李舒婷，袁 凱，李 華，周衛(wèi)強，唐 堂，楊小凡，劉海軍，李方亮，李 凡，李 義，彭 超*

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 100029；3.中糧生化能源（榆樹）有限公司，吉林 長春 130400；4.吉林中糧生化有限公司，吉林 長春 130033）

全球每年85%的廢棄塑料最終被填埋或傾倒到海洋中，塑料[1]、微塑料[2]及其所含有害物質(zhì)會逐漸出現(xiàn)在食物[3]、飲用水和空氣中[4]。聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一類在微生物體內(nèi)合成的由羥基脂肪酸單體通過酯化聚合得到的生物塑料[5]，可以作為生態(tài)友好型生物塑料替代石油優(yōu)質(zhì)材料[6]。研究者構(gòu)建微生物細胞工廠，優(yōu)化底盤菌株的工作效率[7]，使PHA的合成效率得到大大提升[8]。目前篩選出耐高鹽、高滲透壓的嗜鹽單胞菌，直接避免無菌操作，極大降低PHA發(fā)酵成本及復(fù)雜性[5]，研究發(fā)現(xiàn)中度嗜鹽單胞菌（Salinivibriosp.）TGB10發(fā)酵獲得的PHA達27.36 g/L[9]。鹵單胞菌（Halomonassp.）YLGW01菌株發(fā)酵合成的PHA高達細胞干質(zhì)量的95.26%[10]，是目前嗜鹽單胞菌（Halomonassp.）產(chǎn)PHA最高的菌種。但菌株生產(chǎn)PHA效率低、制備成本高的問題限制著PHA的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用[11]。

PHA的廣泛應(yīng)用受限于其較高的生產(chǎn)成本，有研究表示生產(chǎn)PHA過程中碳源成本占30%～50%[11]，而糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，主要含有大量可發(fā)酵糖（主要是蔗糖），是很好的發(fā)酵原料，具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[12]，在食品、醫(yī)療[13]、化工[14]和微生物發(fā)酵[15]行業(yè)具有廣闊研究前景，已有研究人員從甘蔗中分離出甘蔗糖蜜和具有生產(chǎn)儲存能力的陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），分批發(fā)酵得到PHA最大產(chǎn)量為4.13～4.98 g/L[16]。

目前PHA生產(chǎn)過程中以蔗糖、淀粉、玉米油等生產(chǎn)PHA存在與人爭糧的問題，故采用價格低廉的糖蜜為碳源物質(zhì)制備PHA的研究十分必要。本研究以鹽單胞菌（Halomonossp.）TD01為發(fā)酵菌株，基于非糧糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)PHA，分析OD600nm值、細胞干質(zhì)量、PHA含量，并以PHA產(chǎn)量為評價指標(biāo)，通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化PHA發(fā)酵培養(yǎng)基，并在千噸級中試生產(chǎn)線驗證，為促進非糧生物基材料生產(chǎn)，優(yōu)化生產(chǎn)強度具有較強的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及原料

鹽單胞菌（Halomonossp.）TD01：清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；糖蜜：中糧糖業(yè)遼寧有限公司；玉米漿粉（含氮量6.2%）：山東振華生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）：英國OXOID公司；氯化鈉、硫酸鎂、尿素、硫酸銨、濃硫酸、苯甲酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水甲醇、三氯甲烷（均為色譜純）：美國Honeywell公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[17]

LB瓊脂培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g，蛋白質(zhì)1.0 g，氯化鈉6.0 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水100 mL，pH調(diào)至8.0，在121 ℃滅菌15 min后倒平板。

LB種子搖瓶培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉60 g，蒸餾水1 L，pH調(diào)至8.0；一級種子搖瓶為100 mL錐形瓶分裝20 mL培養(yǎng)基；二級搖瓶為2 L錐形瓶分裝300 mL培養(yǎng)基，在121 ℃滅菌15 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿粉16.00 g/L，硫酸鎂0.21 g/L，尿素2.00g/L，磷酸鹽10.00g/L，糖蜜23.6g/L，氯化鈉50.00 g/L，蒸餾水900 mL，pH調(diào)至8.5。

