B）所示，自淬滅探針分別退火結(jié)合各自互補(bǔ)10 個堿基的互補(bǔ)序列后，熒光強(qiáng)度均表現(xiàn)出顯著下降（P＜0.05），且熒光強(qiáng)度與各自完全互補(bǔ)序列退火結(jié)合后的熒光強(qiáng)度相近，表現(xiàn)出程度相仿的淬滅效果。因此推斷，對于所有自淬滅探針，3′端互補(bǔ)序列可實(shí)現(xiàn)對自淬滅探針的顯著淬滅。

2.6 互補(bǔ)序列解鏈溫度和環(huán)境溫度對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響

解鏈溫度是指雙鏈DNA 分子在變性過程中，50%的堿基對變?yōu)閱捂湑r的溫度[25]。因此，溶解溫度（melting temperature，Tm）值和環(huán)境溫度的關(guān)系，會直接影響互補(bǔ)序列與自淬滅探針的退火結(jié)合，能否形成穩(wěn)定的DNA 雙鏈，是自淬滅探針淬滅的重要影響因素?；パa(bǔ)序列Tm 值和環(huán)境溫度自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響見圖6。

圖6 互補(bǔ)序列Tm 值和環(huán)境溫度對自淬滅探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of melting temperature and ambient temperature of complementary sequence on the fluorescence intensity of selfquenching fluorogenic probe

如圖6（A）所示，在自淬滅探針R-LB-FAM 中，結(jié)合與其互補(bǔ)10 個堿基的互補(bǔ)序列R-LB-FAM-HP2（Tm 值28.88 ℃）后，熒光強(qiáng)度未出現(xiàn)顯著下降。延長R-LB-FAM-HP2 的3′端堿基，得到11 個堿基長度的RLB-FAM-HP3（Tm 值34.55 ℃）和12 個堿基R-LB-FAMHP4（Tm 值41.79 ℃）。自淬滅探針加入延長后的互補(bǔ)序列時，熒光強(qiáng)度與完全互補(bǔ)序列結(jié)合自淬滅探針時接近，相比自淬滅探針熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)出顯著降低（P＜0.05）。表明通過增加堿基得到Tm 較高的互補(bǔ)序列，可以提高結(jié)合自淬滅探針后的雙鏈穩(wěn)定性，電子會沿著穩(wěn)定的DNA 雙鏈進(jìn)行傳輸，產(chǎn)生更強(qiáng)的淬滅。

如圖6（C）所示，由R-LB-FAM 和R-LB-FAM-HP2配制的體系在4 種溫度下表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度。-4 ℃處理30 min 后的體系具有最低的熒光強(qiáng)度，而室溫放置30 min 的體系熒光強(qiáng)度出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），35 ℃和45 ℃處理的體系相比前兩者，熒光強(qiáng)度均表現(xiàn)出顯著上升（P＜0.05）。說明環(huán)境溫度高于Tm 值時，雙鏈DNA 分子中部分雙鏈變成單鏈，淬滅效果明顯減弱，熒光強(qiáng)度隨之升高。而35 ℃和45℃處理后的體系熒光強(qiáng)度差異不顯著（P＞0.05），則表明在大于Tm 值的溫度下，R-LB-FAM-HP2 無法與R-LB-FAM 退火結(jié)合，無法形成雙鏈DNA，不能對自淬滅探針起到淬滅作用。

因此，當(dāng)短的互補(bǔ)序列對自淬滅探針無法產(chǎn)生顯著淬滅時，通過延長互補(bǔ)序列提高Tm 值或通過降低環(huán)境溫度可以重新恢復(fù)超淬滅。對于互補(bǔ)序列淬滅自淬滅探針時，互補(bǔ)序列Tm 值應(yīng)高于環(huán)境溫度，可以形成穩(wěn)定的DNA 雙鏈，保證自淬滅探針的顯著淬滅。

2.7 LAMP 可視化體系驗證

以虹鱒魚（Oncorhynchusmykiss）為例，建立LAMP體系進(jìn)行可視化驗證，結(jié)果見圖7。

圖7 LAMP 體系驗證結(jié)果Fig.7 Result of LAMP system

如圖7（A）和圖7（C）所示，反應(yīng)前LAMP 體系陽性驗證和空白對照表現(xiàn)為統(tǒng)一的熒光強(qiáng)度，不添加互補(bǔ)序列的LAMP 體系均為明亮的熒光，而添加互補(bǔ)序列的體系表現(xiàn)為微弱的熒光，說明互補(bǔ)序列在LAMP 體系依然能夠穩(wěn)定地降低自淬滅探針背景熒光。然而當(dāng)反應(yīng)結(jié)束，不添加互補(bǔ)序列的體系陽性和陰性仍保持著難以分辨的熒光[圖7（B）]，添加互補(bǔ)序列的體系的可視化則出現(xiàn)了易于區(qū)分的差異，陽性呈現(xiàn)明亮的熒光，空白對照則表現(xiàn)出與反應(yīng)前一致的低熒光[圖7（D）]。由此說明，互補(bǔ)序列不僅能夠在反應(yīng)前對LAMP 體系中的自淬滅探針產(chǎn)生淬滅，而且在反應(yīng)結(jié)束恢復(fù)至室溫時能夠恢復(fù)對自淬滅探針的淬滅。同時，該互補(bǔ)序列在體系中未對陽性產(chǎn)生明顯抑制，陽性驗證在反應(yīng)后得到了與不添加互補(bǔ)序列體系一致的明亮熒光。

3 結(jié)論

本研究以自淬滅探針為研究對象，篩選具有降低自淬滅探針背景熒光的互補(bǔ)序列，并將其應(yīng)用于LAMP 中，實(shí)現(xiàn)基于自淬滅探針的LAMP 可視化檢測。結(jié)果表明，3′端縮短的互補(bǔ)序列Tm 值大于室溫的情況下，可以使自淬滅探針熒光發(fā)生顯著降低（P＜0.05）。并且該互補(bǔ)序列加入到LAMP 體系中，可在不影響擴(kuò)增反應(yīng)的前提下降低體系的背景熒光。本研究所建立的基于自淬滅探針的LAMP 快速可視化檢測方法，能在反應(yīng)結(jié)束后直接通過肉眼觀察得到結(jié)果，簡化了LAMP 的檢測流程，對實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。