李漢芳，黃珍，路夢凡，孫娜娜，徐丹，徐秦峰

（陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）是一種具有抗菌、抗病毒、增加成骨活性、降低腹瀉發(fā)病率、促進(jìn)腸道健康等多種生理活性的鐵結(jié)合糖蛋白[1-3]，例如最近研究發(fā)現(xiàn)，Lf 能夠輔助治療新冠肺炎[4]。同時，Lf 對熱敏感，加工工藝不同導(dǎo)致不同產(chǎn)品中的Lf 含量差異很大，因此檢測各種乳制品中Lf的含量對其營養(yǎng)價值和熱加工風(fēng)險評估具有重要意義[5,6]。

作為乳蛋白分離檢測的常用方法，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDSPAGE）[7-11]能夠?qū)f 與其它乳蛋白很好的分離開，無需用肝素親和柱純化樣品，因此廣泛用于乳及乳制品中Lf 含量的檢測。考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue，CBB）是最常用的染色方法，但是存在染色脫色步驟繁瑣、靈敏度較差的不足，如Brisson 等[12]通過還原及非還原SDS-PAGE 兩種方法表征了不同鐵飽和度對乳鐵蛋白熱聚集的影響，凝膠需要過夜固定蛋白、37 ℃染色1 h 以及多次更換乙酸脫色，李珊珊等[13]通過SDS-PAGE 法實現(xiàn)乳制品中Lf 的定量檢測，凝膠需過夜染色、脫色2 h；邢志恩等[14]通過CBB 染色和薄層掃描測定了3 種不同來源的Lf，克服了溶劑大量損耗的缺點；但染色3 h、脫色2 h 的過程仍然煩瑣耗時。

為了克服這種局限，本文采用了一種新型染色試劑Chromeo P503（P503）來替代CBB 染色，研究建立一種乳及乳制品中Lf 含量的SDS-PAGE 簡便快速檢測方法。由于P503 標(biāo)記蛋白呈現(xiàn)強烈的紅色熒光發(fā)射，量子產(chǎn)率高（＞50%）；而游離染料量子產(chǎn)率較低（＜1%）[15]，因此無需進(jìn)行洗脫以降低背景。在優(yōu)化實驗條件下，該方法中蛋白染色僅需一步操作，便可直接應(yīng)用于乳及乳制品中Lf 的準(zhǔn)確定量檢測，檢測速度和靈敏度（30 min，5.11 μg/mL）均顯著優(yōu)于CBB 染色（＞5 h，29 μg/mL）[13,14]，可為含乳鐵蛋白制品的營養(yǎng)價值評價、質(zhì)量監(jiān)管和加工工藝研究提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

天然Lf（純度≥95%），日本W(wǎng)ako 公司；鐵飽和Lf（純度≥85%）、β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-LG，純度≥90%）、酪蛋白（Casein，CN）、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，純度≥98%）、碳酸氫鈉（純度≥99.5%）、檸檬酸（純度≥99.5%）、磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末、Chromeo P503，美國Sigma 公司；免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG，純度≥90%），上海源葉生物科技有限公司；QC0140 肝素親和柱，北京美正生物科技有限公司；Athena C4 色譜（250 mm×4.6 mm×5 μm，300?），上海安譜實驗科技有限公司；12%電泳預(yù)制膠、考馬斯亮藍(lán)R-250、蛋白Marker，上海生工生物工程公司；乙二胺四乙酸二鈉鹽（分析純），上海生工生物工程公司；液態(tài)奶、奶粉樣品購買自當(dāng)?shù)爻小?/p>

Mini-PROTEIN Tetra System 垂直電泳儀，美國Bio-Rad 公司；OS-03U 搖床，北京六一生物科技有限公司；FS5 熒光光譜儀，英國Edingburgh 公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；OSE-470P 藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)，北京天根生化科技有限公司；Nanodrop One 超微量紫外分光光度計、U3000 液相色譜儀（配備紫外檢測器），美國Thermo Fisher Scientific 公司；BS/BT 型電子天平（精度0.000 1 g），德國Sartorius 公司；5424R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 條件優(yōu)化

