寨旭，裴紅紅，劉俊，黃婉

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，西安 710006

急性胰腺炎（AP）是臨床上較為常見的急腹癥之一，有較高的發(fā)病率和病死率［1］，治療手段以手術(shù)及藥物為主，但未能明顯提升患者生存質(zhì)量。炎癥是AP的標(biāo)志，在AP的發(fā)展進(jìn)程中具有極大影響。研究顯示，核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體與AP進(jìn)展關(guān)系密切，NLRP3炎癥小體在機(jī)體異常狀態(tài)時受外源或內(nèi)源刺激物反向激活，從而促進(jìn)疾病的發(fā)展［2］。因此，減輕炎癥是治療AP的關(guān)鍵。中醫(yī)藥在我國發(fā)展歷史悠久，AP屬中醫(yī)“腹痛”“胃脘痛”及“脾心痛”等范疇，飲食不節(jié)、情志不舒及氣機(jī)不暢是主要病機(jī)，中醫(yī)藥治療可有效緩解臨床癥狀［3-4］。異鉤藤堿（LSO）是從中藥鉤藤中提取的一種四環(huán)羥吲哚生物堿，具有較強(qiáng)的抗炎活性［5］。LSO可抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及損傷，并通過抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，但其在AP 細(xì)胞中的作用及機(jī)制鮮有報道［6-8］。本研究選用大鼠胰腺腺泡AR42J細(xì)胞，并以雨蛙素［9］誘導(dǎo)制備AP 細(xì)胞模型，后加入40 μmol/L 的LSO，觀察LSO 對大鼠AP 細(xì)胞的炎癥和凋亡改善及ERK信號通路調(diào)控作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥品、試劑與儀器 大鼠胰腺腺泡AR42J 細(xì)胞（上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司）。LSO（上海源葉生物科技公司，純度≥98%），雨蛙素（上海源葉生物科技有限公司，純度≥95%），ERK 信號通路抑制劑U0126（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），ERK 通路激活劑C16-PAF（阿拉丁，純度≥98%）。胎牛血清（美國Gibco 公司），F(xiàn)K-12 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），Hoechst 33258 染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒、5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（杭州主諾生物技術(shù)有限公司），RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP、β-actin 等一抗抗體及二抗包括堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+G）和AP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+G）均來源于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。HEPA CLASS100型培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），MA-3200Q 型熒光定量PCR 儀（蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司），Multiskan Sky High 型酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司），SZ51型倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及LSO 加入、最佳劑量篩選 將AR42J 細(xì)胞（≥80%密度）接種于的FK-12 培養(yǎng)基中（含20%胎牛血清，37 ℃、5% CO2條件下），換液間隔時間為2～3 d。取對數(shù)生長期的AR42J 細(xì)胞，并分為6 組，對照組不作處理，模型組及5、10、20、40 μmol/L LSO 組均以100 nmol/L 雨蛙素誘導(dǎo)細(xì)胞24 h 構(gòu)建體外AP 細(xì)胞模型，5、10、20、40 μmol/L LSO 組制模后加入5、10、20、40 μmol/L LSO，分別處理24 h 后，加入CCK8 溶液，培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）1 h后，用酶標(biāo)儀對各孔細(xì)胞在450 nm 處的OD 值進(jìn)行檢測，并計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=［（模型組或者5、10、20、40 μmol/L LSO 組OD 值-空白組OD值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）］×100%。對照組、模型組及5、10、20、40 μmol/L LSO 組細(xì)胞活力分別為100 ± 0.00、21.43 ± 3.31、29.48 ± 4.28、45.34 ± 5.58、61.72 ± 8.92、77.25 ± 8.43，對照組與模型組細(xì)胞比較，模型組與10、20、40 μmol/L LSO 組比較，P均＜0.05。因此，選擇效果最好的40 μmol/L LSO進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組、AP 細(xì)胞模型制備及40 μmol/L LSO加入 將AR42J細(xì)胞分為6組，對照組正常培養(yǎng)，其余5組先制備AP細(xì)胞模型（加入100 nmol/L雨蛙素），然后分為模型組、LSO組（再加入40 μmol/L LSO）、抑制劑組（再加入10 μmol/L ERK信號通路抑制劑U0126）、LSO+抑制劑組（再加入40 μmol/L LSO 和10 μmol/L U0126），LSO+激活劑組（再加入40 μmol/L LSO 和0.1 μmol/L ERK信號通路激活劑C16-PAF），為實(shí)驗(yàn)更具客觀性，每組處理均設(shè)置3次重復(fù)，培養(yǎng)24 h。

