鄭連濤,張曉霞,劉佩鈺,王志進(jìn),孫睿,牛曉琳,黃帥,王曉玥

(德州學(xué)院 醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院,山東 德州 253023)

1 納米金層析試紙條的發(fā)展歷程及其現(xiàn)狀

為保障人民合法權(quán)益和生命健康,食品安全、臨床診斷等各領(lǐng)域的檢測必不可少[1-2],務(wù)必發(fā)展檢測手段以起到預(yù)防和監(jiān)管控制效果。20世紀(jì)80年代初,在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上,納米金層析試紙條檢測方法被建立。Faulk等[3]最先應(yīng)用此技術(shù)檢測了大腸埃希菌Escherichia coli,1980年Unipath公司開始市售檢測人絨毛膜促性腺激素(HCG)的試紙條,該試紙條通過將納米金顆粒作為信號探針,用來檢測女性是否妊娠[4]。納米金試紙條技術(shù)的名稱來源于其使用粒徑在1～100 nm之間的金顆粒,與相應(yīng)的特異性探針相結(jié)合后,被檢測物與樣品墊上的納米金顆粒偶聯(lián),利用層析作用到達(dá)檢測線,通過顯色反應(yīng)來檢測目的物質(zhì)是否存在[5]。根據(jù)檢測物的不同,納米金試紙條涵蓋了核酸水平的分子生物學(xué)檢測、蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測、化合物水平的理化檢測等多種層次。該技術(shù)具有特異性強(qiáng),靈敏度高,穩(wěn)定性好,檢測速度快,成本低,可視化,操作簡單,污染少等一系列優(yōu)點,因此在環(huán)境污染檢測,食品安全檢測,臨床診斷檢測,微生物檢測等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

2 納米金層析試紙條應(yīng)用于微生物快速檢測

2.1 納米金層析試紙條與病毒檢測

病毒無細(xì)胞結(jié)構(gòu),依靠寄生在生物體內(nèi)生存,進(jìn)而侵染宿主的生命系統(tǒng),且?guī)в幸欢ǖ膫魅拘?。為實現(xiàn)對病毒病的預(yù)防和監(jiān)管,需要對病毒進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。病毒檢測現(xiàn)階段主要依賴于PCR擴(kuò)增技術(shù)[6],需要使用凝膠電泳檢測結(jié)果,存在著檢測時間長、操作復(fù)雜、檢測結(jié)果無法直觀可視等問題[7-8]。王之瑩等[9]將納米金試紙條用于PCR結(jié)果的檢測,建立了側(cè)流核酸測定試紙條(lateral flownucleic acid assay,LFNAA)檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)的可視化檢測方法。受PCR 技術(shù)的限制,仍無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測,因此有多項研究在檢測技術(shù)上進(jìn)行突破。如趙錦等[10]將等溫鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(Strand Displacement Amplification,SDA)與納米金測流層析試紙條相結(jié)合,進(jìn)而應(yīng)用于登革熱病毒(DENV)的檢測。該方法使用等溫擴(kuò)增技術(shù)代替PCR擴(kuò)增,可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。

在病毒檢測實驗過程中,由于環(huán)境及生物體本身等影響,實驗結(jié)果會不可避免地出現(xiàn)誤差。因此在實驗中,需要增加多種檢測條件,使誤差對實驗結(jié)果的影響降到最低。宋廣萍[11]以雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization Chain Reaction,HCR)為基礎(chǔ),以分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)探針(MBs)和雙聯(lián)特異性核酸酶為輔助,避免了多種干擾,同時實現(xiàn)了三種流感病毒H1N1的可視化檢測。實時熒光定量PCR方法在新冠病毒檢測等多種病毒檢測中應(yīng)用廣泛,是檢測的金標(biāo)準(zhǔn),陳崢嶸[12]利用等位基因特異性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)核酸試紙條區(qū)分犬瘟熱病毒(CDV)野毒株和疫苗株,通過雙抗夾心法進(jìn)行臨床驗證,發(fā)現(xiàn)該方法與實時熒光定量PCR相比較,更為簡單快速。新冠肺炎確診過程中,咽拭子的分子檢測是用于確認(rèn)新冠病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn),但該技術(shù)的檢測結(jié)果假陰性率較高。Wen等[13]提出將新冠病毒核衣殼蛋白固定到一種固相LFIA條帶(LFIAs)表面,并將抗人lgG與膠體金顆粒偶聯(lián)。通過比較兩種結(jié)果,該測定結(jié)果更準(zhǔn)確且更快速。對分子測定的不完善診斷策略進(jìn)行補(bǔ)充,可應(yīng)用于新冠肺炎患者的大量分子篩查中。

