楊銳鋒，亓智瑋，劉聰毅，王寧，黃泳欣，李雯婧，吳麗麗，秦靈靈，劉銅華*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 102488

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 科技處，北京 100029

糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，是指排除其他病因的情況下，患者出現(xiàn)肢體麻木、疼痛或其他異常感覺等周圍神經(jīng)功能障礙相關(guān)癥狀的疾病[1]。糖尿病周圍神經(jīng)病變診斷主要依靠糖尿病病史篩查、臨床癥狀和體征及神經(jīng)電生理檢查，患者通常會出現(xiàn)四肢對稱性疼痛，尤其是遠(yuǎn)端疼痛，最典型表現(xiàn)為手套樣、襪套樣的感覺[2-3]。糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病率較高，據(jù)研究顯示糖尿病患者患病5、10、20 年后，發(fā)病率分別達(dá)到30%、60%、90%[4]。糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，可能與糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)亢進(jìn)、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、凋亡與自噬等相關(guān)[5]，病理改變主要表現(xiàn)為神經(jīng)脫髓鞘或軸索變性[6]。目前臨床治療多使用營養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化應(yīng)激、醛糖還原酶抑制劑、改善微循環(huán)藥物等療法，雖然取得了一定的療效，但存在不良反應(yīng)較明顯且易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)[7-8]。糖尿病周圍神經(jīng)病變是導(dǎo)致下肢截肢和神經(jīng)性疼痛殘疾的主要原因，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，仍需新的干預(yù)方法[9]。

根據(jù)糖尿病周圍神經(jīng)病變的癥狀和體征，中醫(yī)學(xué)理論將其歸屬于“消渴病痹證”。糖脈康顆粒是治療糖尿病并發(fā)癥常用中成藥，由葛根、丹參、赤芍、黃芪、生地黃、熟地黃、牛膝、桑葉、黃連、黃精、淫羊藿11 味藥組成，具有補(bǔ)氣活血、化瘀通痹的功效。糖脈康顆粒在《中醫(yī)臨床診療指南（2016 年版）》中被推薦為治療糖尿病周圍神經(jīng)病變氣虛血瘀證藥物（弱推薦，Ⅱa 級）[10]，并且有系統(tǒng)評價(jià)與Meta分析表明，糖脈康顆粒能提高臨床有效率、改善周圍神經(jīng)癥狀、提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度和改善血糖水平，且不增加不良反應(yīng)發(fā)生率，有較好的應(yīng)用前景[11]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)能預(yù)測藥物治療疾病作用機(jī)制的方法，通過已研究出的大量生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的生物網(wǎng)絡(luò)，分析三者之間可能的關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)已成為中藥作用機(jī)制研究的重要方法，能提供新的藥物研發(fā)策略，推動(dòng)中藥復(fù)方的深入研究[12-13]。糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變應(yīng)用前景較好，但其藥理學(xué)作用仍有待研究。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究糖脈康顆?；钚曰衔锛爸委熖悄虿≈車窠?jīng)病變的分子機(jī)制和特征靶點(diǎn)，為后續(xù)動(dòng)物和細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡釋藥理學(xué)作用提供預(yù)測參考分析，以期為臨床合理用藥決策提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索糖脈康顆粒組成藥物葛根、丹參、赤芍、黃芪、熟地黃、牛膝、桑葉、黃連、黃精、淫羊藿的有效化學(xué)成分，并進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，采用PubMed、CNKI 數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)文獻(xiàn)，對TCMSP 數(shù)據(jù)庫未收錄的藥物生地黃的活性成分和其他藥物未收錄或未通過藥動(dòng)學(xué)篩選但有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的成分進(jìn)行收集。

1.2 共同靶點(diǎn)預(yù)測

在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索預(yù)測活性成分獲取Canonical SMILES式，然后在SwissTargetPrediction 平臺進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，剔除無對應(yīng)靶標(biāo)信息或預(yù)測靶標(biāo)Probilitity＜0.1。以“Diabetic peripheral neuropathy”為檢索詞檢索Genecards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd）和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（/https://www.disgenet.org/）的糖尿病周圍神經(jīng)病變疾病相關(guān)靶點(diǎn)，Genecards 數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)采用Score中位數(shù)值限制。采用微生信平臺（https://www.bioinformatics.com.cn）對靶點(diǎn)信息進(jìn)行映射，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)可視化