1.2.1.1 鐵飽和度對P503 標(biāo)記Lf 的影響

參照文獻(xiàn)[16]制備脫鐵Lf，在100.0 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的Lf 中，加入乙二胺四乙酸二鈉鹽（0.5 mol/L）10.0 μL、檸檬酸（1 mol/L）2.0 μL，孵育1 h 后進(jìn)行5 次超濾（30 ku）以除去螯合劑。Lf 的標(biāo)記反應(yīng)如下：1.0 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL的脫鐵Lf、天然Lf、鐵飽和Lf，加入1.0 μL 的P503（0.2 mg/mL）、2.0 μL 碳酸氫鈉緩沖液（pH值9）和6.0 μL 超純水混勻；1.0 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的脫鐵Lf、天然Lf、鐵飽和Lf 及P503（0.2 mg/mL），加入2.0 μL 碳酸氫鈉緩沖液（pH 值9）和7.0 μL 超純水混勻作為對照，50 ℃孵育30 min后進(jìn)行光譜掃描。

熒光光譜掃描條件：激發(fā)光譜，固定最大發(fā)射波長為620 nm，激發(fā)波長范圍400～580 nm，狹縫為1.5 nm；發(fā)射光譜，固定最大激發(fā)波長為500 nm，激發(fā)波長范圍520～750 nm。取2.0 μL 的不同鐵飽和度Lf 及P503-Lf 標(biāo)記樣品，在Nanodrop 儀器上進(jìn)行紫外可見全光譜掃描。

1.2.1.2 P503 標(biāo)記條件優(yōu)化

在標(biāo)記比例優(yōu)化實驗中，固定Lf 質(zhì)量濃度終濃度為1 mg/mL，改變P503 用量使P503 染料與Lf 的摩爾比分別為1:1、2:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1，孵育條件、熒光發(fā)射光譜掃描條件同1.2.1，掃描頻率：每分鐘一次。孵育溫度實驗中，Lf（10 mg/mL）取1.0 μL，加入1.0 μL 的P503（0.2 mg/mL）、2.0 μL碳酸氫鈉緩沖液（pH 值9），加入超純水至10.0 μL混勻，溫度設(shè)置40、50、60、70℃，掃描頻率同上。

1.2.2 P503染色檢測線性范圍及其與CBB染色對比

1.2.2.1 P503 染色檢測線性范圍

PBS（1×）稀釋脫鐵Lf 至1 mg/mL 后分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，加入1.0 μL 的P503（0.2 mg/mL）、2.0 μL 碳酸氫鈉緩沖液（pH 值9），加入超純水至10.0 μL 混勻；50 ℃孵育30 min 后加 入2.5 μL 的Loading buffer，（95.0±0.5）℃孵育5 min，室溫冷卻；分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%；恒壓電泳，濃縮電壓90 V，時間30 min，分離電壓120 V，時間60 min；為防止熒光光漂白，電泳過程應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，通過藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)觀察實驗結(jié)果。

1.2.2.2 P503 染色檢測的精密度及穩(wěn)定性

終質(zhì)量濃度均為0.01 mg/mL 的Lf 樣品（標(biāo)記方法同上）在同一凝膠上做9 個平行樣進(jìn)行電泳，讀取灰度值及計算后相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。重復(fù)1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線3 次并對不同凝膠上同一乳品樣品采用相同方法計算RSD。

1.2.2.3 CBB 染色檢測線性范圍

樣品除P503 染色外均與1.2.2.1 相同，電泳結(jié)束后進(jìn)行CBB 染色。在半徑12 cm 的培養(yǎng)皿里加入1×考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液60 mL，搖床50 r/min，染色1 h，0.0、0.5、1.5、3.0 h 時各加入80 mL 脫色液（φ=40%無水乙醇、φ=10%冰乙酸、φ=50%水），過夜脫色。使用數(shù)據(jù)處理軟件WCIF Image J 采集條帶灰度值。

1.2.3 實際乳品樣品檢測

10 mg/mL 的β-LG、CN、BSA、IgG、脫鐵Lf 樣品分別取0.5 μL 加入1.0 μL 的P503（0.2 mg/mL）、2.0 μL 碳酸氫鈉緩沖液（pH 值9）和6.0 μL 超純水混勻；5 種蛋白各取0.5 μL 混合加入1.0 μL 的P503（0.2 mg/mL）、2.0 μL 碳酸氫鈉緩沖液（pH 值9）和4.5 μL 超純水混勻，進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，檢測條件同1.2.2。

奶粉樣品：稱取牛乳粉0.100 0 g，PBS（1×）定容至2 mL。牛乳粉12 000 r/min、4 ℃、10 min離心除脂，收集中間層，重復(fù)兩次。