2.2 納米金層析試紙條與細(xì)菌檢測

現(xiàn)階段,致病菌的檢測主要依賴于細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、涂片檢測等,在進(jìn)行核酸檢測時,往往需要PCR技術(shù)結(jié)合后續(xù)檢測手段,存在著檢測時間長,操作復(fù)雜以及對操作人員和儀器要求高等問題,納米金核酸試紙條改善了以上缺點。如陳詩勝[14]制備了PCR核酸免疫層析試紙條檢測奶牛乳房炎四種致病菌,通過肉眼直接觀察核酸擴(kuò)增后的條帶結(jié)果,解決了PCR擴(kuò)增后檢測產(chǎn)物的復(fù)雜化問題,檢測靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通瓊脂糖凝膠電泳檢測的靈敏度,且特異性高,可適用范圍更廣。在前期核酸擴(kuò)增方面,張力支等[15]利用核酸外切酶Ⅲ循環(huán)酶切策略實現(xiàn)了單鏈信號放大,同時結(jié)合納米金試紙條完成檢測,李盛杰等[16]利用多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)(Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification,MIRA)結(jié)合納米金試紙條對霍亂弧菌進(jìn)行快速鑒定。以上方法相較于細(xì)菌培養(yǎng)、PCR、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增等方法,操作流程更為簡便,對環(huán)境要求更低。納米金還可與其他物質(zhì)相結(jié)合,以便于核酸試紙條的檢驗。如賈慧建等[17]經(jīng)實驗建立了一種新型核酸試紙條,此試紙條將鏈霉親和素與納米金結(jié)合,用來檢測蠟樣芽胞桿菌entFM毒素基因,對于患者的檢測更為快速、準(zhǔn)確。與核酸檢測相比較,免疫試紙條檢測靈敏度較低。為提高靈敏度,Jia等[18]利用納米顆粒的光熱效應(yīng)實現(xiàn)信號的放大技術(shù),建立了一種用于大腸桿菌檢測的光熱免疫過濾試紙條,將靈敏度提高了十倍。并且該方法可通過替換抗體,擴(kuò)展到其他病原體的檢測,具有普適性。

3 納米金層析試紙條應(yīng)用于疾病快速檢測

近年來,隨著全球飲食結(jié)構(gòu)的變化和重金屬污染事件的發(fā)生日益增多,世界各地都受到了嚴(yán)重影響,同時威脅著人類的生活和健康。因此開展疾病的預(yù)防檢測工作顯得至關(guān)重要。為進(jìn)一步提高疾病檢測結(jié)果的靈敏度和工作效率,節(jié)省檢測時間,葉鈺瀅[19]通過結(jié)合重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Aided Amplification,RAA)擴(kuò)增技術(shù)和核酸試紙條,在30 min內(nèi)檢測出日本血吸蟲基因片段。王海波[20]在納米金試紙條生物傳感器的基礎(chǔ)上,提出可視化檢測Pd2+、肝癌單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點和慢性乙肝病毒(HBN-DNA)的方法,并且分別利用孔板放大和HCR放大策略等提高了檢測靈敏度。阿爾茲海默癥(Alzheimer disease,AD)是威脅老年群體的重要疾病之一,Liu等[21]發(fā)現(xiàn)AD病人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)水平顯著降低,因此提供了一種羅丹明B修飾的納米金顆粒雙讀數(shù)(比色法和熒光法)的方法,檢測了AD小鼠腦脊液中AChE的含量,結(jié)果表明該方法較現(xiàn)有方法選擇性更好,且對于微量物質(zhì)的檢測更為靈敏。

4 納米金試紙條在食品安全檢測方面的應(yīng)用

食品安全要求無毒,無公害且符合應(yīng)當(dāng)有的營養(yǎng)物質(zhì)含量,不會對食用者產(chǎn)生致病的危害,但某些食品添加物會損害人體健康。比如,為防止食品腐敗變質(zhì),加工時會人為地在動物性食品中添加抗生素。常芮[22]在側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(LFS)應(yīng)用于檢測食品中抗生素的基礎(chǔ)上,將鳥嘌呤-胞嘧啶DNA鏈修飾到納米金顆粒上,構(gòu)建了新型納米模擬酶的信號放大LFS,進(jìn)一步提高了納米金試紙條在檢測抗生素含量的靈敏度。食品中微生物的生長也會影響食品質(zhì)量,預(yù)富集、選擇性富集、毒素檢測等微生物傳統(tǒng)方法存在檢測速度慢,鑒定結(jié)果不清晰等缺點[23-25]。張云紅等[26]以食品中金黃色葡萄球菌為靶標(biāo),構(gòu)建了一種巰基、生物素修飾的雙核酸適配體夾心模式的層析試紙條,完成了金黃色葡萄球菌的定性檢測。最后,農(nóng)藥殘留也是影響食品安全主要因素之一,Liu等[27]預(yù)先制備了抗啶蟲脒的單克隆抗體,利用樣品中的啶蟲脒與檢測線上偶聯(lián)的啶蟲脒競爭性結(jié)合檢測液中單克隆抗體的方法區(qū)分陽性與陰性結(jié)果,建立了啶蟲脒殘留檢測技術(shù),并成功用于市售黃瓜和蘋果農(nóng)藥殘留的檢測,理論檢測限約為1 ng/mL。