采用Cytoscape 軟件（v3.7.2）對關(guān)鍵化學(xué)成分與疾病的共同靶點(diǎn)的相互關(guān)聯(lián)信息進(jìn)行圖像可視化處理，對節(jié)點(diǎn)的度值（degree）、接近中心性和中介中心性進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。節(jié)點(diǎn)表示活性成分和靶點(diǎn)，邊表示節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系。degree 表示一個(gè)節(jié)點(diǎn)和其他節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)，與其他節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)連接越多，代表該節(jié)點(diǎn)重要性越高。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

將藥物和疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），生物體種類選擇“Homo sapiens”，設(shè)置隱藏網(wǎng)絡(luò)中的離散點(diǎn)，調(diào)整最低要求交互得分參數(shù)，導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，對靶點(diǎn)的degree進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

1.5 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

采用R 軟件（v4.2.1）及Bioconductor 程序包對藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）和KEGG 信號通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05 為顯著相關(guān)，物種為“Homo sapiens”，并繪制相應(yīng)柱狀圖和氣泡圖。

1.6 分子對接

在RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)中按degree 值排序的前5 個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，設(shè)置來源生物為Homo sapiens，解構(gòu)方法為X-RAY DIFFRACTION，優(yōu)先選擇分辨率高[至少＜3 ?（1 ?=0.1 nm）]、有三維結(jié)構(gòu)、有蛋白與配體的復(fù)合物。下載蛋白質(zhì)3D 結(jié)構(gòu)pdb 格式文件，導(dǎo)入PyMOL 軟件（v2.5）進(jìn)行去除水分子、分離原始配體，在AutoDock Vina 軟件（v1.1.2）加氫、計(jì)算電荷，保存為pdbqt 格式。在TCMSP 和PubChem數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵活性成分的mol2 格式文件，加氫、計(jì)算電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為pdbqt 格式。設(shè)定原配體位置為活性口袋中心，對接盒子大小設(shè)置40×40×40（相鄰格點(diǎn)間距為0.375 ?），將活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白在AutoDock Vina 軟件（v1.1.2）中進(jìn)行分子對接[14]，以分子對接結(jié)合能評估兩者的結(jié)合關(guān)系。分子對接過程中其結(jié)合能的絕對值越高，代表受體與配體的親和力越好，本研究選取結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol（1 cal=4.2 J）作為關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)有效結(jié)合的篩選依據(jù)[15]。

2 結(jié)果

2.1 糖脈康顆?；钚曰瘜W(xué)成分

檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫糖脈康顆粒包含藥物，其中OB≥30%和DL≥0.18的活性成分葛根含有4個(gè)，丹參含有65 個(gè)，赤芍含有29 個(gè)，黃芪含有20 個(gè)，熟地黃含有2 個(gè)，牛膝含有20 個(gè)，桑葉含有29 個(gè)，黃連含有14 個(gè)，黃精含有12 個(gè)，淫羊藿含有23 個(gè)。經(jīng)檢索文獻(xiàn)補(bǔ)充葛根1 個(gè)成分葛根素[16]，丹參1 個(gè)成分丹酚酸B[17-18]，黃芪1 個(gè)成分黃芪甲苷Ⅳ[19]，生地黃5 個(gè)成分梓醇、毛蕊花糖苷、水蘇糖、地黃苷D、密力特苷[20-22]。共同活性成分和文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充成分情況見表1。

表1 糖脈康顆粒的部分活性成分Table 1 Part of active ingredients of Tangmaikang Granules

2.2 糖脈康顆粒和糖尿病周圍神經(jīng)病變共同靶點(diǎn)

搜索 PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取活性成分的Canonical SMILES 式，在Swiss Target Prediction 平臺進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，剔除無對應(yīng)靶標(biāo)或靶標(biāo)Probilitity＜0.1。其中β-谷甾醇、谷甾醇和γ-谷甾醇，赤芍中的芍藥苷和paeoniflorin 檢索得到的結(jié)構(gòu)一致，只保留其中一個(gè)成分，最終共剩下137 個(gè)活性成分，經(jīng)去重后共得糖脈康顆粒作用靶點(diǎn)992 個(gè)。糖尿病周圍神經(jīng)病變疾病相關(guān)靶點(diǎn)檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫經(jīng)限制后共得到1 701 個(gè)，OMIM 數(shù)據(jù)庫共得到501 個(gè)，DisGeNET 數(shù)據(jù)庫共得到129 個(gè)，TTD 數(shù)據(jù)庫共得到2 個(gè)，合并去重共得糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)靶點(diǎn)2 115 個(gè)。在微生信平臺對藥物疾病靶點(diǎn)取交集繪制韋恩圖，共獲得糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的133 個(gè)可能活性成分的331 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 糖脈康顆粒和糖尿病周圍神經(jīng)病變共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Tangmaikang Granules and DPN common target Venn diagram