補料培養(yǎng)基①：硫酸鎂0.03 g，尿素2.00 g，磷酸鹽0.97 g，玉米漿粉8.33 g，糖蜜73.48 g，蒸餾水15 mL。

1 L發(fā)酵體系補料培養(yǎng)基②：尿素1.50 g，玉米漿粉1.94 g，糖蜜73.48 g。

1 L發(fā)酵體系補料培養(yǎng)基③：硫酸銨0.84 g，糖蜜104.98 g。1 L發(fā)酵體系補料培養(yǎng)基④：糖蜜156.86 g。

2 L和5 kL發(fā)酵培養(yǎng)基以及補料培養(yǎng)基按照裝液量等比例放大即可。

酯化液：無水甲醇970.00 mL，濃硫酸30.00 mL，苯甲酸1.00 g。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOSTAT B發(fā)酵罐：德國Sartorius公司；FD8-6型凍干機：瑞士METTLER TOLEDO公司；6B-56型智能消解儀：上海銳析儀器設(shè)備有限公司；7890B型氣相色譜（gas chromatography，GC）檢測儀、Agilent HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司；UV-1750 分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及種子液的制備

將保藏于-80℃甘油管的菌株TD01解凍，在LB瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，后取平板上單菌落至一級種子進行搖床培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)條件為37 ℃、200 r/min。取3 mL一級種子液于二級種子搖瓶中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)及中試放大

1 L和2 L發(fā)酵罐的初始裝液量為發(fā)酵罐體積的50%，接種量為初始裝液量的10%。5 kL發(fā)酵罐的初始裝液量為發(fā)酵體積的60%，接種量為初始裝液量的10%。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，當(dāng)發(fā)酵條件達到37 ℃、pH 8.5、轉(zhuǎn)速達到500 r/min、通氣量1 L3/min時開始接種。當(dāng)溶氧低于20%時開始提高轉(zhuǎn)速以保證溶氧能夠維持在20%，直至最高轉(zhuǎn)速1 000 r/min。于8 h開始補料①，調(diào)整補料流速為1.5 mL/min，當(dāng)前一補料結(jié)束后接入下一次補料直至OD600nm值連續(xù)8 h下降，發(fā)酵時間控制在52 h內(nèi)。

1.3.3 聚羥基脂肪酸酯的制備

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液以8 000 r/min離心15 min，倒出上清液，加水重懸洗滌10 min后，再次以8 000 r/min離心15 min，棄去上清并冷凍后置于真空冷凍干燥機中-80 ℃干燥48 h即可得到PHA粗品。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

（1）單因素試驗

不同糖蜜添加量的確定：以菌株生長狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量為評價指標(biāo)，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基質(zhì)，分別設(shè)置糖蜜添加量為6 g/L、12 g/L、24 g/L、48 g/L、96 g/L，初始pH值為8.5，每組兩個平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h后取樣分析。

總氮添加量的確定：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿粉為氮源，以菌株生長狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量為評價指標(biāo)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中總氮添加量。玉米漿粉添加量分別為8 g/L、16 g/L、24 g/L、32 g/L、40 g/L、48 g/L，初始pH值為8.5，每組兩個平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后取樣分析。

最佳氮源的確定：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基質(zhì)，按照總氮添加量一致原則，按總氮添加量為1.98 g/L，分別以玉米漿粉、酵母粉、玉米漿、尿素和硫酸銨作為氮源，以菌株生長狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量為評價指標(biāo)，初始pH值為8.5，每組兩個平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后取樣分析。

尿素和硫酸銨配比的確定：在總氮保持1.98 g/L不變情況下，分別考察尿素和硫酸銨的配比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3對菌株生長狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量的影響，對照組氮源為玉米漿粉。初始pH值為8.5，每組兩個平行，在裝液量為100 mL/500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后取樣分析。

（2）響應(yīng)面試驗

根據(jù)Box-Behnken的試驗設(shè)計原理，由單因素試驗結(jié)果選擇糖蜜添加量（A）、尿素添加量（B）、硫酸銨添加量（C）為自變量，以PHA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation medium formula optimization

