黎晶晶 黃增瓊

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院 貴港市人民醫(yī)院兒童診療中心綜合辦公室，廣西貴港 537100；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021

一直以來(lái)，普遍、反復(fù)發(fā)作卻無(wú)法徹底治愈的炎癥嚴(yán)重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量，臨床常用非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素類藥物對(duì)癥治療，藥效明顯但副作用較多，因此開(kāi)發(fā)安全、高效的天然藥物顯得尤為重要。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者深入研究了各類植物黃酮，發(fā)現(xiàn)從山蠟梅葉、香椿葉中提取的黃酮類化合物均有抗炎鎮(zhèn)痛作用[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，植物黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種藥理活性[3-4]，且毒性較低，對(duì)炎癥的治療和預(yù)防具有重要意義[5]。

羅漢松為羅漢松科植物，廣西地區(qū)常見(jiàn)[6]。羅漢松實(shí)為羅漢松和短葉羅漢松的種子及花托[7]，但藥用部位主要為種子[8]。羅漢松實(shí)所含成分主要包括黃酮類、萜類等化合物，劉欣宇等[9]從羅漢松實(shí)中可提取到4.66%的總黃酮，說(shuō)明羅漢松種子總黃酮含量豐富，具有重要藥用價(jià)值，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)羅漢松種子總黃酮的抗炎作用研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)建立角叉菜膠致小鼠足腫脹、二甲苯致小鼠耳腫脹、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠致炎三種急性致炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討羅漢松種子總黃酮在小鼠體內(nèi)的抗炎作用及部分作用機(jī)制，為后續(xù)羅漢松種子的藥用價(jià)值研究提供參考。

1 材料

1.1 試劑及藥品

試劑：羅漢松種子（采自廣西北海鑫意園羅漢松種植基地，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李瓊講師鑒定）；二甲苯（分析純，批號(hào)：20211025，天津奧普升化工有限公司）；LPS（來(lái)源大腸桿菌055：B5，批號(hào)：22012183，南寧市辛佰生物試劑經(jīng)營(yíng)部）；0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMCNa）和吐溫80溶液；酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京誠(chéng)林生物科技有限公司）。

藥品：阿司匹林腸溶片（規(guī)格：100 mg×36片/盒，生產(chǎn)批號(hào)：21150803，沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司）。

1.2 儀器及材料

JY1002型電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；DFY-200A型萬(wàn)能粉碎機(jī)（無(wú)錫久平儀器有限公司）；Gary3500型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫）；BSA224S型萬(wàn)分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；YLS-25A型電動(dòng)耳腫打耳器（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；TDZ4-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)離心機(jī)儀器有限公司）；HH-2型電熱恒溫水浴鍋（京科偉永興儀器有限公司）；SynergyH1型多功能酶標(biāo)儀（南寧市精密儀器儀表有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取體重為18～22 g的SPF級(jí)昆明小鼠180只，雌雄各半，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2020-0003，使用許可證號(hào)：SYXK桂2020-0004，購(gòu)買后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，用于實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 羅漢松種子總黃酮提取物的制備和給藥劑量的確定

2.1.1 羅漢松種子總黃酮提取物的制備 經(jīng)鑒定后的羅漢松種子，粉碎后用乙醇回流法提?。ㄌ崛」に嚄l件：65%乙醇、料液比1∶14、提取40 min、提取3次）羅漢松種子總黃酮，得提取物干粉末，通過(guò)液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)確定提取物主要含黃酮類化合物，再用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總黃酮含量為71.77%。

