陳陽(yáng)西，余幼微，楊帆，陳睦虎，宋其泰，鐘武，2

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，四川瀘州 646000；2 四川省康復(fù)醫(yī)院急診科

巨噬細(xì)胞是肺局部炎癥微環(huán)境和炎癥反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，當(dāng)肺受到各種外來(lái)致病因素刺激后，細(xì)胞被激活并釋放大量炎癥介質(zhì)，引起炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，細(xì)胞活化被認(rèn)為是急性肺損傷以及肺部炎性疾病的始發(fā)因素［1-2］。巨噬細(xì)胞在不同環(huán)境信號(hào)刺激下極化為兩種主要的功能表型，即M1 和M2型，它們可以產(chǎn)生促炎或抗炎因子［3-4］。所以任何影響巨噬細(xì)胞M1/M2 極化穩(wěn)態(tài)的因素都可能會(huì)造成機(jī)體疾病或炎癥狀態(tài)，通過(guò)干預(yù)巨噬細(xì)胞極化表型，可能成為治療急性肺損傷的新策略。二肽基肽酶-4（DPP-4）在肺實(shí)質(zhì)和人類支氣管的上皮、血管內(nèi)皮、成纖維細(xì)胞表面高度表達(dá)，通過(guò)切割和滅活部分趨化和炎癥因子可對(duì)炎癥和免疫功能產(chǎn)生顯著影響［5-6］。研究［7-9］發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激可使小鼠巨噬細(xì)胞中DPP-4表達(dá)增加5～10倍，DPP-4可通過(guò)直接或間接的方式來(lái)減少或增加促炎因子的產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)M1/M2型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中起不同的作用，但對(duì)DPP-4如何影響以及調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)研究還比較少。本研究觀察了轉(zhuǎn)染DPP-4 siRNA 或（和）加入c-Jun N-末端激酶抑制劑（SP600125）的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞極化情況、JNK/AP-1信號(hào)通路激活情況。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞（MH-S）、MH-S 細(xì)胞專用培養(yǎng)基（CM-0597）、無(wú)血清非程序凍存液（PB180438）；RIPA裂解液、蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑、一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒；PVDF 膜；預(yù)染蛋白；LPS（O111：B4）、c-Jun N-末端激酶（JNK）抑制劑（SP600125）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；一抗體：p-JNK、JNK，CD86、CD206、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos；二抗體：HRP標(biāo)志山羊抗小鼠、HRP標(biāo)志山羊抗兔；DPP-4 siRNA、riboFECTCP轉(zhuǎn)染試劑；引物；快速RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑盒、SYBR Green tag預(yù)混型qPCR試劑盒。