液態(tài)乳樣品：超瞬時殺菌（Infusion Technology，INF）乳、超高溫瞬時滅菌（Ultra High Temperature Treated，UHT）乳12 000 r/min、4 ℃、10 min 離心除脂，收集中間層，重復(fù)兩次。隨后的脫鐵和P503 溶液標(biāo)記反應(yīng)步驟同上，P503 濃度調(diào)整為0.5 mg/mL，SDS-PAGE 檢測條件同1.2.2.1。

用于高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測實驗的乳品樣品，參照肝素親和柱產(chǎn)品使用說明書的步驟進(jìn)行前處理和HPLC 上機檢測。HPLC 檢測參數(shù)：柱溫30 ℃，進(jìn)樣量30 μL，洗脫時間18 min，洗脫程序參照美正親和柱說明書2020 版本，檢測波長280 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

高效液相定量數(shù)據(jù)峰面積由Chromeleon 7 軟件獲得，SDS-PAGE 條帶灰度值由WCIF Image J 采集；實驗數(shù)據(jù)為n次重復(fù)實驗的均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Origin 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 鐵飽和度對P503標(biāo)記Lf的影響

P503 是一種伯胺標(biāo)記染料，對Lf 進(jìn)行標(biāo)記后，顯示強烈的紅色熒光發(fā)射信號，如圖1a 所示，與文獻(xiàn)報道一致[15]。對于相同濃度的不同鐵飽和度Lf，雖然均可觀察到熒光增強，但是強度的增加卻存在顯著差異。缺鐵Lf（Apo-Lf）、天然Lf（Native-Lf）和鐵飽和Lf（Holo-Lf）的鐵飽和度[16,17]分別為0.2%、14%、99.7%，其標(biāo)記后對應(yīng)的熒光強度逐漸降低，表明鐵飽和度會對P503 標(biāo)記Lf 造成影響。

圖1 P503 標(biāo)記不同鐵飽和度Lf 的光譜圖Fig.1 Spectra of P503 labeled Lf with different iron saturation (n=5)

為了探究造成熒光猝滅的原因，掃描了鐵飽和Lf 的吸收光譜（圖1b），結(jié)果顯示其在465 nm 處有最大吸收峰，對應(yīng)Lf 中鐵元素的特征吸收[17-19]。該吸收峰與P503 標(biāo)記Lf 的熒光激發(fā)光譜重疊（圖1b），所以鐵飽和Lf 會吸收P503 的激發(fā)光能量，從而導(dǎo)致熒光發(fā)射信號變?nèi)酰磧?nèi)濾效應(yīng)）。因此，在后續(xù)檢測中，均采用脫鐵Lf 進(jìn)行檢測。

2.1.2 P503標(biāo)記條件優(yōu)化

進(jìn)一步對P503 標(biāo)記Lf 的條件進(jìn)行了優(yōu)化，實驗了P503 染料與Lf 標(biāo)記比例（Dye/Protein Ratios，DPRs）、孵育時間及溫度對熒光信號強度的影響，結(jié)果如圖2 所示。熒光信號強度隨著溫度變化而不同，50 ℃孵育時信號強度最高，因此選擇50 ℃作為孵育溫度進(jìn)行后續(xù)實驗；隨著染料標(biāo)記比例增加，熒光強度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，導(dǎo)致熒光強度降低的原因可能是染料的自猝滅；當(dāng)染料蛋白比例為4 時，信號較為穩(wěn)定，偏差較小。熒光強度在5 min內(nèi)迅速增加隨后的50 min 內(nèi)緩慢增加，因此選擇30 min 作為孵育時間進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 染料標(biāo)記Lf 條件優(yōu)化Fig.2 P503 label Lf condition optimization (n=6)

2.2 P503染色檢測線性范圍及其與CBB染色對比

SDS-PAGE 是基于蛋白質(zhì)分子量差異和凝膠的分子篩作用進(jìn)行分離，通過電泳作用后染色劑顯示的蛋白條帶強弱不同進(jìn)行定量分析。相較于傳統(tǒng)的CBB 染色、洗脫過程，本方法所用的P503 染料在pH 值8～9 環(huán)境中標(biāo)記僅需30 min，在電泳后即可通過藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)和WCIF Image J 讀取灰度值對蛋白進(jìn)行定量，可以避免長達(dá)數(shù)小時的染色脫色過程。

