彭于之 ，姜良竹 ，徐傳錫 ，王志強(qiáng)，孫勇兵*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330004

2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004

伊立替康是喜樹(shù)堿類(lèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶I 抑制劑[1]，用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、胰腺癌等的臨床治療。伊立替康本質(zhì)上是一種前藥，需要在羧酸酯酶作用下轉(zhuǎn)化為活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿（SN38）才能發(fā)揮療效[2]。然而，僅有2%～8%的伊立替康可轉(zhuǎn)化為活性的SN38。SN38 在多種腫瘤細(xì)胞株上表現(xiàn)出比伊立替康高10～1 000 倍的抗腫瘤活性[3-5]。直接用SN38 作為抗癌藥物無(wú)需體內(nèi)酯酶的激活，可以克服伊立替康的代謝激活缺陷。目前開(kāi)發(fā)SN38靶向給藥系統(tǒng)已成為大型制藥企業(yè)競(jìng)相開(kāi)展的重要課題。浙江海正藥業(yè)開(kāi)發(fā)的SN38 膠束制劑PEGSN38 已經(jīng)進(jìn)入了I 期臨床[6-7]；日本化藥株式會(huì)社開(kāi)發(fā)的載SN38 膠束制劑NK012 已經(jīng)進(jìn)入II 期臨床，而且被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)作為治療非小細(xì)胞肺癌的治療藥物[8-9]。SN38 脂質(zhì)體的研究也是一個(gè)熱門(mén)[10-11]。在前期研究中，本課題組以β-環(huán)糊精-聚乙二醇作為親水端，通過(guò)酯鍵將SN38 的20位羥基與β-環(huán)糊精-聚乙二醇相連，構(gòu)建了兩親性聚合物β-環(huán)糊精-聚乙二醇-7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿膠束（β-CD-PEG-SN38），該聚合物能在水性介質(zhì)中自組裝成100 nm 左右的膠束。為了更好地了解β-CDPEG-SN38 在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)行為，開(kāi)展其的藥動(dòng)學(xué)研究是非常有必要的。本研究建立了HPLC-MS/MS 法測(cè)定大鼠血漿中游離型和鍵合型SN38，考察了β-CD-PEG-SN38 膠束在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，以期為新藥開(kāi)發(fā)提供更多的支持。

1 儀器和材料

Nexera LC-40 超高效液相系統(tǒng)（配備自動(dòng)進(jìn)樣器和二元泵，日本Shimadzu 公司），API4500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex 公司），ST8R 超高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher 公司）。

SN38 原料藥[質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 99.8%，批號(hào)20221005，凱立德生物醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司]，鹽酸小檗堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.5%，批號(hào)20221021，江西本草天工科技有限公司）。甲醇、乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific 公司），甲酸（色譜級(jí)，上海麥克林公司），純凈水（自制），其余試劑均為分析純。

β-CD-PEG-SN38 膠束由江西中醫(yī)藥大學(xué)自制，HPLC 法測(cè)得SN38 的載藥量為11.2%。SD 大鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（贛）2022-0002。藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)得到江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：月旭Welch C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為水（含0.1%的甲酸溶液，A）-乙腈（含0.1%的甲酸溶液，B），梯度洗脫（洗脫程序?yàn)?～0.4 min，5% B；0.4～4.5 min，5%～80% B；4.51～6.0 min，80%～5% B）；柱溫是40 ℃；體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量是1 μL。

質(zhì)譜條件：ESI 源，正離子檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式掃描；離子通道：393.1→349.1（SN38），336.1→320.0（內(nèi)標(biāo)小檗堿）。源電壓為5 500 V，Gas1（N2）為60 psi（1 psi＝6 895 Pa），Gas2（N2）為60 psi，離子源溫度是600 ℃；Curtain gas（N2）為40 psi，CAD Gas（N2）為9 psi。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量控制（QC）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱(chēng)取SN38 對(duì)照品適量，用70%甲醇溶液制備272.0 μg/mL 儲(chǔ)備液，然后用70%甲醇溶液依次稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液，SN38 的質(zhì)量濃度分別為68.0、340.0、680.0、1 360.0、2 720.0、5 440.0、13 600.0、27 200.0、43 520.0、54 400.0 ng/mL。按照同樣的方式制備SN38 低、中、高質(zhì)量濃度（136.0、27 200.0、43 520.0 ng/mL）的QC 標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有溶液置于冰箱（4 ℃）保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱(chēng)取小檗堿對(duì)照品適量，用70%甲醇溶液制備400 μg/mL 儲(chǔ)備液，然后用70%甲醇溶液稀釋制備250 ng/mL 內(nèi)標(biāo)溶液，置于冰箱（4 ℃）保存。

