麥爾哈巴·艾斯卡爾，朱玥潔，張曼麗，張于念，鞏曉蕓，王輝，丁劍冰，4

1 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心；3 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省免疫與靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

早發(fā)性卵巢功能不全（POI）是指女性在40 歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退的臨床綜合征，以月經(jīng)異常（停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng)）伴有促性腺激素水平升高（FSH＞25 U/L）和雌激素水平波動(dòng)性下降為特征［1］。POI 的發(fā)病率為1%～3.7%，且隨年齡增長(zhǎng)而升高［2］。POI發(fā)病原因仍未完全確定，4%～30%的POI與自身免疫因素相關(guān)。研究［3-4］表明，POI 患者CD4+T 細(xì)胞增加，B 細(xì)胞增多，CD4+/CD8+比值上升。濾泡輔助性T 細(xì)胞（Tfh）是CD4+T 細(xì)胞的特殊亞群，主要定位于淋巴結(jié)和濾泡內(nèi)。BCL-6、CXCR5 蛋白在Tfh 中呈高表達(dá)狀態(tài)，IL-6和IL-21在初始T細(xì)胞分化為Tfh 過程中起正向促進(jìn)作用，均為Tfh 功能相關(guān)細(xì)胞因子。Tfh 能調(diào)節(jié)B 細(xì)胞增殖、延長(zhǎng)B 細(xì)胞存活時(shí)間、漿細(xì)胞分化、體細(xì)胞高頻突變、抗體的重組和同型轉(zhuǎn)換、黏附以及輔助B 細(xì)胞招募其他分子［5］。目前，Tfh在感染、疫苗接種和腫瘤、自身免疫性疾病中的研究較多，但Tfh在卵巢疾病中的研究較少。本研究觀察POI患者外周血Tfh占比、Tfh發(fā)揮作用所涉及的因子水平變化，并分析其與性激素水平的相關(guān)性，探討Tfh 及相關(guān)因子在POI 發(fā)病中的應(yīng)用價(jià)值，為POI的預(yù)防、診斷和治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2022 年1 月—2023 年6 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的POI 患者29 例（觀察組），年齡（34 ± 4）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2016 年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)發(fā)布的《POI 處理指南》［2］及2017 年《POI 的臨床診療中國專家共識(shí)》［6］中POI 的管理指南擬定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②近3 個(gè)月內(nèi)未服用任何激素類和影響內(nèi)分泌激素的藥物者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有或合并其他內(nèi)分泌疾病者；②生殖器器質(zhì)性病變引起的卵巢功能減退者；③患有嚴(yán)重的心、肝、腦、腎及造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病及精神障礙者；④對(duì)針具、線體過敏，或皮膚表面有大面積潰瘍、濕疹等不能配合治療者；⑤孕婦、哺乳期婦女及未有過性生活者。另選同期健康體檢者31 例（對(duì)照組），年齡（32 ± 4）歲。兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究獲新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)：K202303-09），同時(shí)已獲得全部患者的知情同意。

1.2 全血Tfh 檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算外周血中Tfh 占比。取100 μL 的新鮮外周血，置于新的流式管中（在加完外周血于流式管中，要檢查流式管壁，并擦除管壁上殘留的外周血），分別加入CD3-APC-Cy7、CD4-FITC、CXCR5-PerCP-Cy5.5 等抗體，用渦旋振蕩器混勻，避光孵育20 min。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，移液器輕輕地反復(fù)混勻，并置于搖床上裂解20 min，后以1 500 r/min 速度離心5 min。棄上清，加2 mL 的PBS 緩沖液進(jìn)行輕輕地反復(fù)混勻，后以1 500 r/min速度離心5 min。棄上清，加入200 μL的PBS 緩沖液混勻重懸，等待上機(jī)。通過FlowJo 軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行圈門和分析，結(jié)果以Tfh占CD4+T細(xì)胞的占比來表示。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CXCR5和BCL-6檢測(cè) 外周血離心后沉淀物中加入與其等量的生理鹽水進(jìn)行混勻后，加入外周血淋巴細(xì)胞分離液溶液離心。離心結(jié)束取第二層云霧狀于液體并加入適量PBS 后混勻離心。加入2～4 mL 的紅細(xì)胞裂解液混勻，靜置20 min進(jìn)行裂解。離心棄去上清，加入裂解液混勻進(jìn)行裂解，后離心，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至新的EP 管中，-20 ℃保存。對(duì)蛋白進(jìn)行蛋白定量，蛋白變性。制膠，20 μL 蛋白上樣，電泳電轉(zhuǎn)，封閉2 h，TBST 漂洗、一抗孵育過夜（GAPDH、BCL-6、CXCR5），TBST漂洗、二抗1 h，TBST 漂洗、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。后通過Image J 對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值掃描，從而計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 血清IL-6和IL-21檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)血清中IL-6 和IL-21，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)下OD 值，通過標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值和濃度制作四參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照所得計(jì)算濃度公式算出樣本的濃度，用算出的濃度表示最終結(jié)果。

1.5 血清性激素檢測(cè) 采集空腹靜脈血，離心后取血清，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清促卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、泌乳素（PRL）、孕酮（P）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、抗繆勒管激素（AMH）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組全血Tfh 占比及PBMC CXCR5、BCL-6 蛋白相對(duì)表達(dá)量和血清IL-6、IL-21 水平比較 全血Tfh 占比及PBMC CXCR5、BCL-6 蛋白相對(duì)表達(dá)量和血清IL-6、IL-21水平比較見表1。

表1 兩組全血Tfh占比及PBMC CXCR5、BCL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量和血清IL-6、IL-21水平比較［M（P25，P75）］

