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        塞來(lái)昔布關(guān)鍵中間體HPLC 含量測(cè)定方法的建立

        2024-05-13 09:38:06劉曉蓮
        煤炭與化工 2024年3期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

        劉曉蓮

        (河北冀衡藥業(yè)股份有限公司,河北 衡水 053400)

        0 引 言

        塞來(lái)昔布(Celecoxib),化學(xué)名4-[5- (4- 甲基苯基) -3- (三氟甲基) 吡挫-1- 基]苯磺酰胺,是臨床中常用的新一代環(huán)氧化酶-2(COX-2) 的特異性抑制劑,由美國(guó)西爾藥廠研制開發(fā),可通過(guò)抑制環(huán)氧化酶-2 阻止炎性前列腺素類物質(zhì)的產(chǎn)生,屬于非甾體抗炎藥,表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎鎮(zhèn)痛作用,可顯著減少胃腸道不良反應(yīng),用于治療各類急、慢性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎性疾病。無(wú)論對(duì)于急性創(chuàng)傷外傷導(dǎo)致的急性疼痛,還是外科手術(shù)后的止痛,都是理想的鎮(zhèn)痛藥物。

        目前關(guān)于塞來(lái)昔布合成的文獻(xiàn)和專利已有不少,在塞來(lái)昔布的合成工藝中,一般以對(duì)甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯經(jīng)Claisen 縮合反應(yīng)制得中間體,然后與對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽反應(yīng)制得塞來(lái)昔布,因此對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的質(zhì)量檢測(cè)對(duì)塞來(lái)昔布的合成來(lái)說(shuō)有著至關(guān)重要的作用。但目前關(guān)于中間體的液相色譜檢測(cè)方法的報(bào)道較少。本研究建立了對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的含量的高效液相色譜(HPLC) 測(cè)定方法,并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。

        1 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。

        圖1 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

        2 主要儀器與試劑

        UltiMate 3000 型高效液相色譜,購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó)) 有限公司;PURELAB flex 型超純水儀,購(gòu)自威立雅水處理技術(shù)(上海) 有限公司;BSA224S 型電子分析天平,購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司;KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器,購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司。

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品,購(gòu)自河北蒲葵生物醫(yī)藥科技有限公司;對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品,河北冀衡藥業(yè)股份有限公司自制;辛烷磺酸鈉,購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;三氟乙酸,購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;色譜純乙腈,購(gòu)自美國(guó)迪馬科技有限公司;水為超純水。

        3 方法與結(jié)果

        3.1 色譜條件

        色譜柱:Agllent ZORBAX SB-C18 柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm);

        流動(dòng)相:緩沖液(1.65 g 庚烷磺酸鈉置于1 000 ml 容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,用三氟乙酸調(diào)pH 值至2.5):乙腈=88:12;

        進(jìn)樣量:20 μL;

        檢測(cè)波長(zhǎng):233 nm;

        流速:1.0 mL/min;

        柱溫:25℃。

        3.2 溶液配置

        供試品溶液制備方法:精密稱取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽自制樣品10.0 mg,置25.0 mL 量瓶中,用流動(dòng)相溶解,并加流動(dòng)相至刻度,搖勻,即得。對(duì)照品溶液制備方法:精密稱取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品10.0 mg,置25.0 mL 量瓶中,用流動(dòng)相溶解,并加流動(dòng)相至刻度,搖勻,即得。

        3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

        按照2.2 項(xiàng)下制備方法配制6 份供試品溶液,按照上述色譜條件進(jìn)行分析,記錄色譜圖。系統(tǒng)適用性結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定HPLC 方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 System suitability test results for determination of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride content by HPLC method

        由表1 可得,對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定的保留時(shí)間的RSD<2%,峰面積的RSD<2%,拖尾因子為1.1,理論塔板數(shù)均在,10 000 以上表明該方法系統(tǒng)適用性良好。