2.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)可視化

采用Cytoscape 軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共有477 個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 326 條邊。進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)參數(shù)拓?fù)浞治?，degree 平均值為13.945，接近中心性平均值為0.415，中介中心性平均值為0.003，保留degree 大于平均值以上的節(jié)點(diǎn)，設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小與其degree 呈正比。生地黃成分作用靶點(diǎn)按degree 平均值篩選時(shí)被剔除，葛根、熟地黃經(jīng)篩選后剩下成分與其他藥物相同故未單獨(dú)列出。8 個(gè)菱形節(jié)點(diǎn)表示糖脈康顆粒組成藥物，72 個(gè)V 型節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，中間12 個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)表示藥物共同包含的成分，黃精包含5 個(gè)獨(dú)有活性成分，赤芍包含4 個(gè)獨(dú)有活性成分，牛膝包含3 個(gè)獨(dú)有活性成分，黃芪包含10 個(gè)獨(dú)有活性成分，黃連包含4 個(gè)獨(dú)有活性成分，丹參包含24 個(gè)獨(dú)有活性成分，桑葉包含10 個(gè)獨(dú)有活性成分，淫羊藿包含6 個(gè)獨(dú)有活性成分。乙酰膽堿酯酶（ACHE，degree＝57）在靶點(diǎn)中degree 最高，提示可能為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。degree 排名前3 位的活性成分為來自牛膝和黃連的巴馬?。╠egree＝84），來自黃連和淫羊藿的廣玉蘭內(nèi)酯（degree＝58），來自桑葉的11,14,17-三烯酸甲酯（degree＝52），這些成分可能在糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見圖2。

圖2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of drug-active ingredient-target-disease

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因

將331 個(gè)藥物和疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫以獲取蛋白相互作用關(guān)系，隱藏游離節(jié)點(diǎn)并設(shè)置最低要求交互得分設(shè)置為0.990后導(dǎo)出關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。將蛋白相互作用關(guān)系tsv 格式數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件并進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，得到的網(wǎng)絡(luò)圖含有158 個(gè)節(jié)點(diǎn)，304 條邊，degree 平均值為3.85，中位數(shù)為2，其中節(jié)點(diǎn)表示靶標(biāo)蛋白，每條邊表示蛋白之間的作用關(guān)系。degree 排名前5 位的靶點(diǎn)分別為細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53，degree＝27）、連環(huán)蛋白β-1（CTNNB1，degree=25 ）、熱休克蛋白90-α（HSP90AA1，degree＝25）、磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基α（PIK3R1，degree＝19）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3，degree＝19），表明這些靶點(diǎn)可能在糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變中具有重要作用，見圖3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因篩選圖Fig.3 PPI network key gene screening map

2.5 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集柱狀圖柱狀長度表示富集到此通路的基因數(shù)目，結(jié)果顯示BP 顯著相關(guān)3 396 條，包括細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、對營養(yǎng)素水平的反應(yīng)（response to nutrient levels）和肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）等；CC 顯著相關(guān)172 條，包括膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）和膜區(qū)（membrane region）等；MF 顯著相關(guān)318 條，包含蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、細(xì)胞表面受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity ）和細(xì)胞表面受體蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）等，見圖4。KEGG 富集共獲得199 條信號通路，氣泡大小表示富集到此通路的基因數(shù)目，取富集程度P值前10 位的通路。糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白主要富集的通路包括糖尿病并發(fā)癥中的高糖基化終產(chǎn)物-高糖基化終產(chǎn)物受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、前列腺癌（prostate cancer）、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）和癌癥的中樞碳代謝（central carbon metabolism in cancer）等，見圖5。

圖4 GO 功能富集分析柱狀圖Fig.4 GO functional enrichment analysis bar graph

圖5 KEGG 富集分析氣泡圖Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis bubble graph