1.2 MH-S 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇購(gòu)買(mǎi)的MH-S 細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，加入MH-S 細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每間隔12 h或24 h更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%后吹打傳代，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MH-S 細(xì)胞M1 型極化標(biāo)志物及促炎因子檢測(cè) ①細(xì)胞CD86 蛋白：采用Western bolt 法。取MH-S 細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6 孔板中（2.0×105/孔），并隨機(jī)分為3 組，Control 組轉(zhuǎn)染空載siRNA，LPS 組轉(zhuǎn)染空載siRNA+LPS，siDPP-4+LPS 組轉(zhuǎn)染DPP-4 siRNA+LPS。將細(xì)胞使用PBS 水洗滌3 次，與RIPA裂解液混勻置于冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)移至EP 管低溫高速離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min）；采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，使用Loading Buffer 進(jìn)行蛋白調(diào)平；混勻后置于100 ℃金屬浴煮沸10 min 使蛋白變性。通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，快速封閉液室溫封閉0.5 h，TBST洗膜10 min、重復(fù)3 次；清洗后加入一抗（1∶1 000 稀釋）在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST 清洗10 min、重復(fù)3 次后加入二抗（1∶1 500 稀釋）在室溫下孵育1 h；孵育結(jié)束TBST 清洗10 min、重復(fù)3 次，滴加ECL 顯影液使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光條帶，采用Image J 對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量分析；蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/對(duì)應(yīng)GAPDH 灰度值。②細(xì)胞CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA：采用RT-qPCR 法。細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染同“1.3 中①”。使用快速RNA 提取試劑盒從細(xì)胞中分離RNA，以RNA 為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用SYBR熒光定量檢測(cè)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示為2-ΔΔCt值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算細(xì)胞中目的基因相對(duì)表達(dá)量。③細(xì)胞上清液NO、ROS：采用NO 測(cè)定試劑盒和免疫熒光法。取MH-S 細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6 孔板中（2.0×105/孔），并隨機(jī)分為4 組。Control 組轉(zhuǎn)染空載siRNA，LPS 組轉(zhuǎn)染空載siRNA+LPS，siDPP-4+LPS組轉(zhuǎn)染DPP-4 siRNA+LPS，siDPP-4組轉(zhuǎn)染DPP-4 siRNA。使用移液槍將細(xì)胞上清液100 μL 分別加入96 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)副孔，做好標(biāo)記；避光條件下依次加入Griess Reagent Ⅰ液50 μL 和Griess Reagent Ⅱ液50 μL 后輕輕混勻，室溫孵育10 min 后用酶標(biāo)儀在540 nm 處檢測(cè)各組吸光度值（OD 值）。另采用免疫熒光法分析各組細(xì)胞內(nèi)ROS 生成情況，將MH-S細(xì)胞接種至經(jīng)過(guò)透明平底處理的6孔板上，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS 水清洗3 次后吸去廢液；取二甲基亞砜（DMSO）溶解為5 mmol 的ROS-二氫乙啶（DHE）儲(chǔ)存液，將儲(chǔ)存液按照1∶500 比例使用PBS 水稀釋成工作液后加入6 孔板中與細(xì)胞混勻，將6 孔板置于37 ℃水浴鍋中避光孵育30 min，再次使用PBS 水清洗3 次后吸除廢液；滴加DAPI 染核，室溫避光孵育20～30 min于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照分析細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.4 MH-S 細(xì)胞M2 型極化標(biāo)志物檢測(cè) 細(xì)胞CD206 蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA：細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染、檢測(cè)方法同“1.3 中①、②”，分別采用Western bolt 法和RT-qPCR 法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示為2-ΔΔCt值，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算細(xì)胞中目的基因相對(duì)表達(dá)量，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/對(duì)應(yīng)GAPDH灰度值。

1.5 MH-S 細(xì)胞JNK、AP-1 轉(zhuǎn)錄蛋白（c-Jun、c-Fos）磷酸化檢測(cè) 取MH-S細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板中（2.0×105/孔），并隨機(jī)分為4 組。siDPP-4+LPS+SP600125 組轉(zhuǎn)染DPP-4 siRNA+LPS 聯(lián)合SP600125，LPS 組轉(zhuǎn)染空載siRNA+LPS，siDPP-4+LPS 組轉(zhuǎn)染DPP-4 siRNA+LPS，LPS+SP600125 組轉(zhuǎn)染空載siRNA+LPS 聯(lián)合SP600125。采用Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)情況，檢測(cè)方法同“1.3中①”，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白（磷酸化）灰度值/對(duì)應(yīng)總蛋白灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism9.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞M1 型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較（）

表1 各組細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS組LPS組Control組IL-1βmRNA 4.790 ± 0.130#2.151 ± 0.266*1.118 ± 0.113 CD86蛋白0.816 ± 0.115#0.446 ± 0.039*0.209 ± 0.037 CD86 mRNA 3.478 ± 0.172#1.993 ± 0.117*1.036 ± 0.093 TNFα mRNA 3.797 ± 0.218#2.682 ± 0.218*1.082 ± 0.071 iNOS mRNA 3.024 ± 0.387#2.022 ± 0.172*1.113 ± 0.148

2.2 各組細(xì)胞上清液促炎因子水平比較 細(xì)胞上清液促炎因子水平比較見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞上清液促炎因子水平比較（）

表2 各組細(xì)胞上清液促炎因子水平比較（）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS組siDPP-4組LPS組Control組ROS（熒光強(qiáng)度）85.66 ± 10.81#33.20 ± 5.58 63.16 ± 10.15*34.86 ± 6.67 NO（OD值）13.831 ± 0.402#3.589 ± 0.404 7.884 ± 0.438*3.072 ± 0.441

2.3 各組細(xì)胞M2 型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞M2型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞M2型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較（）