1.4 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的炎癥因子檢測 采用ELISA 法。取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后取上清液，均按照IL-6、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒說明書操作步驟，對IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平進(jìn)行檢測。

1.5 各組細(xì)胞增殖率測算 采用EdU 法。采用EdU 對各組細(xì)胞進(jìn)行2 h 孵育，4%多聚甲醛進(jìn)行固定，然后加入Click 反應(yīng)液進(jìn)行30 min 避光孵育，接著進(jìn)行復(fù)染，裝片后，EdU 紅色熒光信號和Hoechst 33342 藍(lán)色熒光信號均在熒光顯微鏡下觀察并采集（100×），并用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目確定。細(xì)胞增殖率（%）=紅色細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 各組細(xì)胞凋亡率測算 采用Hoechst 33258 染色法。各組細(xì)胞以PBS 洗滌（2 次/5 min），4 ℃固定（4%多聚甲醛，10 min）。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌（3 次/5 min），染色液（5 mg/L，Hoechst 33258）染色10 min，PBS 洗滌（3 次/5 min）后封固。熒光顯微鏡隨機(jī)拍照（3 個視野）。細(xì)胞凋亡特征：呈亮藍(lán)色，核體積變小、濃縮，不均濃染，熒光較強(qiáng)。細(xì)胞凋亡率即為凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.7 各組細(xì)胞NLRP3 炎癥小體mRNA 測算 采用實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）法。各組細(xì)胞提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃、5 min 預(yù)變性；94 ℃、35 s 變性，58 ℃、35 s 退火，72 ℃、35 s 延伸，設(shè)循環(huán)35 次。引物序列如下：NLRP3 上游引物5'-CAGACCTCCAAGACCACGACT-3'，下游引物5'-ATCCGCAGCCAATGAACAG-3'；ASC 上游引物5'-TTGCTGGATGCTCTGTATGG-3'，下游引物5'-CCAAGTAGGGCTGTGTTTGC-3'；Caspase-1 上游引物5'-GCAGCA-CAGACTTTCAACATC-3'，下游引物5'-GCAGCAGCAACTTCATTTCTC-3'；β-actin上游引物5'-CCAACCGTGAAAAGATGACC-3'，下游引物5'-GGTACGACCAGAGGCATACA-3'。內(nèi)參采用β-actin，NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計算。

1.8 各組細(xì)胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1 蛋白測算 采用蛋白免疫印跡（WB）法。將各組細(xì)胞重懸并裂解；在4 ℃環(huán)境下，以12 000 r/min速度離心10 min，取蛋白上清。利用凝膠電泳（80～120 V 恒壓法）進(jìn)行蛋白分離，再經(jīng)過電泳法（300 mA 恒流法）進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。載有蛋白的PVDF 膜在5%脫脂牛奶中進(jìn)行1 h 的封閉處理（室溫環(huán)境），對一抗進(jìn)行過夜孵育處理（4 ℃冰箱），對二抗進(jìn)行2 h孵育處理（室溫環(huán)境）。封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影之間分別用Tris 洗膜緩沖液進(jìn)行3～5 次膜洗滌。使用凝膠成像系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照并記錄，采用Image J 軟件對蛋白電泳圖進(jìn)行灰度值計算。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism8.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett's t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較 炎癥因子表達(dá)比較見表1。

表1 各組炎癥因子表達(dá)比較（pg/mL，）

表1 各組炎癥因子表達(dá)比較（pg/mL，）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LSO組比較，cP＜0.05。

組別對照組模型組LSO組抑制劑組LSO+抑制劑組LSO+激活劑組IL-1β 5.21 ± 0.62 24.54 ± 3.75a 15.33 ± 1.98b 14.98 ± 2.13b 7.21 ± 0.87c 22.98 ± 2.14c TNF-α 2.48 ± 0.31 15.27 ± 2.01a 10.28 ± 1.54b 9.67 ± 1.25b 4.02 ± 0.55c 14.29 ± 1.98c IL-6 3.29 ± 0.39 20.62 ± 2.65a 12.68 ± 2.01b 12.22 ± 1.58b 5.29 ± 0.72c 18.02 ± 2.12c IL-8 10.82 ± 1.55 41.31 ± 5.28a 28.45 ± 3.21b 27.31 ± 3.09b 14.29 ± 1.89c 39.22 ± 4.27c

