韓敏，張韶君，席迅

山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）口腔科，濟(jì)南 250014

牙周炎是一種逐漸破壞牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重的牙周炎會(huì)導(dǎo)致牙槽骨吸收和牙齒松動(dòng)脫落，并對患者的口腔功能和生活質(zhì)量造成不良影響［1］。牙周炎與諸多全身性疾病有著非常密切的關(guān)系，例如不良妊娠、心血管疾病、2 型糖尿病等［2］。因此，治療牙周炎對于改善患者的生活質(zhì)量至關(guān)重要。目前，牙周炎治療的熱點(diǎn)方向是牙周組織再生，而間充質(zhì)干細(xì)胞是牙周組織再生的重點(diǎn)研究內(nèi)容［3］。人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）是具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新潛力，被認(rèn)為是牙周炎再生治療的一個(gè)非常有前途的干細(xì)胞群體［4］。有研究［5-7］證實(shí)，小檗堿通過MAPK/ERK 信號通路促進(jìn)hPDLSCs 成骨分化，山奈酚通過Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)hPDLSCs 增殖和成骨分化，川續(xù)斷通過血管內(nèi)皮生長因子/PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)hPDLSCs 成骨分化。目前，關(guān)于補(bǔ)骨脂素對hPDLSCs 增殖和成骨分化影響的研究較少。補(bǔ)骨脂素屬于呋喃香豆素類，自然存在于各種植物中［8］?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)骨脂素具有抗炎、抗癌、抗菌和雌激素活性等作用，具有廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景［9-13］。有文獻(xiàn)［14］報(bào)道，補(bǔ)骨脂素通過激活TGF-TGF/Smad3 通路，加速人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。過高濃度的補(bǔ)骨脂素并不利于細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能［15］。目前，對補(bǔ)骨脂素作用的研究主要集中于成品細(xì)胞系和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［16-18］，對于其在hPDLSCs 成骨分化方面的研究報(bào)道較少。hPDLSCs 成骨分化過程需要諸多信號因子參與調(diào)節(jié)，其中骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）是成骨向分化所必需的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。Runx2 能上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的胞外基質(zhì)合成，加速細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)合成代謝及成骨反應(yīng)，對于觀察hPDLSCs 成骨分化具有重要意義［19］。2023年3—9月，我們觀察了補(bǔ)骨脂素對hPDLSCs增殖、成骨分化的促進(jìn)作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清（派克，上海中國），α-MEM培養(yǎng)基（元培，上海中國），胰酶消化液（元培，上海中國），青霉素鏈霉素（元培，上海中國）、磷酸鹽緩沖液（元培，中國）、維生素C（索萊寶，中國）、地塞米松（索萊寶，中國）、β-甘油磷酸二鈉鹽（索萊寶，中國）、茜素紅（索萊寶，中國）、補(bǔ)骨脂素（MCE，美國）、氯化合物（Sigma，美國）、PE 抗人CD34 抗體（BioLegend，英國）、APC 抗人CD90 抗體（BioLegend，英國）、增強(qiáng)型細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Elabscience，武漢中國）、ALP 比色法試劑盒（Elabscience，中國）、總RNA 提取試劑盒（天根，中國）。

1.2 hPDLSCs 培養(yǎng)與鑒定 本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No 2022-S264），取材自山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科門診拔除的健康成人的第三磨牙，拔牙后2 h內(nèi)從牙根中間三分之一刮取牙周膜組織，并分離為1.0 mm×1.0 mm 的組織塊，平鋪在培養(yǎng)瓶的底部，每3天更換一次含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，第7 天時(shí)鏡下可見組織周圍有細(xì)胞爬出。以1∶2 的比例傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)均勻，呈纖細(xì)紡錘形。通過流式細(xì)胞儀檢測第三代細(xì)胞的表面標(biāo)記物，造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34 呈陰性，間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD90 呈強(qiáng)陽性。取第三代hPDLSCs 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 hPDLSCs 增殖能力檢測 取第三代hPDLSCs，分為6 組，接種在96 孔板中，每組3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。5、10、25、50、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂素組分別加入含最終濃度為5、10、25、50、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)。48 h后，棄原培養(yǎng)液，每孔加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（CCK-8）溶液100 μL，再培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處OD值。