表3 各組細(xì)胞M2型極化標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS組LPS組Control組IL-10mRNA 0.600 ± 0.049#0.831 ± 0.042*0.990 ± 0.008 CD206蛋白0.051 ± 0.029#0.259 ± 0.060*0.669 ± 0.126 CD206 mRNA 0.674 ± 0.046#0.906 ± 0.054*1.042 ± 0.049 ARG-1 mRNA 0.673 ± 0.068#0.807 ± 0.009*0.987 ± 0.037 IL-4 mRNA 0.702 ± 0.039#0.850 ± 0.062*1.008 ± 0.071

2.4 各組細(xì)胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos 蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos 蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)量比較（）

表4 各組細(xì)胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與LPS組比較，*P＜0.05；與siDPP-4+LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS+SP600125組LPS組siDPP-4+LPS組LPS+SP600125組p-c-Fos/c-Fos 0.114 ± 0.016#0.324 ± 0.022 0.867 ± 0.055*0.098 ± 0.008*p-JNK/JNK 0.165 ± 0.021#0.373 ± 0.034 0.956 ± 0.099*0.155 ± 0.011*p-c-Jun/c-Jun 0.128 ± 0.010#0.533 ± 0.174 1.165 ± 0.057*0.178 ± 0.041*

3 討論

肺是人體中參與氣體交換的主要場(chǎng)所，在呼吸過(guò)程中肺部可遭受各種環(huán)境因素影響，比如暴露于煙霧、微粒的侵害以及病原體形式（如細(xì)菌、病毒和真菌）的感染［10］。肺部免疫細(xì)胞群主要由肺泡巨噬細(xì)胞構(gòu)成，在維持肺部免疫穩(wěn)態(tài)和防御過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，是機(jī)體抵御外部侵害的首道防線［2］。在外來(lái)病原體的刺激下，巨噬細(xì)胞可以釋放多種炎癥因子和趨化因子，在肺組織內(nèi)引發(fā)一系列炎癥放大反應(yīng)并介導(dǎo)肺組織損傷。由LPS 或干擾素-γ 誘導(dǎo)的M1 型巨噬細(xì)胞高度表達(dá)M1 型效應(yīng)分子，如CD86、iNOS、TNF-α，通過(guò)產(chǎn)生活性氮和活性氧中間體參與NO 釋放和ROS 合成，具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗菌、促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)造成組織損傷的作用；由IL-4 和IL-10 誘導(dǎo)的M2 型巨噬細(xì)胞高度表達(dá)M2 型效應(yīng)分子，如CD206、ARG-1、IL-10、CD163，主要發(fā)揮抗炎反應(yīng)，在致病因素消除或者炎癥后期促進(jìn)組織修復(fù)和炎癥反應(yīng)消退，具有促進(jìn)血管生成、纖維化、腫瘤形成等功能［11-13］。因此，由巨噬細(xì)胞M1/M2 型極化失衡后釋放的炎性細(xì)胞因子和趨化介質(zhì)可在肺部炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用，并與急性肺損傷、慢性阻塞性肺病、哮喘、特發(fā)性肺纖維化等肺部炎性疾病密切相關(guān)［14］。所以在本研究中，我們以小鼠肺泡巨噬細(xì)胞為關(guān)注點(diǎn)，并探討其可能影響巨噬細(xì)胞極化的靶點(diǎn)和作用機(jī)制，從而有助于我們更新和拓展巨噬細(xì)胞極化在急性肺損傷和相關(guān)肺部炎性疾病中的功能作用，為巨噬細(xì)胞參與的肺部炎性疾病治療提供新的思路和方向。

