余 嬌 黃學(xué)寬 王 輝

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400041；2.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院肺病科，重慶 400700

咳嗽（cough）是最常見(jiàn)的呼吸道癥狀，由于氣管、支氣管黏膜或胸膜受到炎癥、異物、物理或化學(xué)刺激等引起，同時(shí)也是氣管支氣管系統(tǒng)獨(dú)立性疾病、支氣管擴(kuò)張癥或間質(zhì)性肺疾病等的常見(jiàn)癥狀[1]。郁火咳嗽方是重慶市名老中醫(yī)王輝教授以小柴胡和四逆散為基礎(chǔ)，去人參、大棗，加五味子、苦杏仁、細(xì)辛、桃仁、牡丹皮、烏梅、防風(fēng)創(chuàng)制的。主治咳嗽劇烈、咳甚胸痛嘔吐、口干口苦、急躁易怒等。有藥理實(shí)驗(yàn)表明[2]，小柴胡湯作為一種傳統(tǒng)中藥湯劑，由111個(gè)活性成分組成，作用于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、有絲分裂原激活蛋白激酶（recombinant mitogen activated protein kinase，MAPK）14在內(nèi)的55個(gè)靶點(diǎn)，用于治療肺炎。其中p38（MAPK14）信號(hào)通路可以觸發(fā)樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）產(chǎn)生炎癥因子，從而通過(guò)調(diào)節(jié)核因子激活的核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）/MAPK信號(hào)通路來(lái)減輕肺組織的炎癥[3]。在咳嗽患者中，觀察到白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4和干擾素（interferon，IFN）-γ水平高于正常人。IFN-γ主要由T輔助細(xì)胞（T helper cell，Th）1細(xì)胞分泌，而IL-4參與白細(xì)胞的浸潤(rùn)和募集，加劇了氣道阻塞和炎癥反應(yīng)。另一方面，在四逆散中發(fā)現(xiàn)白芍的提取物能夠促進(jìn)IL-4的合成與釋放[4]，同時(shí)抑制IL-1β和TNF-α水平，從而顯示出抗炎的作用。臨床研究證實(shí)，小柴胡湯和四逆散在治療感冒后咳嗽、咳嗽變異型哮喘、支氣管哮喘和胃食管返流咳嗽等有著顯著效果[5-6]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)郁火咳嗽方治療咳嗽的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，為該方治療咳嗽等呼吸系統(tǒng)疾病做進(jìn)一步研究與臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 郁火咳嗽方活性成分及作用靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）分別對(duì)郁火咳嗽方的各味藥（黃芩、半夏、白芍、北五味子、柴胡、防風(fēng)、甘草、苦杏仁、牡丹皮、生姜、桃仁、烏梅、細(xì)辛、枳實(shí)）進(jìn)行檢索。以生物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行檢索得到的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，收集符合以上條件的化合物，使用TargetNet、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入其有效成分SMILE結(jié)構(gòu)式，篩選預(yù)測(cè)分值（Prob）＞0.9的結(jié)果，保存UniprotID、Protein、Prob信息為EXCEL格式。

1.2 郁火咳嗽方治療咳嗽潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“cough”為關(guān)鍵詞在Drughbank、GeneCards、PharmGkb、Therapeutic Target Database （TTD）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與咳嗽相關(guān)的靶點(diǎn)。利用genedenovo （https://www.genedenovo.com/）對(duì)郁火咳嗽方的有效成分作用靶點(diǎn)和咳嗽相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到郁火咳嗽方治療咳嗽的潛在靶點(diǎn)。

1.3 預(yù)測(cè)郁火咳嗽方治療咳嗽的關(guān)鍵活性成分

利用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-有效成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫接艋鹂人苑街委熆人缘年P(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將郁火咳嗽方的有效成分作用靶點(diǎn)與咳嗽相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)輸入STRING 11.0（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種來(lái)源“Homo sapie”，勾選“hide disconnected nodes in the network”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，去除游離節(jié)點(diǎn)后導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選出郁火咳嗽方治療咳嗽的核心靶點(diǎn)蛋白。

1.5 基因富集分析

將靶點(diǎn)信息導(dǎo)到DAVID（htpps://David.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能、京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路的富集分析。

2 結(jié)果

2.1 郁火咳嗽方的有效成分和作用靶點(diǎn)

在TCMSP中檢索得到黃芩、半夏、白芍、北五味子、柴胡、防風(fēng)、甘草、苦杏仁、牡丹皮、生姜、桃仁、烏梅、細(xì)辛、枳實(shí)的活性成分分別為33、11、8、8、11、16、86、18、5、4、12、8、7、20種，其中共有成分20種。除去重復(fù)的后得到了205種活性成分，共同作用的靶點(diǎn)有200個(gè)。見(jiàn)表1。

