鐘春琳，沈柳宏，羅宇琴，潘禮業(yè)，宋葉，李國(guó)衛(wèi)，蘭小勇，陳向東

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528000

廣東王不留行別名薜荔果、木蓮、鬼饅頭、涼粉果等，為桑科植物薜荔Ficus pumilaL.的干燥隱頭花序托，具有祛風(fēng)利濕、活血解毒功效，用于風(fēng)濕痹痛、泄痢、淋病、跌打損傷、癰腫瘡癤。廣東王不留行在秋季采收，摘取近成熟的隱頭花序，稍燙，縱切成2～4 瓣，除去瘦果，曬干[1]。廣東王不留行主產(chǎn)于廣東、廣西，在浙江、江蘇、四川等地也有分布[2]，化學(xué)成分主要包括三萜類、黃酮及其苷類、甾體、倍半萜、香豆素[3-4]。廣東王不留行中綠原酸和蘆丁同時(shí)測(cè)定的研究已有報(bào)道[5-7]，但單指標(biāo)含量往往無(wú)法全面反映藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣。近年來(lái)，通過(guò)建立特征指紋圖譜進(jìn)行研究為中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建立的常見(jiàn)手段[8-10]。熵權(quán)法是以評(píng)價(jià)對(duì)象指標(biāo)數(shù)據(jù)的變異幅度為依據(jù)確定權(quán)重值的客觀賦權(quán)法，其基于差異驅(qū)動(dòng)原理，著重突出指標(biāo)間的局部差異，直接利用決策矩陣對(duì)所給出的評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算權(quán)重，熵權(quán)法不引入決策者的主觀判斷，可避免主觀因素對(duì)結(jié)果的影響[11]。灰度關(guān)聯(lián)分析是多種因素統(tǒng)計(jì)分析的一類方法，是以各因素的樣品數(shù)據(jù)為依據(jù)，用灰度關(guān)聯(lián)法來(lái)衡量各因素間關(guān)聯(lián)性大小[12]。因此，本研究建立廣東王不留行藥材特征圖譜，并測(cè)定不同產(chǎn)地廣東王不留行藥材中綠原酸和蘆丁，采用熵權(quán)法和灰度關(guān)聯(lián)法建立質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，以期為廣東王不留行的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

Thermo Vanqiush 型高效液相色譜儀（賽默飛公司），ME204E 萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司），XP26 百萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司），KQ500DE 數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），HWS28 型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），Mili-Q Direct 超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）。乙腈、甲酸、磷酸為色譜純，其他試劑分析純；水為超純水。

綠原酸（批號(hào) 110753-202018，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%）、蘆?。ㄅ?hào)100080-202012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.2%）對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)wkq18030107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）由維克奇生物科技有限公司提供；隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)DST210427-035，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.24%）由成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司提供。

收集的13 批不同來(lái)源的廣東王不留行藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為?？浦参镛道驠icus pumilaL.的干燥隱頭花序托。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表Table 1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC 特征圖譜的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成各含50 μg/mL 的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取廣東王不留行藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Waters HSS T3 柱（100 mm×2.1mm，1.8 μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，4%→6% A；5～10 min，6% A；10～14 min，6%→11% A；14～16 min，11%→18% A；16～22 min，18% A；22～26 min，18%→75% A；26～30 min，75%→95% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL；柱溫為30 ℃。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取同一份廣東王不留行供試品溶液（編號(hào)G1），連續(xù)進(jìn)樣6 次，以7 號(hào)峰綠原酸為參照峰，分別計(jì)算得8 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值為0.05%～0.54%，相對(duì)峰面積RSD 值為0.50%～2.85%。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批廣東王不留行藥材（編號(hào)G1），平行制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣，以7 號(hào)峰綠原酸為參照峰，分別計(jì)算得8 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值為0.03%～0.72%，相對(duì)峰面積RSD 值為0.16%～1.90%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份廣東王不留行供試品溶液（編號(hào)G1），分別在室溫下放置0、2、5、7、9、12 h 進(jìn)行測(cè)定，以7 號(hào)峰綠原酸為參照峰，分別計(jì)算得8 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值為0.04%～0.87%，相對(duì)峰面積RSD 值為0.26%～3.98%，表明樣品在室溫放置12 h 穩(wěn)定。

2.1.7 共有峰的標(biāo)定 取13 批廣東王不留行樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（國(guó)家藥典委員會(huì)，2012.0 版）進(jìn)行分析，確定8 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1。

圖1 廣東王不留行藥材的UPLC 特征圖譜Fig.1 UPLC characteristic chromatograms of Fici Pumilae Receptaculum

根據(jù)對(duì)照品指認(rèn)，確定了廣東王不留行特征圖譜中峰4、7、8 分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸。見(jiàn)圖2。