2.1.2 給藥劑量的確定 羅漢松種子總黃酮提取率：0.86%；KA為人的公斤體重系數(shù)，KA=0.11；KB為小鼠公斤體重系數(shù)，KB=1。

人的用量DA=20 g×14.42%×5.94%/70 kg=2.45 mg/kg。

小鼠公斤體重劑量DB=DA×（KB/KA）=2.45×（1/0.11）=22.27 mg/kg。

為了增強(qiáng)小鼠體內(nèi)效果，確定羅漢松種子總黃酮低劑量組為60 mg/kg、高劑量組為180 mg/kg。提取物用0.5% CMC-Na和吐溫80配置成羅漢松種子總黃酮60、180 mg/kg的藥液，用于灌胃。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（0.5%CMC-Na和吐溫80）和阿司匹林組（阿司匹林200 mg/kg）[10]。

2.2 角叉菜膠致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)

取小鼠40只，雌雄各半，按“2.1.2”項(xiàng)隨機(jī)分為4組，每組各10只，分別灌胃給藥，給藥1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，在小鼠右后肢足跖皮下注射0.1 ml角叉菜膠致炎，左足不注射作為正常對(duì)照。致炎1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，從小鼠膝關(guān)節(jié)處剪下左右兩足，用萬(wàn)分之一分析天平稱重。右足與左足的重量差為腫脹度，計(jì)算小鼠足腫脹抑制率。

足腫脹抑制率=（空白對(duì)照組平均足腫脹度-給藥組平均足腫脹度）/空白對(duì)照組平均足腫脹度×100%。

2.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

取小鼠50只，雌雄各半，按“2.1.2”項(xiàng)和模型組（生理鹽水組）隨機(jī)分成5組，每組各10只，分別灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，在小鼠右耳雙面均勻涂抹0.02 ml二甲苯致炎，左耳不涂抹作為正常對(duì)照。致炎3 h后，自小鼠眼眶取血，收集于離心管中，置于3000 r/min離心機(jī)離心30 min后分離血清，用ELISA法測(cè)定血清中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）含量。取血后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用6 mm打孔器于小鼠左右耳對(duì)稱處打下耳片，用萬(wàn)分之一分析天平稱重。小鼠右耳與左耳的重量差為腫脹度，計(jì)算小鼠耳腫脹抑制率[11]。

耳腫脹抑制率=（空白對(duì)照組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度）/空白對(duì)照組平均耳腫脹度×100%。

2.4 LPS誘導(dǎo)小鼠致炎實(shí)驗(yàn)

取50只昆明小鼠，雌雄各半，按“2.1.2”項(xiàng)和模型組（LPS組）隨機(jī)分成5組，雌雄各半，每組10只，分別灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，除空白對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射LPS（5 mg/kg），致炎6 h后，自小鼠眼眶取血，收集于離心管中，置于3000 r/min離心機(jī)離心30 min后分離血清，用ELISA法測(cè)定腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析法分析，包括方差齊性，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響

阿司匹林組的小鼠足腫脹度低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），羅漢松種子總黃酮低、高劑量組小鼠足腫脹度與空白對(duì)照組相比較低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響比較（）

表1 對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響比較（）

注 與空白對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別n劑量（mg/kg）腫脹度（mg）腫脹抑制率（%）空白對(duì)照組10-88.22±35.06-阿司匹林組1020073.79±20.03*16.36羅漢松種子總黃酮低劑量組106077.04±35.9112.67羅漢松種子總黃酮高劑量組1018075.44±29.2714.49

3.2 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

阿司匹林組和羅漢松種子總黃酮高劑量組小鼠耳腫脹度明顯低于空白對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；羅漢松種子總黃酮低劑量組小鼠耳腫脹度與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），但高于阿司匹林組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響比較（）

表2 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響比較（）

注 與空白對(duì)照組比較，**P ＜ 0.01；與阿司匹林組比較，#P ＜ 0.05；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別n劑量（mg/kg）腫脹度（mg）腫脹抑制率（%）空白對(duì)照組10-17.00±4.63-阿司匹林組102008.30±5.85**51.18羅漢松種子總黃酮低劑量組106014.30±6.44#15.88羅漢松種子總黃酮高劑量組101808.90±5.61**47.65