2.2 確定交集靶點(diǎn)

從Drughbank、GeneCards、PharmGkb、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出與咳嗽的相關(guān)靶點(diǎn)有1798個(gè)，與郁火咳嗽方的有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，交集靶點(diǎn)得到了172個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)圖

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape軟件繪制郁火咳嗽方的有效成分及其作用靶點(diǎn)間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），205種類藥成分全部參與，圖形大小及明暗程度代表其作用強(qiáng)度，其中作用強(qiáng)度前3位的有效成分分別為山奈酚、剛烯酸、甘草查爾酮B，這些有效成分可能是郁火咳嗽方治療咳嗽的關(guān)鍵化合物。

圖2 中藥-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0平臺(tái)，設(shè)定最小互相作用閾值為“highest confidence”＞0.9，得到79個(gè)節(jié)點(diǎn)、470條邊、平均節(jié)點(diǎn)度為11.9的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。Degree值較大的基因有細(xì)胞色素P4503A4酶（cytochrome P4503A4，CYP3A4）、組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、核受體視黃醇X受體α（reconmbinant retinoid X receptor α，RXRA）等，說(shuō)明這些靶點(diǎn)有極大可能是郁火咳嗽方治療咳嗽的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 郁火咳嗽方治療咳嗽的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 郁火咳嗽方治療咳嗽基因和功能分析

將郁火咳嗽方治療咳嗽的關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)DAVID分析平臺(tái)進(jìn)行GO和KEGG分析。GO富集分析包括生物過(guò)程（biological processes，BP）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）、分子功能（molecular functions，MF），見(jiàn)圖4～6。Count代表靶點(diǎn)數(shù)量，Count越大代表富集的結(jié)果越相關(guān)。

圖4 關(guān)鍵基因BP分析

2.5.1 基因BP分析 對(duì)郁火咳嗽方關(guān)鍵基因可能涉及的BP進(jìn)行分析，從圖4可知，這些關(guān)鍵基因涉及各個(gè)BP，其中Count值較前的有有機(jī)物質(zhì)代謝過(guò)程、對(duì)化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、生物質(zhì)量調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)等，這些BP可能在咳嗽中起著至關(guān)重要的作用，表明郁火咳嗽方的潛在干預(yù)機(jī)制。

2.5.2 基因CC分析 通過(guò)對(duì)關(guān)鍵基因涉及CC的分析，本研究可以推測(cè)出郁火咳嗽方干預(yù)咳嗽在細(xì)胞內(nèi)的具體作用機(jī)制。從圖5可知，關(guān)鍵基因CC分析排前五位的有細(xì)胞器、膜界細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜束縛細(xì)胞器，有關(guān)這類關(guān)鍵細(xì)胞器的研究，對(duì)于研究郁火咳嗽方治療咳嗽作用機(jī)制起到了輔助作用。

圖5 關(guān)鍵基因CC分析

2.5.3 基因MF分析 在機(jī)制研究過(guò)程中，對(duì)于MF的研究尤為重要，因此本研究對(duì)關(guān)鍵基因的MF進(jìn)行了富集分析。從圖6可知，Count值排前五位的為離子結(jié)合、有機(jī)環(huán)狀化合物、雜環(huán)化合物結(jié)合、催化活性、陽(yáng)離子結(jié)合，這些分子可能是郁火咳嗽方發(fā)揮作用的形式。

圖6 關(guān)鍵基因MF分析

2.5.4 KEGG分析 本研究對(duì)關(guān)鍵基因信號(hào)通路進(jìn)行富集分析，得到169條相關(guān)通路，從圖7可以看出，代謝通路（Metabolic pathways）在關(guān)鍵信號(hào)通路富集分析中比較靠前，同時(shí)也與癌癥通路（Pathways in cancer）相關(guān)性較強(qiáng)，說(shuō)明郁火咳嗽方極大可能是治療腫瘤的潛在藥物。在信號(hào)通路富集分析中，發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)、酒精、亞油酸代謝、阿爾茨海默病等通路在研究咳嗽機(jī)制中具有重要意義。

