孫瑋螺，劉素英，李思錦，周龍妹，何培元

承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，河北承德 067000

結腸癌是世界上第三大常見的癌癥，也是癌癥相關死亡的主要原因之一，發(fā)病率和病死率均有逐年上升趨勢。盡管在過去幾十年中結腸癌的診斷和治療取得了一些進展，但患者5年生存率仍為40%～60%［1］。HCT116、SW480、LoVo 是人結腸癌細胞系，常應用于結腸癌的實驗研究，其中HCT116 是從一名男性結腸癌患者分離出的結腸癌細胞，適合結腸癌的細胞學功能研究。結腸癌的高發(fā)病率和不良預后意味著需要更深入了解其形成和發(fā)展的潛在機制，從而開發(fā)新的、有效的治療方法，而尋找能有效阻斷癌癥發(fā)生發(fā)展的關鍵基因才是目前研究的重點［2］。微小核糖核酸（miRNA）作為腫瘤抑制劑或致癌基因，在調節(jié)多種惡性腫瘤形成和發(fā)展中發(fā)揮至關重要的作用［3］。在對結腸癌的相關研究中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些異常表達的miRNAs 可能與其形成機制有關［4］。微小核糖核酸193b-3p（miR-193b-3p）是新近發(fā)現(xiàn)的miR-193 家族成員之一，在許多癌癥組織和細胞中異常低表達，可能影響腫瘤的形成和發(fā)展［5］，但其在結腸癌中的研究鮮見報道。P21 活化蛋白激酶4（PAK4）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前認為其作為癌基因，在多種癌癥中表達上調，具有促進腫瘤細胞生長的作用［6-7］。生物信息在線軟件顯示PAK4 的3'UTR 區(qū)存在miR-193b-3p 的結合位點，但miR-193b-3p與PAK4在結腸癌作用中的靶向關系尚不明確。2022 年1—8 月，我們觀察了miR-193b-3p、PAK4 過表達對人結腸癌細胞系HCT116 細胞增殖凋亡和遷移侵襲的影響，并驗證兩者的靶向關系。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑、儀器 人結腸癌細胞系HCT116、SW480、LoVo 及人正常結腸黏膜上皮細胞FHC 購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS 購自美國Gibco 公司；RNA 抽取試劑TRIzol 購自北京百奧萊博公司；所有引物購自上海生工生物公司；逆轉錄試劑盒和PCR 熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司；Lipofectamine 2000 脂質體轉染試劑盒購自美國Invitrogen 公司；miRNA 陰性對照miR-NC、miR-193b-3p 模擬物miR-193b-3p mimics、PAK4空載體（PAK4-NC）、PAK4過表達載體（pcDNA3.1-PAK4）、熒光素酶報告基因質粒野生型（PAK4-wt）及突變型（PAK4-mut）購自上海吉瑪制藥公司；雙熒光素酶基因報告試劑盒購自美國Promega公司；CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Transwell小室、基質膠購自美國Corning 公司。ABI 7500 熒光定量PCR 儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，流式細胞儀購自美國Becton Dickinson 公司，多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司。

1.2 HCT116、SW480、LoVo、FHC 細胞系中miR-193b-3p、P21 活化蛋白激酶4（PAK4）mRNA 測算HCT116、SW480、LoVo、FHC細胞系培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基中（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素），培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。采用RT-PCR 法檢測各細胞系中miR-193b-3p、PAK4 mRNA。使用TRIzol 試劑提取各細胞總RNA，將提取的總RNA 逆轉錄得到cDNA 后，加入各引物，應用PCR 熒光定量試劑盒配置反應系統(tǒng)，在ABI 7500 熒光定量PCR 儀上進行PCR 反應。PCR反應條件：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，62 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共45 個循環(huán)。PCR 引物序列如下：miR-193b-3p 正向引物 5'-TCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3'，反向引物 5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；PAK4 正向引物5'-TCCCCCTGAGCCATTGTG-3'，反 向 引 物 5'-TGACCTGTCTCCCCATCCA-3'；GAPDH 正向引物5'-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3'，反向引物5'-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3'。以U6 作為miR-193b-3p內參，以GAPDH 作為PAK4內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-193b-3p、PAK4 mRNA 的表達水平。HCT116、SW480、LoVo、FHC 中miR-193b-3p 的相對表達量分別為0.29 ± 0.08、0.49 ± 0.07、0.41 ±0.10、1.01 ± 0.04，PAK4 mRNA 的相對表達量分別為2.14 ± 0.18、1.82 ± 0.13、1.91 ± 0.17、1.02 ±0.07，HCT116、SW480、LoVo 與FHC 比較，P均＜0.05。選擇miR-193b-3p 的相對表達量最低的HCT116細胞進行后續(xù)研究。