1.4 hPDLSCs成骨分化能力檢測

1.4.1 ALP 活性 采用比色法檢測。取第三代hPDLSCs，并分為6 組，接種在96 孔板中，每組3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。5、10、25、50、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂素組分別加入含最終濃度為5、10、25、50、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂素的成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，對照組以正常成骨液誘導(dǎo)培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)液每3 天更換1 次。培養(yǎng)7 d，用塑料細(xì)胞刮板從平板上刮下細(xì)胞，在冰水浴中超聲處理后，提取上清液，使用比色法檢測上清液中ALP 的活性，采用酶標(biāo)儀檢測520 nm波長處OD值。

1.4.2 成骨礦化結(jié)節(jié) 采用茜素紅染色檢測。取第三代hPDLSCs，并分為6組，每組3個(gè)復(fù)孔，接種在96 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。5、10、25、50、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂素組分別加入含最終濃度為5、10、25、50、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂素的成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，對照組以正常成骨液誘導(dǎo)培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)液每3天更換1次。培養(yǎng)21 d，用茜素紅染色檢測成骨礦化結(jié)節(jié)，并用10%氯化十六烷基吡啶進(jìn)行定量，采用酶標(biāo)儀檢測562 nm波長處OD值。

1.5 hPDLSCs Runx2、骨橋蛋白（OPN）mRNA 檢測 將第三代hPDLSCs 接種到6 孔板中，并分為兩組，對照組在成骨誘導(dǎo)液中正常培養(yǎng)；25 μmol/L 補(bǔ)骨脂素組在含25 μmol/L 補(bǔ)骨脂素的成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)液每3 天更換1 次，培養(yǎng)14 d，按照RNA 提取試劑盒的說明提取總RNA，使用FastKing RT 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測Runx2 和OPN mRNA，以β-actin 作為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計(jì)和合成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較若方差齊采用LSD 法檢驗(yàn)，若方差不齊采用Tamhane 法檢驗(yàn)，兩兩比較采用配對樣本T檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖、成骨分化能力比較 細(xì)胞增殖、成骨分化能力比較見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖、成骨分化能力比較（）

表1 各組細(xì)胞增殖、成骨分化能力比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與5 μmol/L 補(bǔ)骨脂素組比較，bP＜0.05；與10 μmol/L 補(bǔ)骨脂素組比較，cP＜0.05；與25 μmol/L 補(bǔ)骨脂素組比較，dP＜0.05。

細(xì)胞成骨礦化結(jié)節(jié)（OD值）1.20 ± 0.17 1.70 ± 0.36 3.02 ± 0.12ab 1.47 ± 0.39 1.69 ± 0.38 0.84 ± 0.03組別5 μmol/L補(bǔ)骨脂素組10 μmol/L補(bǔ)骨脂素組25 μmol/L補(bǔ)骨脂素組50 μmol/L補(bǔ)骨脂素組100 μmol/L補(bǔ)骨脂素組對照組細(xì)胞增殖能力（OD值）1.61 ± 0.79a 1.73 ± 0.53a 3.71 ± 0.15abc 3.45 ± 0.14abc 3.37 ± 0.42abc 0.06 ± 0.02細(xì)胞ALP活性（OD值）0.25 ± 0.08a 0.43 ± 0.07ab 0.42 ± 0.05ab 0.22 ± 0.03acd 0.20 ± 0.05acd 0.05 ± 0.01

2.2 兩組細(xì)胞Runx2、OPN mRNA 相對表達(dá)量比較 細(xì)胞Runx2、OPN mRNA 相對表達(dá)量比較見表2。

表2 兩組細(xì)胞Runx2、OPN mRNA相對表達(dá)量比較（）

表2 兩組細(xì)胞Runx2、OPN mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別25 μmol/L補(bǔ)骨脂素組對照組OPN mRNA相對表達(dá)量5.44 ± 1.36a 1.38 ± 1.34 Runx2 mRNA相對表達(dá)量7.03 ± 3.55a 1.16 ± 0.70