2.3 血漿樣品的處理

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和QC 血漿樣品的制備 取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液和QC 工作溶液10 μL，置于具塞玻璃試管中，用氮?dú)獯蹈?，加入空白血漿200 μL，配制SN38 質(zhì)量濃度在3.4～2 720.0 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)血漿樣品，同時(shí)制備SN38 低、中、高質(zhì)量濃度分別是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血漿QC 樣品。

2.3.2 血漿樣品的制備 將40 μL 血漿樣品置于1.5 mL 離心管中，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液、20 μL 水，渦旋2 min，加入330 μL 甲醇溶液，渦旋5 min，于4 ℃、10 000 r/min 離心8 min，取上清液，即得游離型SN38 測(cè)定的血漿樣品溶液。將40 μL 血漿樣品置于1.5 mL 離心管中，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 μL，23 ℃孵育10 min，然后加入1 mol/L 鹽酸溶液10 μL，再加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液，渦旋2 min，加入330 μL 甲醇溶液，渦旋5 min，于4 ℃、10 000 r/min 離心8 min，取上清液，即得SN38 總質(zhì)量濃度（鍵合型和游離型之和）測(cè)定的血漿樣品溶液。質(zhì)量濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最高點(diǎn)的樣品用空白血漿稀釋10 倍后測(cè)定。

2.4 方法學(xué)試驗(yàn)

2.4.1 方法選擇性 取6 個(gè)不同來(lái)源的大鼠空白血漿40 μL，除不加入內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液（補(bǔ)加70%甲醇10 μL），其余按照2.3.2 項(xiàng)下方法操作，得空白血漿樣品；取含SN38 6.8 ng/mL 的低質(zhì)量濃度QC樣品40 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液，其余按照2.3.2 項(xiàng)下方法操作，得低質(zhì)量濃度QC 樣品；取受試大鼠給藥后的血漿40 μL，按照2.3.2 項(xiàng)下方法操作，得大鼠給藥樣品。取各樣品進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1?？梢钥闯鯯N38 的保留時(shí)間為3.923 min，內(nèi)標(biāo)物小檗堿的保留時(shí)間為3.805 min，血漿中的內(nèi)源性成分不干擾SN38、小檗堿的測(cè)定。

圖1 空白血漿（A）、QC 樣品（B）和大鼠給藥樣品（C）的MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of blank plasma (A),QC sample (B),and sample from rat (C)

2.4.2 線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)方程 取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)血漿樣品40 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液，按2.3.2 項(xiàng)下方法操作，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行雙樣本分析，分別以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)，以加權(quán)（y＝1/x2）最小二乘法進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得典型的線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)方程y＝4.356×10-4x＋2.43×10-4，r＝0.992 3，結(jié)果表明SN38 的血漿質(zhì)量濃度在3.4～2 720.0 ng/mL 線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精確配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血漿樣品，各5 份，按2.3.2項(xiàng)下方法操作，測(cè)定藥物質(zhì)量濃度，同一個(gè)質(zhì)量濃度樣品每隔1 h 測(cè)定1 次，共3 次，進(jìn)行日內(nèi)精密度計(jì)算；每隔1 d 測(cè)定1 次，共3 次，進(jìn)行日間精密度計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。在3 種質(zhì)量濃度下，日內(nèi)精密度小于6.5%，日間精密度小于6.3%。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 1 Results of precision test (,n=5)

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 1 Results of precision test (,n=5)

分別配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 血漿樣品，各5 份，按2.3.2 項(xiàng)下方法操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算質(zhì)量濃度和準(zhǔn)確度，見(jiàn)表2。根據(jù)藥物臨床前藥動(dòng)學(xué)指導(dǎo)原則，準(zhǔn)確度應(yīng)在85%～115%，RSD 值應(yīng)小于15%，3 種質(zhì)量濃度下準(zhǔn)確度均符合要求。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

