王 玨 王 睿 張 程 徐忠玲

齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院腫瘤一科，黑龍江齊齊哈爾 161000

乳腺癌位于女性惡性腫瘤之首，侵襲和轉(zhuǎn)移是導致乳腺癌治療失敗或復發(fā)的主要原因[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）作為乳腺癌的一個亞型，以雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮細胞生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）缺乏為主要特征[2]，在各種亞型中具有最高的病死率和復發(fā)率。TNBC對激素和靶向治療均不敏感，目前主要采取傳統(tǒng)的化療手段，但治療效果較差。基因組不穩(wěn)定性和高突變負荷使免疫浸潤處于較高水平，從而使TNBC成為乳腺癌亞型中免疫原性最強的亞型[3]。TNBC相較于其他亞型，突出的特點是腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltrating lymphocyte，TILs）和程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）高表達，有研究顯示，程序性死亡-配體1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）是TNBC患者預后的獨立危險因素[4]。從TNBC的特點及PD-1抑制劑有效性出發(fā)，考慮采用PD-1抑制劑治療TNBC，但PD-1抑制劑單藥使用反應(yīng)率一般不高，且不對所有的腫瘤類型有效，還存在繼發(fā)耐藥現(xiàn)象。本研究采用PD-1抑制劑聯(lián)合艾坦，探討其在TNBC小鼠模型中的應(yīng)答差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

8周齡雌性BALB/c小鼠32只，體重18～22 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，許可證號：SCXK（京）2019-0017；4T1小鼠乳腺癌細胞由上海弘順生物科技有限公司提供；艾坦片（艾坦）購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20140103；PD-1抑制劑（拓益JS001）購于君實生物。本研究經(jīng)過醫(yī)院動物醫(yī)學倫理委員會批準（倫理審批號：202215）。

1.2 TNBC荷瘤小鼠模型構(gòu)建

取32只雌性 BALB/c小鼠，禁食飼養(yǎng)12 h后采用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉（4 μl/g），將4T1細胞按3×106/ml濃度接種于腋下胸骨前緣乳腺脂肪墊，每只0.1 ml，觀察接種部位，3 d后出現(xiàn)直徑2～4 mm大小瘤結(jié)節(jié)，成瘤后7～10 d游標卡尺測量瘤體長徑和短徑計算瘤體體積=（瘤體長徑×瘤體短徑2）/2，腫瘤體積在100 mm3以上為造模成功。

1.3 實驗分組及給藥

將32只TNBC模型小鼠隨機分為模型組、PD-1抑制劑組、艾坦組和聯(lián)合組，每組各8只。PD-1抑制劑組給予PD-1抑制劑200 μg/只，經(jīng)腹膜內(nèi)注射，成瘤后2周和4周各給藥1次。艾坦組給予艾坦片20 mg/kg灌胃，1次/d，成瘤后次日開始給藥，連續(xù)28 d。聯(lián)合組按照PD-1抑制劑組和艾坦組劑量同時給藥。模型組給予等體積蒸餾水灌胃。

1.4 觀察指標及評價標準

1.4.1 計算各組小鼠瘤體體積和抑瘤率 成瘤后7、14、21、28 d于體外采用游標卡尺測量瘤體長徑和短徑，計算瘤體體積和抑瘤率，抑瘤率=（模型組瘤體體積-干預組瘤體體積）/模型組瘤體體積×100%。

1.4.2 檢測血清、腫瘤組織中PD-L1表達 末次給藥后心臟采血，2500 r/min離心分離15 min后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（美國Abcam公司，ab279408）檢測血清PD-L1水平。次日脫頸椎處死小鼠，剝瘤稱重后切取腫瘤組織標本，10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋及連續(xù)切片（厚度2 μm），EnVision 兩步法染色步驟嚴格按照免疫組化試劑盒（美國DAKO公司，GK500705）說明書方法，PD-L1（美國Abcam公司，ab205921）均按1∶100稀釋加入一抗工作液，以PBS緩沖液代替作為陰性對照組。一抗滴加后孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次加入二抗，孵育30 min后再次沖洗加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況。隨機取3個高倍鏡視野（400×），若染色的細胞數(shù)目占腫瘤細胞總數(shù)的百分比≥1%，則定義為陽性，否則為陰性[5]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠瘤體體積和抑瘤率比較

造模后7 d，模型組小鼠瘤體生長較快，而PD-1抑制劑組、艾坦組和聯(lián)合組小鼠瘤體生長較慢，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。造模14 d，模型組小鼠瘤體迅速生長，而PD-1抑制劑組、艾坦組和聯(lián)合組小鼠瘤體生長受到明顯抑制，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；聯(lián)合組小鼠瘤體明顯小于PD-1抑制劑組、艾坦組（P＜ 0.05）。造模21、28 d，模型組小鼠瘤體生長速度放緩，PD-1抑制劑組、艾坦組和聯(lián)合組小鼠瘤體生長速度受到抑制，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；聯(lián)合組小鼠瘤體明顯小于PD-1抑制劑組、艾坦組（P＜ 0.05）。造模后28 d，聯(lián)合組抑瘤率明顯高于PD-1抑制劑組、艾坦組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見表1、圖1。

圖1 腫瘤體積生長曲線

表1 造模后各組腫瘤體積和28 d抑瘤率比較（）

表1 造模后各組腫瘤體積和28 d抑瘤率比較（）

注 與模型組比較，#P ＜ 0.05；與聯(lián)合組比較，*P ＜ 0.05；“-”為無數(shù)據(jù)；PD-1：程序性死亡受體1；PD-L1：程序性死亡-配體1