3 討論

牙周炎主要由革蘭氏陰性細(xì)菌感染引起，是最常見的口腔感染性疾病，對患者的口腔功能、面部美學(xué)和生活質(zhì)量都有嚴(yán)重不良影響［20］。研究［21］顯示，牙周炎的主要癥狀包括結(jié)締組織破壞、牙周附著喪失和牙槽骨吸收等。目前，牙周炎的治療方法主要為基礎(chǔ)治療、內(nèi)科治療和手術(shù)治療等。引導(dǎo)組織再生術(shù)的主要目的是恢復(fù)和重建喪失的牙周組織，但尚不能獲得理想的牙周組織再生［22］。在正常生理?xiàng)l件下，牙槽骨的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞相互作用，共同維持骨改建的動(dòng)態(tài)平衡［23-24］。牙周炎患者牙周組織喪失源于骨改建的失衡，如何阻止牙周炎患者牙槽骨吸收，并實(shí)現(xiàn)牙槽骨再生，一直是牙周炎治療關(guān)注的熱點(diǎn)。牙周膜干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等，具有調(diào)節(jié)牙槽骨改建的潛能，是研究牙周組織再生的首選細(xì)胞［25］。牙周膜干細(xì)胞的成骨分化功能，可成為牙槽骨再生治療的重要手段。

補(bǔ)骨脂素是一種天然的呋喃香豆素類生物活性分子，廣泛存在于多種自然植物中，如補(bǔ)骨脂、檸檬、酸橙、歐洲防風(fēng)草、無花果和五指毛桃等，可用于治療骨質(zhì)疏松［15］、腫瘤［26］、骨關(guān)節(jié)炎［27］、皮膚病［28］等?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)骨脂素具有抗炎、抗癌、抗菌和雌激素活性等作用，其廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，正受到越來越多研究者的關(guān)注［9-13］。本實(shí)驗(yàn)利用補(bǔ)骨脂素抗炎、抗骨質(zhì)疏松的生物學(xué)特性，探究其在牙槽骨再生中的作用和機(jī)制。過高濃度的補(bǔ)骨脂素并不利于細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能［29］，為了保證觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5種不同補(bǔ)骨脂素濃度的實(shí)驗(yàn)組，以觀察補(bǔ)骨脂素對細(xì)胞增殖和成骨分化的影響。

本文通過體外實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)骨脂素對hPDLSCs增殖、成骨分化的影響，證實(shí)補(bǔ)骨脂素具有促進(jìn)hPDLSCs 增殖和成骨分化的作用。CCK-8 檢測提示，補(bǔ)骨脂素能夠促進(jìn)hPDLSCs 增殖，濃度在25～100 μmol/L范圍內(nèi)效果更好。ALP活性檢測用于檢測成骨分化的早期潛力，是成骨分化的重要標(biāo)志。ALP 活性檢測結(jié)果提示，補(bǔ)骨脂素能夠提高h(yuǎn)PDLSCs ALP 的活性，且濃度在10～25 μmol/L 范圍內(nèi)效果更好。茜素紅染色常用于檢測鈣沉積，證實(shí)細(xì)胞出現(xiàn)成骨分化特性。茜素紅染色結(jié)果顯示，25 μmol/L的補(bǔ)骨脂素能夠促進(jìn)hPDLSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)形成礦化結(jié)節(jié)。當(dāng)補(bǔ)骨脂素濃度＞25 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的成骨分化特性表達(dá)反而不強(qiáng)烈，可能是由于過高濃度的藥物對細(xì)胞的功能產(chǎn)生了不利影響。Runx2是成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，能上調(diào)前成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞中各種礦化相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，使其向成骨細(xì)胞方向分化；OPN是一種重要的骨基質(zhì)蛋白，在骨礦化、代謝、重建中起重要作用。RT-qPCR法結(jié)果顯示，與對照組比較，25 μmol/L 的補(bǔ)骨脂素能夠提高h(yuǎn)PDLSCs 中Runx2、OPN mRNA 的相對表達(dá)量，證實(shí)補(bǔ)骨脂素的作用可能與Runx2信號通路有關(guān)。

總之，補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)hPDLSCs 的增殖和成骨分化，尤以25 μmol/L 補(bǔ)骨脂素效果最好，機(jī)制可能與其可增強(qiáng)Runx2信號通路有關(guān)。