圖7 前二十位關(guān)鍵通路

3 討論

本研究對(duì)郁火咳嗽方藥物有效成分進(jìn)行篩選，將其有效成分的潛在靶點(diǎn)與咳嗽相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，以得到交集靶點(diǎn)，利用生物信息學(xué)分析，確定關(guān)鍵基因靶點(diǎn)及其通路，并構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。從中藥-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)推測(cè)出主要活性成分，如山奈酚（kaempferol）、剛烯酸（gondoic acid）、甘草查爾酮B（Licochalcone B）、槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）。LI等[7]研究表明，山奈酚可以調(diào)節(jié)佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）誘導(dǎo)的核因子κB抑制因子α（NF-kappa-B inhibitor alpha，IκBα）降解和NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位來(lái)抑制氣道黏蛋白基因表達(dá)和產(chǎn)生的能力。槲皮素作為一種活性氧清除劑，可減少肺部炎癥、杯狀細(xì)胞增多、促炎細(xì)胞因子的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）表達(dá)和粘液素5AC，有潛力治療慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等肺部疾病[8]。β-谷甾醇是一種中藥成分，其抑制中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8、人生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因α（growth-related oncogene-α，GRO-α）和人生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因β（growth-related oncogene-β，GRO-β）的表達(dá)，控制囊性纖維化患者肺部炎癥的過(guò)度發(fā)生[9]。上述中藥成分具有多靶點(diǎn)、多條通路協(xié)同作用，對(duì)于治療咳嗽具有重要的作用。

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)及其互作網(wǎng)絡(luò)的分析表明，CYP3A4、HDAC、ESR1、RXRA、RELA等蛋白處于前排。郁火咳嗽方的主要成分是黃酮類化合物，它能夠抑制CYP3A4的活性，可以調(diào)節(jié)人肝臟藥物代謝酶的活性[10-11]。抑制CYP3A4對(duì)于增強(qiáng)藥物治療效果、逆轉(zhuǎn)抗腫瘤藥物的耐藥性等方面是至關(guān)重要的[12-14]。肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子被關(guān)鍵分子HADC所抑制[15]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，HDAC有助于維持Th1/Th2平衡，減少Th2細(xì)胞免疫的過(guò)度表達(dá)，防止Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生，并改善氣道炎癥。雌激素受體（estrogen receptor，ER）α參與NF-κB轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，從而限制炎癥反應(yīng)的程度[16]，既往研究表明，ER激活后通過(guò)環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate-pretein kinase A，cAMPPKA）信號(hào)通路降低氣道平滑肌中的鈣離子濃度，最終導(dǎo)致氣道平滑肌的放松[17]。上述諸多基因都可能成為治療咳嗽的核心基因，為咳嗽的治療提供臨床價(jià)值。

對(duì)咳嗽疾病及其以咳嗽為主要癥狀的關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，通路主要與代謝途徑、腫瘤和炎癥反應(yīng)等相關(guān)。其中最典型代表的是IL-17、瞬間受體電位（transient receptor potential，TRP）、高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物-受體（advanced glycation end product-receptor，AGERAGE）等信號(hào)通路。如IL-17信號(hào)通路與其受體結(jié)合時(shí)，它通過(guò)MAPK途徑和核轉(zhuǎn)錄因子B途徑引發(fā)促炎細(xì)胞因子的作用[18]。為減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或肺部炎癥，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）通過(guò)降低信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（recombinant signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路的活性來(lái)限制IL-17信號(hào)通路的傳遞，這對(duì)于治療肺部疾病至關(guān)重要[18]。TRP通路家族成員中，包括辣椒素受體1（transient receptor potential V1，TRPV1）、瞬間受體電位離子通道（transient receptor potential A1，TRPA1）、冷刺激瞬時(shí)電位受體第8亞型（transient receptor potential M8，TRPM8），已被證實(shí)可以介導(dǎo)和調(diào)節(jié)咳嗽。在支氣管C纖維表達(dá)中，TRPM8和TRPA1可能是關(guān)鍵離子通道，是通過(guò)激活頸靜脈傳入纖維引起的咳嗽[19]。此外，有研究表明，TRPV1在肺傳入神經(jīng)中的表達(dá)和功能上調(diào)是慢性咳嗽、哮喘以及各種肺部炎癥的共同特征，這種上調(diào)導(dǎo)致TRPV1通道對(duì)刺激的敏感性增加，進(jìn)而導(dǎo)致咳嗽、疼痛、癢、呼吸困難和神經(jīng)源性炎癥等癥狀的出現(xiàn)[20]。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)郁火咳嗽方中所有中藥進(jìn)行化合物的分析，以確定其主要成分，研究數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，其主要成分是黃酮類化合物，它已被證實(shí)有可能影響與炎癥有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。通過(guò)預(yù)測(cè)這些化合物的生物活性、靶點(diǎn)來(lái)探討治療咳嗽的作用機(jī)制。證實(shí)了中藥復(fù)方郁火咳嗽方能有效地針對(duì)促炎因子信號(hào)通路來(lái)治療咳嗽，與此同時(shí)，抗炎癥因子在一定程度上可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。因此，可以進(jìn)一步探討這些化合物抑制炎癥細(xì)胞表達(dá)的能力。雖然，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)存在部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)不全等局限性，但是它可以幫助挖掘中藥的潛在藥效和新藥物，為新藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路，對(duì)中醫(yī)發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。