組別n腫瘤體積（mm3）28 d抑瘤率（%）t與聯(lián)合組抑瘤率P與聯(lián)合組抑瘤率7 d14 d21 d28 d模型組8302.85±41.56656.36±45.65725.26±48.28817.65±56.72---PD-1抑制劑組8245.65±38.42#*296.36±42.26#*354.26±45.59#*419.50±51.23#*48.65±5.613.6420.003艾坦組8250.39±41.39#*305.26±55.26#*372.59±51.26#*468.11±60.47#*42.75±6.855.191＜0.001聯(lián)合組8205.62±30.26#265.75±42.56#302.56±45.65#340.65±48.62#58.37±5.05--比較值比較值

2.2 各組小鼠血清、瘤體組織中PD-L1表達比較

PD-1抑制劑組和聯(lián)合組血清PD-L1和腫瘤PD-L1陽性率均明顯高于模型組和艾坦組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；PD-1抑制劑組和聯(lián)合組血清PD-L1和腫瘤PD-L1陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表2、圖2。

圖2 PD-L1免疫組化結(jié)果（400×）

表2 各組小鼠血清、瘤體組織中PD-L1表達比較（）

表2 各組小鼠血清、瘤體組織中PD-L1表達比較（）

注 與模型組比較，*P ＜ 0.05；與艾坦組比較，#P ＜ 0.05；PD-1：程序性死亡受體1；PD-L1：程序性死亡-配體1

組別nPD-L1（mg/L）PD-L1陽性率（%）模型組842.05±8.5235.62±10.24 PD-1抑制劑組8 62.32±9.12*# 65.83±14.35*#艾坦組8 43.75±10.2338.79±11.23聯(lián)合組8 65.46±10.82*# 75.63±15.62*#

3 討論

PD-1抑制劑等免疫檢驗點抗體藥物能夠激活效應(yīng)T淋巴細胞，阻斷腫瘤免疫抑制機制，從而識別并殺死腫瘤細胞[6]，是腫瘤免疫治療的新方法，被批準用于肝癌、腎癌、肺癌等10余種惡性腫瘤的治療，取得一定的效果。艾坦是一款我國自行研制的通過抑制腫瘤血管生成發(fā)揮抗癌效果的藥物，目前已在晚期食管癌、胃癌等多種癌癥中應(yīng)用，Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示艾坦在晚期乳腺癌中取得效果[7-8]。

PD-L1是PD-1的配體，也是B7家族重要成員，而B7家族則是免疫反應(yīng)中極為重要的協(xié)同刺激分子[9]。PD-L1主要在淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）及其他重要臟器中表達。相關(guān)研究顯示，PD-1/PD-L1通路對T細胞、Til、DC等均具有不同的調(diào)控作用[10]。PD-1/PD-L1在肺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中均有表達[11]。黃婉瑩等[12]研究證實，TNBC患者腫瘤細胞中PD-1、PD-L1高表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TILs表達呈正相關(guān)。腫瘤微環(huán)境及腫瘤細胞通過上調(diào)PD-L1表達與CD8+T細胞表面的PD-1結(jié)合限制免疫反應(yīng)[13]。對于腫瘤細胞上調(diào)PD-L1表達的途徑，主要有以下幾個觀點：①編碼PD-L1的基因擴增；②PI3K-AKT通路、EGFR/MAPK通路、INFγ-JAK-STAT通路等激活，活化與PD-L1基因啟動因子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[14]；③EB病毒誘導；④表觀遺傳學機制。

祝夢姣等[15]研究顯示，抗PD-1/PD-L1免疫檢查點的雙重阻滯可能是TNBC免疫治療的突破口。鐘戀君等[16]研究認為PD-L1可作為TNBC的治療靶點及預后生物標志物。佟玲等[17]研究顯示，阿帕替尼通過抑制乳腺細胞癌ERK1/2信號通路，抑制乳腺癌小鼠瘤體的生長。本研究從PD-1抑制劑和艾坦聯(lián)合干預出發(fā)，探討其抗腫瘤效果。對各組小鼠瘤體體積和抑瘤率的觀察和比較發(fā)現(xiàn)，PD-1抑制劑、艾坦干預的TNBC小鼠模型瘤體生長受到明顯抑制，聯(lián)合組抑制效果更加明顯，證實PD-1抑制劑聯(lián)合艾坦在TNBC小鼠的抗腫瘤治療中能夠起到協(xié)同的作用。腫瘤細胞PD-L1表達水平越高，表示腫瘤通過PD-1/PD-L1信號通路發(fā)生免疫逃逸的可能性就越高[18]，因此PD-L1可作為PD-1抑制劑治療效果的預測因子。本研究中，PD-1抑制劑組和聯(lián)合組血清PD-L1表達水平明顯高于模型組和艾坦組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），證實PD-1抑制劑在TNBC模型小鼠的干預中發(fā)揮良好的效果。而艾坦組血清PD-L1表達水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），提示艾坦通過其他方面的機制進行抗腫瘤治療，與PD-1抑制劑作用機制重合的可能性較低。

本研究不足之處在于并未對PD-1抑制劑可能的作用機制展開深入的研究，在今后的研究中著重于此展開研究。

綜上所述，PD-1抑制劑聯(lián)合艾坦在TNBC治療中具有協(xié)同抗腫瘤作用，能有效抑制腫瘤生長，能為TNBC治療提供新的思路。