2.4.4 方法提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制SN38 質(zhì)量濃度分別是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的QC 血漿樣品。取血漿樣品40 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液，其余按2.3.2 項(xiàng)下方法操作，測(cè)得峰面積A1；另取空白血漿40 μL，先經(jīng)甲醇沉淀后，加入QC 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，制備未經(jīng)提取的QC 樣品，測(cè)得峰面積A2；取混合后的QC 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10 μL，除以水代替空白基質(zhì)外，其余按2.3.2 項(xiàng)下操作，制備無(wú)基質(zhì)的QC 樣品，測(cè)得峰面積A3。以提取后的樣品峰面積A1除以未經(jīng)提取的樣品峰面積A2計(jì)算待測(cè)物SN38 和內(nèi)標(biāo)小檗堿的回收率。以未經(jīng)提取的樣品峰面積A2除以無(wú)基質(zhì)樣品峰面積A3分別計(jì)算待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3。SN38 的提取回收率在88.5%～95.7%，基質(zhì)效應(yīng)在96.4%～103.2%。內(nèi)標(biāo)小檗堿的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別是92.1%、98.3%。

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制SN38 質(zhì)量濃度分別是6.8、2 176.0 ng/mL 的血漿樣品，考察樣品室溫放置2 h、3 個(gè)凍融循環(huán)（-20～23 ℃）、4 ℃放置24 h、長(zhǎng)期放置30 d（-20 ℃）的穩(wěn)定性，以及處理后的樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 4 Result of stability (,n=5)

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（,n=5）Table 4 Result of stability (,n=5)

2.5 藥動(dòng)學(xué)研究

取SD 大鼠12 只，實(shí)驗(yàn)前禁食給水過(guò)夜，隨機(jī)分成2 組。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 膠束溶液，劑量以SN38 計(jì)為6 mg/kg，給藥后觀察大鼠的腹瀉情況，同時(shí)用乙醚麻醉大鼠，在5、15、30、45 min 以及1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48 h 眼眶取血0.2 mL。在4 ℃、2 000 r/min 條件下離心10 min，分離血漿，并于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

將同一份血漿分為兩份，各40 μL，按照2.3.2項(xiàng)下方法處理，其中1 份用來(lái)測(cè)定血漿中游離型的SN38 質(zhì)量濃度，另1 份用來(lái)測(cè)定血漿中SN38 總質(zhì)量濃度（鍵合型和游離型之和），其中血漿中SN38的總質(zhì)量濃度減去游離型的SN38 質(zhì)量濃度就是鍵合型的SN38 質(zhì)量濃度。

利用Das 軟件計(jì)算β-CD-PEG-SN38 膠束溶液中SN38 的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用Das 軟件處理藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，三室模型能最佳的進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)的擬合。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 膠束溶液后，游離型SN38 和鍵合型SN38 的AUC 分別是1 490.7、5 060.3 ng/(mL·h)，在大鼠血漿中占主導(dǎo)的是鍵合型的SN38。

表5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（）Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

表5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（）Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

圖2 大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)（,n=6）Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of SN38 in rats (,n=6)

3 討論

本研究建立了測(cè)定血漿中SN38 質(zhì)量濃度的HPLC-MS/MS 方法，通過(guò)堿性水解的方法將鍵合型的SN38 從β-CD-PEG-SN38 膠束上斷裂出來(lái)，血漿中SN38 的總質(zhì)量濃度減去游離型的SN38 質(zhì)量濃度就是鍵合型SN38 的質(zhì)量濃度。利用沉淀蛋白法處理樣品，操作簡(jiǎn)單；方法的基質(zhì)效應(yīng)很低，適合高通量的藥物測(cè)定。

聚合物膠束制備工藝簡(jiǎn)單，膠束能以一個(gè)完整的形式達(dá)到腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性。兩親性聚合物膠束的藥動(dòng)學(xué)研究是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題。從本研究結(jié)果可以看出，鍵合型SN38 質(zhì)量濃度顯著高于游離SN38 的質(zhì)量濃度，說(shuō)明膠束在血漿中具有較好的穩(wěn)定性，SN38 會(huì)更多地以膠束的形式靶向腫瘤部位。鍵合型SN38 的表觀分布容積大，說(shuō)明膠束在組織中尤其是腫瘤組織中分布較多[7]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突