5 納米金試紙條在檢測真菌毒素方面的應(yīng)用

真菌毒素在谷物、水中等廣泛存在,易造成糧食以及水污染,從而對人類身體健康造成極大危害。在檢測領(lǐng)域,傳統(tǒng)的化學(xué)鑒定方法(如薄層色譜TLC)檢測復(fù)雜、準(zhǔn)確性低,無法滿足市場對于即時檢測的要求,納米金試紙條作為一種快速檢測技術(shù),在真菌毒素檢測方面逐漸應(yīng)用于市場。鄒鵬[28]制備了球狀和花狀納米金層析試紙條,并在多種雜質(zhì)存在的粗制樣品中可以快速地檢測出谷物及中藥材中三種毒素(玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和赭曲霉毒素A),相較于食品檢測中馬彤彤[29]將球狀改良成花狀納米金顆粒,球狀和花狀納米金都可定性檢測玉米赤霉烯酮,避免了假陽性的出現(xiàn),從而完成市場初步篩查。黃馨雨[30]研究的同類型納米金免疫層析試紙條也可在雜物中定性的檢測出伏馬毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。相比于鄒鵬檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,該方法靈敏度更高。張珊[31]采用納米金粒子與核酸適配體偶聯(lián)的方法制備出核酸適配體試紙條,來檢測黃曲霉素B1,相較于商品化檢測試劑盒,該方法成本更低、檢測范圍更廣,為檢測其他產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ),可以實現(xiàn)工業(yè)化實時檢測。Wu等[32]開發(fā)了紅曲發(fā)酵食品中桔青霉素的快速金納米顆粒免疫層析條方法,實驗表明這種方法靈敏度高、檢測快速,在檢測食品中的桔青霉素(CTN)具有很大幫助。

6 總結(jié)與展望

相比于傳統(tǒng)的核酸檢測方式,納米金層析試紙條技術(shù)是一種高靈敏度、高特異性、準(zhǔn)確、有效、快速可視化的檢測技術(shù),但其應(yīng)用與推廣仍然不廣泛。第一,傳統(tǒng)的納米金試紙條檢測需要抗體和抗原特異性結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生抗體-抗原-納米金顆粒復(fù)合物,而研制免疫層析試紙條的重要一步是制備特異性高、親和力強(qiáng)的單克隆抗體,需要經(jīng)過復(fù)雜的雜交瘤實驗和篩選過程,開發(fā)周期長且耗費大量的人力與物力,實驗成功率低,再者抗體偶聯(lián)金標(biāo)的過程較為復(fù)雜,以上都成為免疫試紙條研發(fā)的瓶頸。為了解決以上問題,首先可以嘗試基于適配體的核酸檢測方法,其次納米金核酸檢測試紙條可以根據(jù)檢測對象靈活設(shè)計核酸探針,可在生物公司訂購,避開了制備抗體的限制,為試紙條檢測的廣泛應(yīng)用提供了條件。

第二,目前大多數(shù)納米金層析試紙條檢測是基于實驗室環(huán)境進(jìn)行的研究,若要將此技術(shù)更廣泛、更便攜地應(yīng)用于物質(zhì)檢測,仍需將其應(yīng)用于臨床環(huán)境中。第三,現(xiàn)今所研究的試紙條是對于單一檢測對象的檢測,如符娜[33]農(nóng)田生產(chǎn)中,仍然無法同時檢測侵染植物的多種病毒,陳淑丹等[34]提出對同一檢測對象進(jìn)行多項檢測時,只能逐一浸染各種測試項目的試紙條的現(xiàn)象。由此在試紙條探索過程中,對于可同時檢測更多種類的檢測對象的多功能甚至萬能試紙條需要我們進(jìn)一步研究。第四,在定量檢測方面,目前大多數(shù)試紙條只能利用顯色方式來檢測是否含有檢測對象,如鄭方媛等[35]建立了核酸試紙條檢測與交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的快速檢測狐貍源性成分的方法時,只能鑒定狐貍源性成分是否存在,而對于在狐貍源性成分的定量檢測方面還需進(jìn)一步研究,故對于定量檢測目的對象上的探索仍然有很長的路要走。