1.3 HCT116 細胞分組、轉染及轉染效率檢測 取對數(shù)生長期HCT116 細胞，鋪于6 孔板，待細胞融合度達70%～80%時，按照Lipofectamine 2000 脂質體轉染試劑盒說明書操作進行轉染，根據(jù)轉染物不同分為4組，miR-NC組轉染miR-NC，miR-193b-3p組轉染miR-193b-3p mimics，miR-193b-3p+PAK4-NC組共轉染miR-193b-3p mimics+PAK4-NC，miR-193b-3p+PAK4 組 共 轉 染 miR-193b-3p mimics+pcDNA 3.1-PAK4，轉染后4 h 更換細胞培養(yǎng)基，轉染后24 h收集細胞進行后續(xù)實驗。采用RT-PCR 法檢測各組細胞中miR-193b-3p、PAK4 mRNA，確定miR-193b-3p模擬物的轉染效率。miR-NC 組、miR-193b-3p組、miR-193b-3p+PAK4-NC 組、miR-193b-3p+PAK4組miR-193b-3p mRNA相對表達量分別為1.02 ± 0.03、3.86 ± 0.28、3.81 ± 0.31、3.83 ± 0.25，miR-NC 組與miR-193b-3p組比較，P＜0.05；miR-NC組、miR-193b-3p組、miR-193b-3p+PAK4-NC 組、miR-193b-3p+PAK4組PAK4 mRNA 相對表達量分別為0.98 ± 0.03、0.33 ± 0.09、0.36 ± 0.10、1.55 ± 0.17，miR-NC 組與miR-193b-3p 組比較，miR-193b-3p+PAK4-NC 組與miR-193b-3p+PAK4 組比較，P均＜0.05。證明miR-193b-3p 模擬物轉染效率較高，符合后續(xù)實驗要求。

1.4 轉染miR-193b-3p 模擬物的HCT116 細胞增殖活性檢測 采用CCK-8 實驗。將HCT116 細胞按照“1.3”所述方法分組及轉染24 h后，接種于96孔板，每組設置4個復孔，轉染后在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，酶標儀測定450 nm 波長處光密度值（OD），以此代表細胞的增殖活性。

1.5 轉染miR-193b-3p 模擬物的HCT116 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。將HCT116 細胞按照“1.3”所述方法分組及轉染24 h后，預冷的PBS清洗細胞2 次，預冷的1×Annexin V 結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI充分混勻，室溫避光孵育15 min，立即用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 轉染miR-193b-3p 模擬物的HCT116 細胞遷移及侵襲能力檢測 采用Transwell 遷移及侵襲實驗。將HCT116細胞按照”1.3”所述方法分組及轉染24 h后，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液，侵襲實驗時首先Transwell 上室面涂抹Matrigel 膠，將200 μL單細胞懸液加入Transwell上室內，下室加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基誘導細胞，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下繼續(xù)孵育24 h 后取出小室，棉簽蘸去上室面未穿過濾膜的殘留細胞，10%甲醛固定后染色，顯微鏡下觀察計算穿膜細胞數(shù)。遷移實驗時Transwell上室面不涂抹Matrigel膠，其余步驟同侵襲實驗。細胞遷移及侵襲能力以穿膜細胞數(shù)表示。