圖2 混合對(duì)照品（A）和廣東王不留行（B）UPLC 圖譜Fig.2 UPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and Fici Pumilae Receptaculum (B)

2.1.8 相似度評(píng)價(jià) 采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.0 版本）分別對(duì)G1～G13 共13 批廣東王不留行藥材樣品UPLC 特征圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用平均數(shù)，時(shí)間窗口為0.1，自動(dòng)匹配，以廣東王不留行共有模式作為對(duì)照特征圖譜，計(jì)算相似度系數(shù)。13 批藥材相似度均在0.98 以上，表明同一藥材不同批次間的化學(xué)成分組成基本一致，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 廣東王不留行藥材的相似度Table 2 Similarity data of Fici Pumilae Receptaculum

2.2 綠原酸、蘆丁的HPLC 法測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 取綠原酸、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成含綠原酸50 μg/mL、蘆丁10 μg/mL 的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取廣東王不留行藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，1%醋酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～16 min，32% A；16～18 min，32%→40% A；18～20 min，40%→45%A；20～35 min，45% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm；進(jìn)樣量為10 μL；體積流量0.8 mL/min；柱溫為25 ℃。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取含綠原酸1 269.5 μg/mL、蘆丁292.79 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置5 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣分析。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度與峰面積擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝25 155X－19 875，r＝0.999 7；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝15 541X－4 935.5，r＝0.999 9，綠原酸、蘆丁分別在25.39～253.90、5.86～58.56 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，結(jié)果綠原酸、蘆丁峰面積RSD 值分別為0.58%、0.54%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批廣東王不留行樣品（編號(hào)G1），平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸、蘆丁峰面積的RSD 值分別為0.70%、0.46%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一廣東王不留行供試品溶液（編號(hào)G1），室溫放置0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，結(jié)果綠原酸、蘆丁峰面積RSD 值為1.44%、0.80%，表明供試品溶液室溫放置24 h 穩(wěn)定。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 分別稱取綠原酸、蘆丁對(duì)照品22.480、3.581 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇溶液制成含綠原酸2.16 mg/mL、蘆丁0.33 mg/mL的加樣回收母液。精密吸取上述母液1 mL 于具塞錐形瓶中，平行操作6 份，揮干溶劑。分別取廣東王不留行藥材（編號(hào)G1）粉末約0.5 g 置于上述6個(gè)錐形瓶中，精密稱定，制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果綠原酸、蘆丁的平均加樣回收率分別為103.03%、107.71%，RSD 值分別為1.15%、1.40%。

2.2.9 測(cè)定結(jié)果 分別取13 批不同產(chǎn)地廣東王不留行藥材粉末約1 g，精密稱定，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖3，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中綠原酸和蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 混合對(duì)照品（A）和廣東王不留行（B）HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and Fici Pumilae Receptaculum (B)

表3 廣東王不留行中綠原酸、蘆丁的測(cè)定結(jié)果（n＝2）Table 3 Determination of chlorogenic acid and rutin in Fici Pumilae Receptaculum (n＝2)

2.3 熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重ρ 值

基于13 批廣東王不留行藥材特征圖譜8 個(gè)特征峰峰面積、綠原酸和蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，組成單元序列{Xij}（i＝1、2、3……m；j＝1、2、3……n；本研究中m=13，n=10）。由于各指標(biāo)間量綱不統(tǒng)一，故對(duì)原始數(shù)據(jù)按公式Y(jié)ij＝[Xij－minXij]/[maxXiminXi]（Yij為標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)，Xij為第i個(gè)樣品第j個(gè)指標(biāo)值）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。根據(jù)信息論中信息熵的定義，計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的信息熵為E1、E2、E3……Ej，計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重Wi＝（1－Ei）/（j－ΣEi），結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 熵權(quán)法計(jì)算的廣東王不留行指標(biāo)信息熵和權(quán)重Table 4 Information entropy and weight of Fici Pumilae Receptaculum index calculated by entropy weight method

2.4 灰色關(guān)聯(lián)度法計(jì)算各指標(biāo)的相關(guān)關(guān)聯(lián)度

2.4.1 無(wú)量綱化處理 在灰色關(guān)聯(lián)度分析中，首先確定評(píng)價(jià)單元序列，設(shè)有m個(gè)樣品，每個(gè)樣品有n項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，由此組成單元序列{Xij}（i＝1、2、3……m；j＝1、2、3……n；本研究中m＝13，n=10）。在多指標(biāo)評(píng)價(jià)中因各指標(biāo)單位、量級(jí)不同，無(wú)法進(jìn)行直接評(píng)價(jià)，故需對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，計(jì)算公式為Yij＝Xij/Xj（Yij為處理后的數(shù)據(jù)，Xij為原始數(shù)據(jù)，Xj為樣品第j個(gè)指標(biāo)的平均值）。