2.6 分子對接

選取關(guān)鍵活性成分巴馬汀、廣玉蘭內(nèi)酯、11,14,17-三烯酸甲酯和經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的葛根素、丹酚酸B、黃芪甲苷Ⅳ、梓醇，分別和PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值前5 位的核心靶點(diǎn)TP53、CTNNB1、HSP90AA1、PIK3R1、STAT3 通過AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接模擬計(jì)算，分子對接結(jié)果見圖6?；钚猿煞峙c核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果顯示糖脈康顆粒中關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol，表明關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)可能具有較好的結(jié)合活性。選取各靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能較低的對接結(jié)果通過PyMOL 軟件進(jìn)行可視化，TP53 的VAL-147 與葛根素形成氫鍵，CTNNB1 的ASN-206、THR-205 與梓醇形成氫鍵，HSP90AA1 的LYS-112、SER-52、ASP-93、ASN-51 與丹酚酸B 形成氫鍵，PIK3R1 的TYR-813與巴馬汀形成氫鍵，STAT3 的SER-636、GLU-638與黃芪甲苷Ⅳ形成氫鍵，見圖7。

圖6 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)合能Fig.6 Binding energy of molecular docking of key active components and core targets

圖7 活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果Fig.7 Molecular docking results of key active components and core targets

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)學(xué)本無具體病名，因其為糖尿病常見并發(fā)癥，又以疼痛、麻木或異常感覺為主要癥狀，2010 年國家中醫(yī)藥管理局頒布的《22 個(gè)專業(yè)95 個(gè)病種中醫(yī)診療方案》中將本病中醫(yī)病名正式確定為“消渴病痹證”[23]。糖尿病周圍神經(jīng)病變病因病機(jī)復(fù)雜，多本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜。以771 名糖尿病周圍神經(jīng)病變患者為樣本的數(shù)據(jù)挖掘文獻(xiàn)顯示，糖尿病周圍神經(jīng)病變本虛以氣虛、陰虛為主，標(biāo)實(shí)以血瘀為主，常見證候依次為氣陰兩虛血瘀、氣陰兩虛、濕熱淤阻、濕濁淤阻等，氣虛和血瘀在糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展過程扮演重要角色，補(bǔ)氣活血為糖尿病周圍神經(jīng)病變最基本的治療方法[24]。數(shù)據(jù)庫醫(yī)案文獻(xiàn)分析也證實(shí)血瘀、氣虛、陰虛最為常見證素，氣陰兩虛、瘀阻經(jīng)絡(luò)為主要證型[25]。糖脈康顆粒組方來源于《丹溪心法·消渴方》、《景岳全書·玉女煎》和《金匱要略·腎氣丸》，廣泛應(yīng)用于臨床治療糖尿病及其并發(fā)癥。糖脈康顆粒含藥血清自由基清除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該藥具有體外抗氧化作用[26]。系統(tǒng)評價(jià)表明糖脈康顆粒在提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度且安全性較好[27-28]，而目前尚未見糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制研究，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在重要靶點(diǎn)和作用通路。

網(wǎng)絡(luò)藥理分析顯示糖脈康顆粒中所含的133 個(gè)可能活性成分中巴馬汀、廣玉蘭內(nèi)酯、11,14,17-三烯酸甲酯在與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中具有較高的中心性。巴馬汀為黃連、牛膝含有的生物堿，可以降低db/db 小鼠的空腹血糖和血脂含量并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[29]。鏈脲佐菌素糖尿病模型大鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巴馬汀能抑制伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 和鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，可能激活了抗氧化蛋白，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧類和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[30]。廣玉蘭內(nèi)酯存在于黃連和淫羊藿，計(jì)算機(jī)虛擬分子對接結(jié)果與α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，有通過抑制該酶活性延緩腸道碳水化合物吸收，從而調(diào)整血糖水平、治療糖尿病的潛力[31]。11,14,17-三烯酸甲酯存在于桑葉，目前相關(guān)文獻(xiàn)較少，后續(xù)可開展相關(guān)研究以驗(yàn)證其有效性。葛根素為葛根提取單體，目前已廣泛應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥的臨床治療。體外實(shí)驗(yàn)表明，丹酚酸B 可下調(diào)可能通過抑制絲裂原活化蛋白激酶p38 激活的炎癥和細(xì)胞凋亡來治療糖尿病周圍神經(jīng)病變[32]。黃芪甲苷Ⅳ通過上調(diào)miR-155 表達(dá)來抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的活化，增強(qiáng)細(xì)胞自噬以減輕由施旺細(xì)胞凋亡引起的糖尿病周圍神經(jīng)病變的髓鞘損傷[18]。梓醇是從地黃提取的抗氧化劑，已被證明具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡和抗纖維化的特性，從而對糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生有益的作用[33]。