1.3.5 優(yōu)化發(fā)酵罐發(fā)酵工藝與中試驗證

將優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)果等比例放大應(yīng)用到1 L發(fā)酵罐中裝液量為500 mL，接種量10%進行發(fā)酵，于8 h左右接補料，當(dāng)前一補料結(jié)束后接入下一補料。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果進行優(yōu)化并將調(diào)整后發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)用于5 kL中試發(fā)酵罐進行驗證。

1.3.6 分析檢測

菌株生長狀況（OD600nm值）的測定：取一定體積的發(fā)酵樣品，在波長為600 nm條件下測定吸光度值，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為樣品OD600nm值。

菌體干質(zhì)量的測定：從發(fā)酵8 h開始每4 h留取發(fā)酵樣品35 mL，直至發(fā)酵結(jié)束，將樣品以8 000 r/min離心15 min，倒出上清液，加水重懸洗滌10 min后，再次以8 000 r/min離心15 min，棄去上清并冷凍后置于真空冷凍干燥機中48 h，待樣品完全干燥后稱取干質(zhì)量。菌體干質(zhì)量計算公式如下：

式中：M為菌體干質(zhì)量，g/L；m2為凍干后樣品質(zhì)量，g；m1，50 mL離心管質(zhì)量，g；35為樣品的體積，mL；1 000為換算系數(shù)。

PHA含量的測定采用氣相色譜法[18]：將凍干樣品碾碎后，稱取35 mg于酯化管，每管加2 mL三氯甲烷溶液、2 mL酯化液于酯化管中后置于金屬浴中100 ℃加熱反應(yīng)4 h，將酯化管取出降至常溫，每管加入1 mL去離子水，振蕩15 min后靜置分層，取下層液過膜，進行氣相色譜檢測。氣相色譜條件：Agilent HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；壓力69.22 kPa；載氣為高純氮氣（N2）；流動相流速2 mL/min；柱箱溫度開啟時80 ℃，維持時間3 min，空氣流量400 mL/min；氫氣流量30mL/min；柱箱溫度350℃；尾吹氣流量25mL/min；加熱器溫度250 ℃；總流量65 mL/min；分流比30∶1；分流流量60 mL/min。

定性定量方法：根據(jù)PHA標(biāo)準品與PHA樣品在相同色譜及分析條件下的色譜峰的保留時間進行定性。以PHA標(biāo)準品的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）作為縱坐標(biāo)，PHA標(biāo)準品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制PHA標(biāo)準曲線，得到標(biāo)準曲線回歸方程為y=0.160 2x-0.357 3，按照回歸方程計算樣品中PHA含量。PHA產(chǎn)量=細胞干質(zhì)量×PHA含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，響應(yīng)面試驗設(shè)計采用Design Expert 13.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同糖蜜添加量對發(fā)酵的影響

由圖1可知，當(dāng)糖蜜添加量在6～24 g/L范圍內(nèi)增加，OD600nm值、PHA產(chǎn)量隨糖蜜添加量升高而增加；當(dāng)糖蜜添加量為24 g/L時，菌體OD600nm值、PHA產(chǎn)量達到最高，分別為32.2、2.25 g/L；當(dāng)糖蜜添加量為24～96 g/L時，菌體OD600nm值、PHA產(chǎn)量有所下降。說明糖蜜的添加可以維持菌體正常生長的營養(yǎng)水平，但糖蜜添加量過多，會導(dǎo)致培養(yǎng)基體系滲透壓增大，從而抑制菌體生長[19]。因此，最適糖蜜添加量為24 g/L。

圖1 不同糖蜜添加量對菌體生長和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of different molasses addition on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

2.1.2 總氮添加量對發(fā)酵的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿粉為氮源，考察總氮添加量對菌株生長狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)玉米漿粉在8～32 g/L范圍時，OD600nm值呈階梯狀遞增是因為低碳氮比更有利于菌體生物量的提高[20]，PHA產(chǎn)量隨之增加；玉米漿粉添加量為16 g/L時OD600nm值為34，高于玉米漿粉添加量為8 g/L和24 g/L，說明此時培養(yǎng)基能夠維持菌體量的高效生成，但不利于產(chǎn)物的積累，PHA產(chǎn)量較低為1.83 g/L。當(dāng)玉米漿粉添加量為32 g/L時，PHA產(chǎn)量為2.27 g/L，且OD600nm值較高為33.45；當(dāng)玉米漿粉添加量在32～48 g/L時，OD600nm值、PHA產(chǎn)量有所降低，原因是過高的碳氮比會因滲透壓作用抑制菌體的生長代謝，同時導(dǎo)致PHA合成受阻[21]，因此，最適玉米漿粉添加量為32 g/L，即最適總氮添加量為1.98 g/L。