2.2 各組細(xì)胞增殖率及凋亡率比較 細(xì)胞增殖率及凋亡率比較見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖率及凋亡率比較（%，）

表2 各組細(xì)胞增殖率及凋亡率比較（%，）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LSO 組比較，cP＜0.05。

細(xì)胞凋亡率1.97 ± 0.27 28.33 ± 3.21a 12.31 ± 1.87b 11.99 ± 1.67b 4.29 ± 0.65c 25.38 ± 3.26c組別對照組模型組LSO組抑制劑組LSO+抑制劑組LSO+激活劑組細(xì)胞增殖率43.25 ± 5.11 5.28 ± 0.65a 18.29 ± 2.13b 19.21 ± 2.44b 40.55 ± 5.21c 9.22 ± 1.23c

2.3 各組細(xì)胞NLRP3炎癥小體mRNA相對表達(dá)量比較 細(xì)胞NLRP3炎癥小體mRNA相對表達(dá)量比較見表3。

表3 各組細(xì)胞NLRP3炎癥小體mRNA相對表達(dá)量比較（）

表3 各組細(xì)胞NLRP3炎癥小體mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LSO 組比較，cP＜0.05。

Caspase-1 1.00 ± 0.00 2.86 ± 0.37a 2.08 ± 0.30b 1.99 ± 0.28b 1.32 ± 0.18c 2.69 ± 0.34c組別對照組模型組LSO組抑制劑組LSO+抑制劑組LSO+激活劑組NLRP3 1.00 ± 0.00 2.13 ± 0.31a 1.54 ± 0.19b 1.49 ± 0.27b 1.12 ± 0.15c 2.03 ± 0.25c ASC 1.00 ± 0.00 2.58 ± 0.43a 1.61 ± 0.25b 1.57 ± 0.29b 1.09 ± 0.18c 2.31 ± 0.33c

2.4 各組細(xì)胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1 蛋白相對表達(dá)量比較 細(xì)胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白相對表達(dá)量比較見表4。

表4 各組細(xì)胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相對表達(dá)量比較（）

表4 各組細(xì)胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LSO組比較，cP＜0.05。

組別對照組模型組LSO組抑制劑組LSO+抑制劑組LSO+激活劑組Caspase-1 0.29 ± 0.04 1.17 ± 0.18a 0.94 ± 0.11b 0.92 ± 0.18b 0.36 ± 0.04c 1.10 ± 0.12c ERK 1/2 0.21 ± 0.03 0.27 ± 0.04 0.23 ± 0.05 0.24 ± 0.03 0.21 ± 0.04 0.29 ± 0.05 p-ERK 1/2 0.22 ± 0.05 1.21 ± 0.23a 0.85 ± 0.09b 0.88 ± 0.11b 0.39 ± 0.05c 1.07 ± 0.21c NLRP3 0.21 ± 0.05 0.98 ± 0.13a 0.43 ± 0.05b 0.42 ± 0.06b 0.23 ± 0.05c 0.89 ± 0.10c ASC 0.27 ± 0.04 1.45 ± 0.19a 0.91 ± 0.12b 0.89 ± 0.15b 0.40 ± 0.05c 1.25 ± 0.19c