為了驗證所建立的SDS-PAGE 法可以用于Lf的定量檢測，將不同質(zhì)量濃度的Lf 標(biāo)準(zhǔn)品分別和P503 進(jìn)行混合孵育，結(jié)合緩沖液做空白對照，采集各復(fù)合物灰度值。熒光成像后再按照傳統(tǒng)的步驟進(jìn)行CBB 染色成像，作為對照。結(jié)果如圖3 所示：隨Lf 質(zhì)量的增加，復(fù)合物條帶的熒光強度和藍(lán)色亮度均不斷增大。采集各泳道復(fù)合物灰度值，以Lf 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，Lf-P503 熒光強度值為縱坐標(biāo)的曲線回歸方程為y=1 111.428 57x-6.571 43，R2=0.966 92；CBB 染色的線性回歸方程為y=134.285 71x+27.952 38，R2=0.933 39。結(jié)果表明采用P503 染色（5.11 μg/mL）的檢測靈敏度和線性均優(yōu)于CBB 染色（29 μg/mL）[13]，并且P503 染色的時間僅為30 min，一步即可完成，操作步驟更為簡便快速（CBB 染色≥5 h）。此外，同一凝膠上同一樣品信號RSD 為2.26%，不同凝膠上同一樣品信號RSD 均小于4.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤10%，表明本方法測定乳及乳制品中乳鐵蛋白具有較好的精密度和穩(wěn)定性。

圖3 不同濃度Lf 的電泳圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Electrophoretic diagram and standard curve of lactoferrin at different concentrations (n=3)

2.3 實際乳品樣品檢測

為了確定Lf 檢測的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步對常見乳蛋白：β-LG、CN、BSA、IgG、Lf 標(biāo)準(zhǔn)品單獨樣品、混合樣品進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果如圖4a 所示，各蛋白與Lf 分子量差異顯著，不會干擾Lf 檢測。進(jìn)一步驗證P503 染色法可用于檢測實際樣品中Lf 含量，采用上述方法對市售的3 種乳制品（INF 乳、UHT 乳、牛乳粉）簡單離心除脂及脫鐵后，直接進(jìn)行Lf 定量檢測；添加Lf 標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定加標(biāo)回收率。結(jié)果如圖4b 及4c 所示，相對于CBB 染色，乳品樣品中P503 染色Lf 條帶（78 ku）更加清晰。定量檢測結(jié)果顯示，INF 乳的Lf 檢測值高于UHT 乳（表1），與預(yù)期相符同[20-22]。不同熱加工工藝導(dǎo)致Lf 的熱損失不同，證明本方法對于液態(tài)乳的熱加工風(fēng)險評估具有一定的參考意義。樣品的加標(biāo)回收率75.79%～108.09%（表1），表明本方法無需繁瑣前處理和復(fù)雜染色脫色過程即可實現(xiàn)乳制品中Lf 的定量檢測。

表1 P503-PAGE實際樣品檢測結(jié)果Table 1 P503-PAGE actual sample test results (n=3)

圖4 實際樣品檢測電泳圖Fig.4 Electrophoretic diagram of actual sample detection

將本方法與經(jīng)過肝素親和柱純化處理的HPLC檢測結(jié)果進(jìn)行對比，進(jìn)一步驗證方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表2。P503-PAGE 與HPLC 檢測值相近，表明本方法的準(zhǔn)確性。本方法可為企業(yè)優(yōu)質(zhì)乳的生產(chǎn)過程監(jiān)管以及奶粉的營養(yǎng)價值評估提供一定的技術(shù)支持。

表2 不同檢測方法對比Table 2 Comparison of different detection methods (n=3)

3 結(jié)論

本研究通過pH 值8～9 環(huán)境中P503 快速標(biāo)記Lf（0.5 h），在SDS-PAGE 后直接在藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)下讀取灰度值，通過熒光強度值和Lf 濃度呈現(xiàn)的良好線性關(guān)系進(jìn)行定量分析，避免了CBB 染色方法冗長的染色脫色過程（≥5 h），建立了一種省時、簡便、靈敏度高的Lf 快速檢測方法。鑒于SDS-PAGE 儀器是各實驗室最為普通和常用的設(shè)備，以及所使用的藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)成本較低，因此建立的方法具有廣泛適用性。此外，P503 染色還可以用于其它乳蛋白的快速檢測，從而能夠為液態(tài)乳的熱加工工藝的控制以及奶粉的營養(yǎng)價值評估提供技術(shù)支撐。