圖2 玉米漿粉添加量對菌體生長和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of corn steep powder addition on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

2.1.3 不同氮源對發(fā)酵的影響

按等氮原則研究不同氮源（玉米漿粉、酵母粉、玉米漿、尿素和硫酸銨）對菌株生長狀況（OD600nm值）和PHA產(chǎn)量的影響，其中總氮含量為1.98 g/L，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對菌體生長和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of different nitrogen sources on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

由圖3可知，酵母粉、玉米漿、尿素和硫酸銨的PHA產(chǎn)量較高，分別為2.19 g/L、2.07 g/L、2.67 g/L、2.23 g/L，比玉米漿粉組高出25.97%、19.07%、53.58%、28.27%，且酵母粉、玉米漿和尿素3種有機氮源作用下菌體生長較好，說明其更能促進菌體的生長。推測是因為無機氮源更能促進嗜鹽單胞菌TD01合成PHA，可能是因為無機氮源可以被菌體直接利用[22]，前期能夠加速促進生物量的積累，后期氮源不足時，有足夠時間將所吸收的碳源轉(zhuǎn)變成聚酯產(chǎn)物[23]，推測有機氮源和無機氮源結(jié)合更有利于發(fā)酵。綜合PHA產(chǎn)量判斷氮源效果：尿素＞硫酸銨＞酵母粉＞玉米漿粉＞玉米漿。因此，故選擇尿素、硫酸銨為最適氮源。

2.1.4 不同尿素和硫酸銨配比對發(fā)酵的影響

按總氮含量為1.98 g/L研究不同尿素和硫酸銨配比對發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)尿素和硫酸銨組合時，OD600nm值和PHA產(chǎn)量較對照組均得到有效提高，說明該組合能夠有效促進菌體量積累的同時也能促進次級代謝產(chǎn)物合成，可能是無機氮源硫酸銨的引入提供了前期菌體生長時可直接利用氮源需求。隨著硫酸銨比例的降低，OD600nm值和PHA產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)尿素和硫酸銨氮原子添加量為1∶1時OD600nm值和PHA產(chǎn)量均達到最高，分別為34.15和2.48 g/L，比對照組高出29.36%和42.82%，說明有機氮源與無機氮源的等比例添加即尿素和硫酸銨添加量分別為2.00 g/L和4.44 g/L時更有利于PHA的產(chǎn)出。

圖4 不同尿素與硫酸銨配比對菌體生長和聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of different ratios of urea and ammonium sulfate on bacterial growth and polyhydroxyalkanoate yield

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果及方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以糖蜜添加量（A）、尿素添加量（B）、硫酸銨添加量（C）為自變量，PHA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，進行Box-Benhken響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，Box-Benhken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Benhken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhken experiments for fermentation medium optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次回歸方程擬合，得到二次多項回歸方程如下：

Y=2.57+0.578 4A-0.0129B-0.209 7C+0.093 2AB-0.368 8AC+0.031 4BC-0.609 0A2-0.034 7B2-0.051 9C2

由表3中的P值可知，該回歸方程P＜0.000 1，說明該模型極顯著；失擬項P=0.058 9＞0.05，說明失擬項不顯著，方程回歸模型擬合真實水平，選擇合理。F值為44.75、決定系數(shù)R2=0.982 9、調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.961 0，說明該回歸模型擬合程度較好，能用于本試驗預(yù)測分析。該模型的精密度為21.6920＞4，進一步說明模型合理。由P值可知，一次項A、C與二次項A2以及交互項AC對PHA產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01），一次項B、交互項AB、BC以及二次項B2、C2對PHA產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，影響PHA產(chǎn)量的因素順序為A（糖蜜添加量）＞C（硫酸銨添加量）＞B（尿素添加量）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，得到了各個影響因素的交互作用對PHA產(chǎn)量的響應(yīng)面及等高線見圖5。響應(yīng)面坡度越陡，其等高線越接近橢圓，說明這兩個因素交互作用對結(jié)果影響越顯著，反之，若響應(yīng)面坡度越小等高線越接近圓形，則表示兩個因素交互作用對結(jié)果影響不顯著。