DPP-4 是一種調(diào)節(jié)胃腸源性肽激素的蛋白酶，其生物活性對(duì)內(nèi)分泌途徑具有重要意義，其抑制劑通過(guò)增加胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖依賴的促胰島素多肽水平被廣泛用于治療2 型糖尿?。?5］。由于DPP-4 在肺上皮、血管內(nèi)皮以及肺泡巨噬細(xì)胞表面大量表達(dá)，越來(lái)越多的研究關(guān)注DPP-4 及其抑制劑在炎癥性肺部疾病中的潛在作用［5］。研究［16］表明，DPP-4 在巨噬細(xì)胞中可發(fā)揮直接的促炎作用，可溶性DPP-4 刺激LPS 預(yù)處理的細(xì)胞中會(huì)以劑量依賴性方式增加iNOS表達(dá)和NO的產(chǎn)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，DPP-4在巨噬細(xì)胞高表達(dá)情況下通過(guò)CXCR4/mTOR 通路在促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬的同時(shí)發(fā)揮一定的抗炎作用［17］。也有研究［8］揭示，DPP-4 以ROS 依賴的方式通過(guò)增加M1 極化和抑制M2 極化的方式來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2 極化平衡。以上研究充分證實(shí)了DPP-4 在炎癥免疫過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，但關(guān)于DPP-4是如何影響巨噬細(xì)胞參與的極化過(guò)程卻少有研究。由于DPP-4在巨噬細(xì)胞中存在差異表達(dá)，所以本研究通過(guò)DPP-4 siRNA 轉(zhuǎn)染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的方法來(lái)探明LPS刺激的巨噬細(xì)胞極化表型轉(zhuǎn)變情況。本研究顯示，與Control 組比較，LPS 組M1 型促炎因子NO、ROS，M1 型極化標(biāo)志物（CD86蛋白和CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA）表達(dá)升高，M2型極化標(biāo)志物（CD206蛋白和CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA）表達(dá)降低。與LPS 組比較，siDPP-4+LPS 組M1 型促炎因子NO、ROS，M1 型極化標(biāo)志物（CD86 蛋白和CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA）表達(dá)升高，而M2 型極化標(biāo)志物（CD206 蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA）表達(dá)降低。所以上述實(shí)驗(yàn)研究觀察到的M1/M2型極化標(biāo)志物表達(dá)平衡變化和炎癥因子的釋放情況，說(shuō)明了轉(zhuǎn)染DPP-4可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型極化增強(qiáng)，使巨噬細(xì)胞M2 型極化減弱，并通過(guò)M1 型相關(guān)促炎因子的釋放在一定程度上促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

JNK 作為絲裂原活化蛋白激酶的重要組成之一，在巨噬細(xì)胞M1 型極化過(guò)程中起到重要作用［18-19］。激活蛋白-1（AP-1）作為JNK 重要的效應(yīng)物，主要由c-Jun和c-Fos組成，其表達(dá)靶基因的激活需要c-Jun 和c-Fos 的二聚化，這是AP-1 發(fā)揮功能的關(guān)鍵步驟［20］。AP-1 對(duì)先天免疫，尤其對(duì)巨噬細(xì)胞M1 型極化有著重要作用［21-22］。在炎癥反應(yīng)中，當(dāng)JNK 被特異性激活后，可進(jìn)一步激活A(yù)P-1 等下游底物，導(dǎo)致促炎因子表達(dá)增加，如環(huán)氧合酶-2、TNF-α、IL-6 等［23］。以上研究證明了JNK/AP-1 信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞M1 型極化過(guò)程的中的重要作用，但這一作用機(jī)制在肺泡巨噬細(xì)胞中是否適用還有待證實(shí)。所以，在本次研究中我們進(jìn)一步評(píng)估了JNK/AP-1信號(hào)通路在轉(zhuǎn)染DPP-4 條件下對(duì)巨噬細(xì)胞極化表型變化的具體作用；研究發(fā)現(xiàn)，與LPS 組比較，siDPP-4+LPS 組p-JNK/JNK 和下游AP-1 轉(zhuǎn)錄蛋白（p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos）的蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)量升高；與siDPP-4+LPS 組比較，siDPP-4+LPS+SP600125組p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)量降低；以上結(jié)果說(shuō)明了轉(zhuǎn)染DPP-4 后可促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的JNK/AP-1 信號(hào)通路的激活，加入JNK 抑制劑后，由轉(zhuǎn)染DPP-4 引起的JNK/AP-1 信號(hào)通路的激活效應(yīng)則被抑制。與LPS+SP600125 組相比，siDPP-4+LPS+SP600125 組中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun和p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對(duì)表達(dá)量變化無(wú)顯著差異，說(shuō)明使用DPP-4 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并不會(huì)影響JNK 抑制劑引起的JNK/AP-1信號(hào)通路變化，從而進(jìn)一步說(shuō)明JNK/AP-1信號(hào)通路在此次LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1型極化過(guò)程中扮演重要作用。綜合以上數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為，轉(zhuǎn)染DPP-4后可能通過(guò)LPS誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞中JNK/AP-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，從而參與巨噬細(xì)胞M1型極化過(guò)程。

總之，轉(zhuǎn)染DPP-4 siRNA 可促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥中JNK/AP-1 信號(hào)通路的激活，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化的發(fā)生。