2.2 兩組血清性激素水平比較 血清性激素水平比較見表2。

2.3 觀察組Tfh、CXCR5蛋白、BCL-6蛋白、IL-6、IL-21與性激素的相關(guān)性 全血Tfh 占比與血清FSH、LH水平呈正相關(guān)（r分別為0.75、0.63，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.35、-0.82，P均＜0.05）；血清IL-6 水平與血清FSH、LH 水平呈正相關(guān)（r分別為0.75、0.62，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.47、-0.77，P均＜0.05）；血清IL-12 水平與血清FSH、LH 水平呈正相關(guān)（r分別為0.68、0.56，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.25、-0.73，P均＜0.05）；PBMC BCL-6 蛋白表達(dá)與血清FSH、LH 水平呈正相關(guān)（r分別為0.73、0.60，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.27、-0.76，P均＜0.05）；PBMC CXCR5 蛋白表達(dá)與血清FSH、LH水平呈正相關(guān)（r分別為0.72、0.58，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.27、-0.70，P均＜0.05）。

3 討論

POI是指女性在40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退的臨床綜合征，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)異常、生育力降低或不孕、低雌激素水平及促性腺激素升高（FSH＞25 U/L），并伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀［6-7］。POI是漸進(jìn)變化并波動(dòng)的過程，是卵巢功能減退的早期階段［8-9］。POI 病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情進(jìn)展迅速且缺乏有效治療措施。POI 一旦發(fā)生常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生育問題，嚴(yán)重影響了女性的身心健康。文獻(xiàn)［10］報(bào)道，有4%～30%的POI 與自身免疫因素相關(guān)。研究［3，11］表明，POI患者中出現(xiàn)免疫紊亂。然而Tfh由CD4+T細(xì)胞分化而形成的一個(gè)特殊亞群，其通過觸發(fā)B 細(xì)胞分化成分泌抗體的漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞來參與體液免疫的調(diào)控［4，12］。研究發(fā)現(xiàn)，Tfh 在卵巢早衰中發(fā)揮著一定的作用。但是，目前Tfh在POI中的研究較少，對(duì)于介導(dǎo)POI的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過檢測(cè)POI 患者全血中Tfh 及其相關(guān)因子的表達(dá)，并通過分析POI患者Tfh及其相關(guān)因子與激素水平之間的相關(guān)性，探究Tfh在POI中的臨床價(jià)值。

Tfh 作為CD4+T 的一個(gè)特殊亞群，以高表達(dá)BCL-6、CXCR5、IL-21 為特征。IL-21 和BCL-6 對(duì)Tfh的發(fā)育至關(guān)重要，其中IL-21 誘導(dǎo)Tfh 分化并促進(jìn)其表面CXCR5 的表達(dá)［13］。此外，IL-6 和IL-21 作為正向調(diào)控Tfh 的細(xì)胞因子，IL-6 誘導(dǎo)新激活的CD4+T細(xì)胞表達(dá)BCL-6，促進(jìn)Tfh 的發(fā)育，在IL-6 缺失的情況下，可以觀察到Tfh 分化的早期缺陷［14］，因此其在Tfh產(chǎn)生過程中是必須的。Tfh在自身免疫性疾病疾病中發(fā)揮重要的免疫作用［15］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)［16］，Tfh 及相關(guān)因子在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中上調(diào)。此外有研究報(bào)道［17］，Tfh在卵巢相關(guān)疾病中會(huì)發(fā)生數(shù)量的變化，并與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)。

本研究顯示，與對(duì)照組相比，觀察組FSH、LH 水平升高，E2、AMH 水平降低。研究認(rèn)為，F(xiàn)SH 水平的升高和AMH水平的降低都表明患者卵巢功能變差。內(nèi)分泌激素水平表明POI的發(fā)生發(fā)展伴隨著相對(duì)應(yīng)激素的改變，且伴隨卵巢功能的減退。本研究還顯示，觀察組全血Tfh占比增加，CXCR5、BCL-6蛋白表達(dá)也增加，表明在POI 患者中Tfh 及相關(guān)分子增多。研究報(bào)道，POI 患者中CD4+T 細(xì)胞和B 細(xì)胞數(shù)量增多，CD4+/CD8+比值增加。在小鼠POI模型研究中發(fā)現(xiàn)并得出［16］，小鼠卵泡數(shù)量的減少與卵巢內(nèi)CD4+T細(xì)胞，B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增多有關(guān)。由此我們推測(cè)，在POI患者中出現(xiàn)了細(xì)胞免疫紊亂，該紊亂在一定程度上攻擊了卵巢組織并損傷了卵巢。ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組細(xì)胞因子IL-6、IL-21 水平明顯升高。IL-6 和IL-21 作為CD4+T 細(xì)胞分化過程中正調(diào)控因子，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為Tfh。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Tfh 及其相關(guān)因子與FSH，LH 呈正相關(guān)；與E2，AMH 呈負(fù)相關(guān)。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6 和IL-2l水平越高，AMH水平越低，卵巢儲(chǔ)備功能越差。由此推測(cè)，POI 患者中AMH 水平越低，與AMH 呈負(fù)相關(guān)的Tfh 占比及IL-6、IL-21 水平升高使得患者卵巢功能低下。

總之，POI患者全血Tfh占比增加，PBMC CXCR5、BCL-6 蛋白表達(dá)升高，血清IL-6、IL-21 水平升高，血清FSH、LH 水平升高和E2、AMH 水平降低，Tfh 及其相關(guān)因子與激素水平呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，可能參與了POI發(fā)生過程。