圖5 尿素添加量、糖蜜添加量、硫酸銨添加量交互作用對聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of urea addition,molasses addition and ammonium sulfate addition on polyhydroxyalkanoate yield

由圖5（a）可知，PHA產(chǎn)量隨糖蜜和尿素添加量增高而增大，二者交互作用對結(jié)果影響響應(yīng)面坡度較緩，表明這兩個因素對結(jié)果影響不顯著。由圖5（b）可知，PHA產(chǎn)量隨硫酸銨和糖蜜添加量增高而增大，二者交互作用對結(jié)果影響響應(yīng)面坡度較陡，等高線呈橢圓形，表明這兩個因素對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由圖5（c）可知，PHA產(chǎn)量隨硫酸銨和尿素添加量增高而增大，二者交互作用對結(jié)果影響響應(yīng)面坡度平緩，表明這兩個因素對結(jié)果影響不顯著。這與表3方差分析結(jié)果一致。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果的驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化預(yù)測，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為糖蜜添加量33.191 g/L、尿素添加量2.467 g/L、硫酸銨添加量2.22 g/L。在該優(yōu)化條件下PHA產(chǎn)量的預(yù)測值為3.107 g/L。為了便于實際操作，將發(fā)酵培養(yǎng)基配方修正為糖蜜添加量33.2 g/L、尿素添加量2.5 g/L、硫酸銨添加量2.2 g/L。在此優(yōu)化條件下進行3次搖瓶平行驗證試驗，得到PHA平均產(chǎn)量實際值為（3.12±1.19）g/L，與響應(yīng)面預(yù)測值比較相對誤差為0.418%，證明該模型合理可行。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果發(fā)酵罐發(fā)酵工藝與中試放大

因反應(yīng)器的發(fā)酵混合傳質(zhì)和供氧能力，需進一步驗證比較1 L發(fā)酵罐采用優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵效果。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，將上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于1 L發(fā)酵罐，發(fā)酵過程中菌體生長及聚羥基脂肪酸酯的變化情況見圖6。

圖6 優(yōu)化前（a）、后（b）1L生物反應(yīng)器下菌體生長及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化Fig. 6 Changes of microbial growth and polyhydroxyalkanoate yield in 1 L bioreactor before (a) and after (b) optimization

由圖6a可知，發(fā)酵44 h時，其最高OD600nm值、細胞干質(zhì)量、PHA含量、PHA產(chǎn)量分別為184、55.20 g/L、50.40%、27.82g/L。由圖6b可知，發(fā)酵52h時，其最高細胞干質(zhì)量82g/L、PHA含量68.79%，總產(chǎn)量56.41 g/L。較優(yōu)化前PHA產(chǎn)量提高了90.32%。優(yōu)化前后對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵16 h前PHA含量幾乎相同，細胞干質(zhì)量于發(fā)酵16 h時相差16.4 g/L，可能是無機氮更易于被菌體吸收，有助于生物量的積累。優(yōu)化后細胞干質(zhì)量在24 h后幾乎停滯增長，推測菌體代謝過快，補料不足以維持其正常代謝導(dǎo)致營養(yǎng)不均衡，菌體開始利用所吸收的碳源合成PHA[20]。