1.7 miR-193b-3p 與PAK4 靶向關系驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。收集HCT116細胞，以3×104個/孔細胞密度接種于12孔板培養(yǎng)，待細胞融合度達70%～80%時，按照Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒說明書操作進行轉染，根據(jù)轉染物不同將細胞分為4 組：PAK4-wt+miR-NC 組共轉染PAK4-wt+miR-NC、PAK4-wt+miR-193b-3p mimics 組共轉染PAK4-wt+miR-193b-3p mimics、PAK4-mut+miR-NC 組共轉染PAK4-mut+miR-NC、PAK4-mut+miR-193b-3p mimics組共轉染PAK4-mut+miR-193b-3p mimics。轉染24 h后收集各組HCT116細胞并裂解細胞，應用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時點細胞OD 值比較 不同時點細胞OD值比較見表1。

表1 各組不同時點細胞OD值比較（）

表1 各組不同時點細胞OD值比較（）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與miR-193b-3p組比較，bP＜0.05；與miR-193b-3p+PAK4-NC組比較，cP＜0.05。

組別miR-NC組miR-193b-3p組miR-193b-3p+PAK4-NC組miR-193b-3p+PAK4組細胞OD值72 h 3.74 ± 0.26 1.53 ± 0.15a 1.46 ± 0.13a 2.48 ± 0.11abc 24 h 0.88 ± 0.06 0.40 ± 0.09a 0.44 ± 0.10a 0.60 ± 0.08abc 48 h 1.92 ± 0.21 0.79 ± 0.10a 0.84 ± 0.08a 1.29 ± 0.13abc

2.2 各組細胞凋亡率、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)比較 細胞凋亡率、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)比較見表2。

表2 各組細胞凋亡率、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)比較（）

表2 各組細胞凋亡率、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)比較（）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與miR-193b-3p組比較，bP＜0.05；與miR-193b-3p+PAK4-NC組比較，cP＜0.05。

組別miR-NC組miR-193b-3p組miR-193b-3p+PAK4-NC組miR-193b-3p+PAK4組侵襲細胞數(shù)（個）230 ± 29 98 ± 17a 104 ± 13a 186 ± 18abc細胞凋亡率（%）4.45 ± 0.91 23.39 ± 4.36a 21.17 ± 3.89a 10.14 ± 1.44abc遷移細胞數(shù)（個）324 ± 26 145 ± 20a 152 ± 17a 278 ± 15abc

2.3 miR-193b-3p 與PAK4 的靶向關系驗證結果生物信息在線軟件Target Scan7.2（https：//www.targetscan. org）在線預測顯示，PAK4 的3'UTR 區(qū)存在miR-193b-3p的結合位點，結合功能分析預測PAK4可能為miR-193b-3p的靶基因。雙熒光素酶報告基因結果顯示，PAK4-wt+miR-NC組、PAK4-wt+miR-193b-3p mimics 組、PAK4-mut+miR-NC 組、PAK4-mut+miR-193b-3p mimics 組細胞熒光素酶活性分別為0.99 ±0.03、0.48 ± 0.07、1.02 ± 0.04、1.00 ± 0.03，PAK4-wt+miR-193b-3p mimics組細胞的熒光素酶活性明顯低于PAK4-wt+miR-NC 組（P＜0.05），而PAK4-mut+miR-193b-3p mimics 組細胞熒光素酶活性與PAK4-mut+miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，隨著結直腸鏡檢率的提高，該病早期診斷率有所提高，早期患者5 年生存率超過90%，但其具有高轉移潛能，大部分病例在確診時已經(jīng)出現(xiàn)了淋巴結或遠處轉移。研究［8］顯示，高達80%的轉移性結直腸癌患者，原發(fā)腫瘤在＜0.01 cm3時就已經(jīng)發(fā)生了遠處轉移。出現(xiàn)轉移的結腸癌患者生存期明顯縮短，雖然近年來手術、放化療等治療手段有了顯著進步，但晚期結腸癌治療效果仍然欠佳，發(fā)生遠處轉移的進展期結腸癌患者5 年生存率僅約為12%。HCT116 是1979 年BRATTAIN 等從一名男性結腸癌患者分離出的結腸癌細胞，是常用于科研的穩(wěn)定細胞系，適合結腸癌的細胞學功能研究。結腸癌的形成和發(fā)展機制是一個多步驟的過程，包括與結腸癌相關的基因或分子的變化。盡管已經(jīng)確定了一些基因、蛋白質和分子，但尚不能有效阻斷結腸癌的形成和發(fā)展，因此探索結腸癌發(fā)生轉移的內在分子機制，對于發(fā)現(xiàn)新的治療方案，提高進展期結腸癌生存率意義重大。