篩選出331 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)的degree 最高為ACHE，PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree 排名前3 位的靶點(diǎn)蛋白為TP53、CTNNB1、HSP90AA1。ACHE 通過快速水解釋放到突觸裂縫的乙酰膽堿來終止信號轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)肌肉接點(diǎn)，在神經(jīng)元凋亡中有重要作用。TP53 根據(jù)生理環(huán)境和細(xì)胞類型誘導(dǎo)生長停滯或凋亡，抑制腫瘤的形成。TP53 基因多態(tài)性與糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)病有關(guān)，并且2 型糖尿病患者血清TP53 水平顯著升高可能反映慢性高血糖所引致的新陳代謝及氧化應(yīng)激[34-35]。CTNNB1 是Wnt 信號通路的主要下游成分，在中醫(yī)辨證為腎虛證糖尿病組中熒光定量PCR 檢測CTNNB1 的表達(dá)水平與非腎虛證糖尿病組相比較有表達(dá)上調(diào)的趨勢，但差異不顯著[36]。HSP90AA1 可促進(jìn)特定靶蛋白的成熟、結(jié)構(gòu)維持和適當(dāng)調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞周期控制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。血糖波動(dòng)近年來被認(rèn)為是糖尿病并發(fā)癥和治療靶點(diǎn)的促進(jìn)因素，有研究運(yùn)用基因優(yōu)先級分析發(fā)現(xiàn)了HSP90AA1可能是與血糖波動(dòng)相關(guān)的新的候選基因[37]。

GO 分析顯示，糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶基因涉及細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對營養(yǎng)素水平的反應(yīng)和肽基酪氨酸磷酸化等生物過程，膜筏、膜微域和膜區(qū)等細(xì)胞組成，蛋白酪氨酸激酶活性、細(xì)胞表面受體蛋白酪氨酸激酶活性、細(xì)胞表面受體蛋白激酶活性等分子功能。KEGG 富集分析所涉及的通路有糖尿病并發(fā)癥中的高糖基化終產(chǎn)物-高糖基化終產(chǎn)物受體信號通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化和前列腺癌等。AGEs 來源主要為外源性的食物和煙草及內(nèi)源性體內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基部分與還原糖的羰基的代謝產(chǎn)物，RAGE 主要負(fù)責(zé)與配體結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘發(fā)相關(guān)基因上調(diào)[38]。AGE-RAGE 信號通路可被血液中過高的葡萄糖與循環(huán)中大分子物質(zhì)激活，使AGEs 在細(xì)胞內(nèi)外廣泛積聚，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和基底膜增厚，導(dǎo)致血管和神經(jīng)病變的發(fā)生[39]。顯著富集的信號通路中也存在著部分調(diào)控其他疾病的通路，例如脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等信號通路。人體是一個(gè)有機(jī)整體，機(jī)體代謝相互關(guān)聯(lián)，糖脈康顆?？赡芡ㄟ^作用于多種信號通路發(fā)揮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用。分子對接結(jié)果顯示，糖脈康顆粒中4 個(gè)關(guān)鍵活性成分與3 個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，說明網(wǎng)絡(luò)藥理分析預(yù)測的成分可能與靶點(diǎn)結(jié)合較好。

綜上所述，糖脈康顆?？赏ㄟ^巴馬汀、廣玉蘭內(nèi)酯、11,14,17-三烯酸甲酯等多種有效成分，作用于TP53、CTNNB1、HSP90AA1 等位點(diǎn)起到抗氧化應(yīng)激等作用，進(jìn)而治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用。但是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析選擇不同數(shù)據(jù)庫和方法學(xué)結(jié)果可能有差異，并且存在中藥材的用藥部位、有效成分篩選標(biāo)準(zhǔn)等問題導(dǎo)致預(yù)測成分多為槲皮素等黃酮類化合物的現(xiàn)象。本次分析中葛根素等成分經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證但均未通過藥動(dòng)學(xué)篩選并且預(yù)測靶點(diǎn)數(shù)目較少，這使得網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析結(jié)果可信度應(yīng)謹(jǐn)慎看待[40]。本研究僅基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接初步探究糖脈康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的可能作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，但其具體機(jī)制仍需深入探討，后續(xù)仍需在細(xì)胞和動(dòng)物水平更進(jìn)一步闡明驗(yàn)證糖脈康顆粒在治療糖尿病周圍神經(jīng)病變方面的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突