3 討論

AP 是指患者體內(nèi)胰酶的異常激活所引起胰腺組織的自身消化，伴有局部或全身性炎癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致器官衰竭，威脅患者的生活質(zhì)量和生命健康［10］。現(xiàn)階段AP的臨床治療以營養(yǎng)補(bǔ)充、控制胰酶分泌及手術(shù)治療為主，尚缺乏特效手段與策略。胰腺腺泡細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，也是胰腺炎發(fā)生時最直接的“受害者”，AR42J細(xì)胞穩(wěn)定，可誘導(dǎo)出外分泌活性，并伴有廣泛的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重構(gòu)。雨蛙素是一種膽囊收縮素受體，能刺激胰腺分泌胰酶和炎癥因子，破壞胰臟，常被用于構(gòu)建AP 模型［11］，篩選AP的藥物和機(jī)制研究。因此，研究AP發(fā)病時介導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控，對于尋找新的治療手段及開發(fā)新的治療藥物有重要意義。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中提取有效成分治療疾病的手段越來越受到關(guān)注。AP 是常見的消化系統(tǒng)疾病，在中醫(yī)上屬于“結(jié)胸”，與患者飲食不規(guī)律、脾胃和肝膽失調(diào)有關(guān)［12］。中醫(yī)藥在治療AP 方面已取得重要進(jìn)展，如大柴胡湯抑制AP 炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)［13］。LSO 作為鉤藤的有效提取成分，具有較強(qiáng)的抗炎及抗凋亡活性［14］。侯從嶺等［15］發(fā)現(xiàn)，LSO 可通過上調(diào)miRNA-192-5p 抑制TNF-α誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥因子釋放。ZHAO 等［16］發(fā)現(xiàn)，LSO 通過miRNA-122-5p/腫瘤蛋白/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑減輕腦出血后鐵蛋白沉著癥引起的神經(jīng)損傷。另有研究［17］顯示，LSO 通過抑制趨化因子受體1介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥減輕腦缺血/再灌注損傷。以上研究提示，LSO在減輕炎癥損傷方向具有較好的作用。但LSO是否可減輕AP 腺泡細(xì)胞損傷尚未有報道，AP 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及到多種因素，如炎癥、氧化及信號通路等，這些因素相互作用和影響，導(dǎo)致胰酶被激活，進(jìn)而促進(jìn)AP 的發(fā)展進(jìn)程［18］。NLRP3 炎癥小體作為當(dāng)前研究較為透徹且功能非常重要的疾病關(guān)聯(lián)因素，其激活與AP的發(fā)展密切相關(guān)。大承氣湯可以有效抑制NLRP3 炎癥小體活化，降低炎性因子水平，從而改善重癥AP 的功能［19］。說明，找尋有效抑制炎癥及NLRP3 炎癥小體激活的手段治療AP 是當(dāng)前的關(guān)鍵。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40 μmol/L LSO 是AP 腺泡細(xì)胞活力的最佳濃度；雨蛙素誘導(dǎo)后細(xì)胞培養(yǎng)液中的炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8 及IL-1β）水平、凋亡率及NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組升高，增殖率較對照組降低，而后在模型組基礎(chǔ)加入LSO 后，LSO 逆轉(zhuǎn)了雨蛙素對細(xì)胞上述指標(biāo)的作用。提示，LSO 可促進(jìn)AP 腺泡細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞炎癥、凋亡及NLRP3炎癥小體激活。

ERK 定位于細(xì)胞質(zhì)，可傳遞有絲分裂信號，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理過程［20］。經(jīng)多項基礎(chǔ)研究證實(shí)，ERK 信號通路與AP 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ZHANG 等［21］發(fā)現(xiàn)，沉默雙特異性磷酸酶1 基因通過抑制促有絲分裂原活化蛋白激酶及ERK 等信號通路，抑制AP 小鼠促炎細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而減輕AP 小鼠癥狀。另有研究［22］發(fā)現(xiàn)，丙二醇海藻酸鈉通過調(diào)節(jié)MEK/ERK 通路減輕雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠AP。馬彥娟等［23］發(fā)現(xiàn)，地塞米松抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1/smad/ERK 通路激活，能夠減少炎癥因子合成、釋放，保護(hù)胰腺腺泡細(xì)胞。以上研究表明，抑制ERK 信號通路激活可有效減輕AP 損傷。現(xiàn)有研究顯示，雨蛙素作用下細(xì)胞中p-ERK 1/2蛋白表達(dá)水平較對照組升高，加入LSO 后，細(xì)胞中p-ERK 1/2 蛋白表達(dá)水平較模型組降低，說明LSO可下調(diào)p-ERK 1/2蛋白表達(dá)水平。為進(jìn)一步觀察LSO干預(yù)ERK信號通路對AP 細(xì)胞炎癥、增殖、凋亡及NLRP3 炎癥小體的影響，本實(shí)驗(yàn)在LSO 組的基礎(chǔ)上分別加入了U0126及C16-PAF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入U0126 后細(xì)胞炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8及IL-1β）水平、凋亡率、p-ERK 1/2蛋白表達(dá)水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低，增殖率升高，而加入C16-PAF 后，細(xì)胞上述指標(biāo)與加入U0126 的趨勢相反。提示，LSO 可通過阻斷ERK 信號通路促進(jìn)AP 腺泡細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞炎癥、凋亡及NLRP3炎癥小體激活。

總之，LSO 可抑制急性胰腺炎細(xì)胞炎癥、凋亡及NLRP3 炎癥小體激活，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，機(jī)制可能與其可阻斷ERK信號通路有關(guān)。