miRNA 是近年分子生物學研究領域里的熱點，其通過抑制靶基因的mRNA轉錄或促進其降解來抑制靶基因蛋白的生成［9］。人類包括腫瘤在內的多種疾病都存在miRNA 表達譜的改變，并且可能起著關鍵的作用［10］。miR-193b-3p 是近年發(fā)現(xiàn)的miRNA 家族成員，其定位于人染色體16p13.12，在乳腺癌［11］、卵巢癌［12］、惡性黑色素瘤［13］等多數(shù)實體腫瘤中呈低表達狀態(tài)，但在宮頸癌［14］等少部分腫瘤中表達升高，說明其在不同惡性腫瘤具有明顯的腫瘤異質性。研究發(fā)現(xiàn)，miR-193b-3p可以與腫瘤細胞對化療作用的敏感性相關［15］，并且可以與腫瘤患者的預后密切相關［16］。但目前miR-193b-3p 在結腸癌中的相關研究較少，并且作用機制尚不明確。miRNA 的不同生物學作用，主要是通過其對下游靶基因的表達的調控來實現(xiàn)的［17］。生物信息在線軟件Target Scan7.2 在線預測發(fā)現(xiàn)，PAK4 的3'UTR 區(qū)存在miR-193b-3p 的結合位點，結合功能分析預測PAK4 可能為miR-193b-3p 的靶基因，PAK4 可能為miR-193b-3p在結腸癌發(fā)生發(fā)展中作用的下游分子通路。PAK4是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前認為其作為癌基因，具有明顯的促腫瘤細胞生長及轉移的作用［6-7］。既往較多研究［18-20］已經(jīng)證實，上調PAK4表達能夠促進結腸癌細胞的生長及轉移，下調PAK4 表達能夠抑制結腸癌細胞的生長及轉移。

本研究我們通過檢測人正常結腸黏膜上皮細胞FHC 及人結腸癌細胞HCT116、SW480、LoVo 中miR-193b-3p 表達發(fā)現(xiàn)，結腸癌細胞中miR-193b-3p表達明顯低于正常結腸黏膜上皮細胞。研究中我們選擇選擇miR-193b-3p 的相對表達量最低的HCT116 進行后續(xù)研究細胞，通過脂質體轉染法轉染miR-193b-3p 模擬物至HCT116 細胞，成功過表達HCT116 細胞中miR-193b-3p 的表達水平，通過CCK8 實驗、Transwell 遷移和侵襲實驗、流式細胞術研究結果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-193b-3p 后，HCT116 細胞增殖活性、遷移及侵襲能力均明顯下降，而凋亡率明顯升高，說明miR-193b-3p 對結腸癌細胞的生長和轉移具有抑制作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，結腸癌細胞中PAK4表達明顯高于正常結腸黏膜上皮細胞。并且本研究通過雙熒光素酶報告基因證實miR-193b-3p能靶向結合PAK4的3'UTR區(qū)，RT-PCR結果也顯示過表達miR-193b-3p能夠抑制結腸癌細胞中PAK4 mRNA的表達。進一步本研究通過拯救實驗，轉染PAK4過表達載體至過表達miR-193b-3p 的HCT116 細胞，結果發(fā)現(xiàn)上調PAK4 表達能夠部分逆轉過表達miR-193b-3p 對HCT116 細胞增殖活性、遷移及侵襲能力的抑制及對凋亡的促進作用，說明miR-193b-3p對結腸癌細胞的生長和轉移的抑制作用是部分通過靶向調控PAK4 基因實現(xiàn)的，但miR-193b-3p 可能還存在其他下游分子通路參與對結腸癌細胞的生長和轉移調控。

總之，miR-193b-3p在人結腸癌各細胞系中表達降低；轉染miR-193b-3p 模擬物可抑制HCT116 細胞增殖、遷移及侵襲，并促進其凋亡，機制可能與其靶向結合PAK4的3'UTR區(qū)負向調控PAK4表達有關。