根據(jù)發(fā)酵20～32 h的發(fā)酵情況加倍糖氮添加量，得到補料優(yōu)化后2 L生物反應(yīng)器下發(fā)酵過程中菌體生長及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化情況見圖7。通過2 L生物反應(yīng)器放大反應(yīng)，于發(fā)酵48 h得到菌體干質(zhì)量92.5 g/L、PHA含量72.82%，總PHA產(chǎn)量達到67.36 g/L，較優(yōu)化前PHA產(chǎn)量增長了142.13%。發(fā)酵20 h后，細胞干質(zhì)量與PHA含量有明顯增長，證明上述推測20 h因缺營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致菌體生長停滯結(jié)論正確[24]。加倍糖氮補料后營養(yǎng)物質(zhì)充足，有利于生物量的增長使菌體干質(zhì)量持續(xù)上漲的同時不利于胞內(nèi)PHA的積累致使PHA含量于37 h后保持平穩(wěn)[25]，但PHA含量仍然比未加倍糖氮補料時高出5.86%，PHA產(chǎn)量高出19.41%?？赡苁且驗榈闯渥阌欣诰w的生長繁殖，當(dāng)菌體大量積累時，即使氮添加量充足也會積累少量PHA[25-26]。證明過高或過低的糖氮添加量都會抑制發(fā)酵的進行[27-28]，也許有機氮源被吸收慢能保持培養(yǎng)基中持續(xù)含氮更有利于生物量增長[29]，無機氮源更有利于PHA含量的積累[30]。

圖7 補料優(yōu)化后2 L生物反應(yīng)器下菌體生長及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化Fig. 7 Changes of microbial growth and polyhydroxyalkanoate yield in 2 L bioreactor after feeding optimization

為驗證優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于工業(yè)化規(guī)模的可行性，進行鹽單胞菌（Halomonossp.）TD01的5 kL中試驗證實驗，發(fā)酵過程監(jiān)測曲線見圖8，發(fā)酵過程中菌體生長及聚羥基脂肪酸酯的變化情況見圖9。由圖8和圖9可知，在發(fā)酵溫度和速度保持穩(wěn)定狀態(tài)下，發(fā)酵22 h加堿量保持平穩(wěn)，發(fā)酵10～16.5 h時耗糖量不斷增大，菌體正在進行大量積累。發(fā)酵22.5 h切換補料后pH和溶氧迅速上漲且從發(fā)酵22.5～28.0 h內(nèi)OD600nm值保持平穩(wěn)，28.0 h加大糖氮補料補充后pH和溶氧穩(wěn)定到正常范圍，且細胞干質(zhì)量、PHA含量長勢趨于平緩，證明氮源供應(yīng)量不足以菌體消耗所致，發(fā)酵22.5～28 h營養(yǎng)缺乏在一定程度上抑制菌體活力，此時PHA含量生長較為平緩。發(fā)酵42.5 h開始OD600nm值保持平穩(wěn)但仍在消耗糖和堿，推測是PHA仍在積累，并于50.5 h發(fā)酵結(jié)束，OD600nm值為250，細胞干質(zhì)量為81.67 g/L，PHA含量為62.65%，總PHA產(chǎn)量為51.16 g/L。結(jié)果表明，5 kL中試發(fā)酵試驗得到發(fā)酵50.5 h時總PHA產(chǎn)量為51.16 g/L，較起始發(fā)酵PHA產(chǎn)量高83.90%。

圖8 中試放大發(fā)酵過程監(jiān)測曲線Fig. 8 Monitoring curves of pilot scale-up fermentation process

圖9 5 kL中試放大試驗菌體生長及聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)量的變化Fig. 9 Changes of microbial growth and polyhydroxyalkanoate yield in 5 kL bioreactor pilot test

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為糖蜜添加量33.2 g/L、尿素添加量2.5 g/L、硫酸銨添加量2.2 g/L。在此優(yōu)化條件下，PHA產(chǎn)量為3.12 g/L。采用2 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵對補料培養(yǎng)基進行優(yōu)化并控制補料后進行發(fā)酵試驗得到總產(chǎn)量達到67.36 g/L，較優(yōu)化前產(chǎn)量增長了142.13%。5 kL中試放大發(fā)酵試驗得到發(fā)酵50.5 h總PHA產(chǎn)量為51.16 g/L，較起始發(fā)酵PHA產(chǎn)量高83.90%。結(jié)果表明，該工藝優(yōu)化可以大幅度提升PHA產(chǎn)量，可直接應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)。該工藝優(yōu)化結(jié)果有效提升了PHA產(chǎn)量，優(yōu)化生產(chǎn)強度，大幅降低單位產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠條件。