羅漢松種子總黃酮低、高劑量組以及阿司匹林組與空白對(duì)照組、模型組IL-1β比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；羅漢松種子總黃酮低、高劑量組IL-8明顯高于空白對(duì)照組和阿司匹林組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），而阿司匹林組IL-8低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)小鼠血清中IL-1β和IL-8水平的影響（）

表3 對(duì)小鼠血清中IL-1β和IL-8水平的影響（）

注 與空白對(duì)照組比較，**P ＜ 0.01；與模型組比較，△△P ＜ 0.01；與阿司匹林組比較，##P ＜ 0.01；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；IL-8：白細(xì)胞介素-8；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別n劑量（mg/kg）IL-1β（pg/ml）IL-8（pg/ml）空白對(duì)照組10-76.34±11.58428.75±244.94模型組10-82.84±5.652091.00±373.12**阿司匹林組1020075.30±15.701258.75±198.08**△△羅漢松種子總黃酮低劑量組106081.24±4.092045.00±284.47**##羅漢松種子總黃酮高劑量組1018080.68±11.241933.13±352.55**##

3.3 對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠致炎的影響

羅漢松種子總黃酮低、高劑量組TNF-α與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），均高于阿司匹林組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；羅漢松種子總黃酮低、高劑量組IL-6與空白對(duì)照組、阿司匹林組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），但明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；羅漢松種子總黃酮低、高劑量組IL-10與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），但明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），也均高于阿司匹林組，但羅漢松種子總黃酮低劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），高劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表4。

表4 對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠致炎的影響（）

表4 對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠致炎的影響（）

注 與空白對(duì)照組比較，ΔP ＜ 0.05；與模型組比較，*P ＜ 0.05、**P ＜ 0.01；與阿司匹林組比較，#P ＜ 0.05；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-6：白細(xì)胞介素-6；IL-10：白細(xì)胞介素-10；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別n劑量（mg/kg）TNF-α（pg/ml）IL-6（pg/ml）IL-10（pg/ml）空白對(duì)照組10- 184.63±25.45** 76.66±8.20* 811.41±145.86**模型組105 214.21±32.44#Δ 86.79±18.55Δ446.48±44.32#Δ阿司匹林組10200 168.84±27.24**80.70±8.98 704.36±104.96**羅漢松種子總黃酮低劑量組1060186.44±9.84* 74.37±5.45* 742.04±145.95**羅漢松種子總黃酮高劑量組10180 186.56±15.56* 74.15±10.39* 869.64±136.50**#

4 討論

炎癥病理機(jī)制復(fù)雜，涉及多種機(jī)制和炎性介質(zhì)[12]，如IL-1β、IL-8、TNF-α和IL-6等可促進(jìn)炎癥發(fā)生，而IL-10等能對(duì)抗致炎作用[13]、促進(jìn)組織修復(fù)。角叉菜膠、二甲苯和LPS均能引發(fā)小鼠急性炎癥[14-15]。本研究中，羅漢松種子總黃酮低、高劑量組和阿司匹林組對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的抑制率相近，但高劑量組對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制效果與阿司匹林組相差不大，羅漢松種子總黃酮低劑量組相對(duì)較差，說(shuō)明羅漢松種子總黃酮對(duì)小鼠足、耳腫脹有一定抑制效果，具有抗炎作用，且隨劑量增加而增強(qiáng)。另外，分析ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-6和IL-10水平結(jié)果提示，羅漢松種子總黃酮對(duì)血清IL-1β和IL-8無(wú)明顯影響，但能明顯降低血清TNF-α、IL-6含量和升高IL-10含量，這可能與其抗炎作用有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)角叉菜膠致小鼠足腫脹、二甲苯致小鼠耳腫脹、LPS誘導(dǎo)小鼠致炎三種急性致炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞接懥_漢松種子總黃酮抗炎作用及部分可能作用機(jī)制，方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，能為羅漢松種子的抗炎藥用價(jià)值研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。