2.4.2 關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 選擇參考序列，包括最優(yōu)參考序列（所有樣品中每一項(xiàng)指標(biāo)最大值）和最差參考序列（所有樣品中每一項(xiàng)指標(biāo)最小值），分別記為{Ysj}、{Ytj}。相對(duì)與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式為，其 中Δmin=min|Yij-Ysj|，Δmax=max|Yij-Ysj|；相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式為，其 中Δ′min=min|Yij-Ytj|，Δ′max=max|Yij-Ytj|。本實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)權(quán)重Wi，即各指標(biāo)的權(quán)重ρ 值，見(jiàn)表4。

2.4.3 關(guān)聯(lián)度即相關(guān)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)度r(s)，見(jiàn)表5；最差參考序列的關(guān)聯(lián)度r(t)=，見(jiàn)表6。最佳評(píng)價(jià)單元是相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)度r(s)最大，而相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)度r(t)最小[13]。因此將評(píng)價(jià)單元序列同時(shí)相對(duì)于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri=。根據(jù)相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri的大小對(duì)評(píng)價(jià)單元序列進(jìn)行排序，并結(jié)合熵權(quán)法結(jié)果，優(yōu)化得到優(yōu)劣評(píng)價(jià)結(jié)果，見(jiàn)表7。

表5 廣東王不留行各評(píng)價(jià)指標(biāo)相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)度Table 5 Correlation degree between evaluation indicators of Fici Pumilae Receptaculum and the optimal reference sequence

表6 廣東王不留行各評(píng)價(jià)指標(biāo)相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)度Table 6 Correlation between various evaluation indicators of Fici Pumilae Receptaculum and worst reference sequence

表7 廣東王不留行的相對(duì)關(guān)聯(lián)度排序Table 7 Relative correlation ranking of Fici Pumilae Receptaculum

3 討論

在廣東王不留行特征圖譜方法建立過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)比較流動(dòng)相不同梯度條件，選擇多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)（254、300、325 nm），用不同的磷酸濃度流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸）進(jìn)行分析，結(jié)果表明檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm、流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫系統(tǒng)時(shí)，各特征峰響應(yīng)強(qiáng)、分離度最優(yōu)。實(shí)驗(yàn)還考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇的提取效果以及超聲提取、回流的提取效果。以特征峰總峰面積、樣品質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果使用50%甲醇超聲提取40 min，各特征峰提取效果最佳。建立了UPLC 特征圖譜方法，并指認(rèn)了其中的3 個(gè)成分，分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)廣東王不留行具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫的作用[14]。綠原酸和蘆丁在抗菌抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出較好的藥理作用[15-17]。本研究測(cè)定了廣東王不留行中綠原酸和蘆丁，13 批藥材中來(lái)源廣東茂名的G5、G8 和來(lái)源廣西南寧的G10 不符合《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第三版規(guī)定廣東王不留行藥材中綠原酸和蘆丁總量不得少于0.35%，其他批次含量均符合規(guī)定。由于新綠原酸、異綠原酸含量較低，在本方法中響應(yīng)低，與綠原酸和蘆丁含量差異較大，不宜采用同法測(cè)定，故本研究?jī)H測(cè)定綠原酸和蘆丁。

為進(jìn)一步比較不同產(chǎn)地廣東王不留行藥材中成分差異，本研究依據(jù)熵權(quán)法對(duì)指標(biāo)ρ 值分別客觀賦值，廣東王不留行中峰4（新綠原酸）權(quán)重最大，說(shuō)明其對(duì)廣東王不留行的質(zhì)量影響最大，其次是峰8（隱綠原酸）和蘆丁，后續(xù)研究中建議把新綠原酸和隱綠原酸納入研究。各評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)質(zhì)量的影響根據(jù)熵權(quán)法賦值進(jìn)行區(qū)分后，建立以特征圖譜8 個(gè)特征峰峰面積、綠原酸和蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)度質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，將得到的數(shù)據(jù)通過(guò)相對(duì)關(guān)聯(lián)度進(jìn)行綜合排序，廣東王不留行的相對(duì)關(guān)聯(lián)度為0.116 2～0.810 5，說(shuō)明各產(chǎn)地的廣東王不留行的質(zhì)量存在一定的差異。根據(jù)相對(duì)關(guān)聯(lián)度排序結(jié)果，廣東肇慶產(chǎn)的廣東王不留行質(zhì)量最佳，因此該方法可用于評(píng)價(jià)廣東王不留行藥材質(zhì)量。

本研究建立廣東王不留行特征圖譜，并以特征圖譜峰面積、綠原酸和蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)建立質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，可為廣東王不留行藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突