        3.4 方法學(xué)考察

        3.4.1 線性范圍對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的工作濃度是0.4 mg/mL,其線性測(cè)量范圍為0.2 ~0.6 mg/mL,相當(dāng)于工作濃度的50%~150%水平。取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品約100 mg,精密稱定,置50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,當(dāng)做線性貯備溶液(2.0 mg/mL)。依次精密量取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品貯備液適量,加流動(dòng)相制成對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量分別為0.2、0.32、0.4、0.48和0.6 mg/mL 濃度的對(duì)照品溶液,依照2.1 項(xiàng)色譜條件,各個(gè)濃度進(jìn)樣2 次,進(jìn)行檢測(cè)分析,分析后記錄色譜圖。

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽線性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽線性測(cè)定結(jié)果Table 2 Linearity determination results of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。

        圖2 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve determination of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

        由表2 可見(jiàn),以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程:y=0.241 6x- 1.113 7,R2=0.999 6。結(jié)果表明對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積與其濃度呈較好的線性關(guān)系,可用來(lái)進(jìn)行對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定。

        3.4.2 專屬性試驗(yàn)

        以2.1 項(xiàng)溶液的配制方法分別配制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽供試品溶液、對(duì)照品溶液。分別量取空白溶劑、供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL,按照2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)分析,并記錄色譜圖。

        稀釋劑色譜圖如圖3 所示。

        圖3 稀釋劑色譜圖Fig.3 Diluent chromatogram

        供試品溶液色譜圖如圖4 所示。

        圖4 供試品溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of the test solution

        對(duì)照品溶液色譜圖如圖5 所示。由以上色譜圖可知,空白溶劑對(duì)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的檢測(cè)無(wú)干擾,該方法的專屬性良好。

        圖5 對(duì)照品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of reference solution

        3.4.3 檢測(cè)限和定量限

        用流動(dòng)相配制系列濃度對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣;記錄色譜圖和S/N,進(jìn)行檢測(cè)限、定量限的測(cè)試,S/N=3 對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限,S/N=10 對(duì)應(yīng)的濃度為定量限。結(jié)果表明對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的檢測(cè)限為0.167μg/mL;DPDMP 的定量限為0.501 μg/mL。

        3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        溶液的穩(wěn)定性研究用來(lái)證明根據(jù)相應(yīng)方法制備溶液在規(guī)定的儲(chǔ)存條件下在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。按照2.2 項(xiàng)下制備供試品溶液,儲(chǔ)存在室溫條件下,于適宜時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)樣??疾旄鲿r(shí)間點(diǎn)下供試品溶液中對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積變化情況,按照2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析,并記錄其峰面積。

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定溶液穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定溶液穩(wěn)定性結(jié)果Table 3 Solution stability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

        由表3 可見(jiàn),對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積RSD為0.35%,<2.0%,結(jié)果表明該溶液穩(wěn)定性良好。

        3.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

        按照2.2 項(xiàng)方法配制6 份供試品溶液,以2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)試分析,記錄峰面積。同樣,根據(jù)對(duì)照品溶液的制備方法配制相應(yīng)的對(duì)照品溶液,進(jìn)行檢測(cè)分析,并記錄峰面積。

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定重復(fù)性結(jié)果Table 4 Repeatability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

        由表4 可見(jiàn),平均峰面積為95.252,RSD 為0.29%。該試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽峰面積的RSD<2.0%,表明本方法重復(fù)性良好。

        3.4.6 加樣回收率試驗(yàn)

        取9 份已知準(zhǔn)確含量的供試品溶液,分別加入塞來(lái)昔布關(guān)鍵中間體對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的對(duì)照品,按照2.2 項(xiàng)樣品制備方法和2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析,測(cè)定峰面積。

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

        表5 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Recovery test results of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride

        由表5 可見(jiàn),對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的加樣平均回收率為99.77%,RSD 為0.40%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度較好。

        3.5 樣品含量測(cè)定

        取3 批自制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品,按照2.2 項(xiàng)制備方法配制供試品溶液。并按照2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明,采用HPLC 法,測(cè)定對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的含量,操作簡(jiǎn)單,專屬性良好。對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽三批樣品的含量均>99.0%。

        表6 3 批自制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride samples in 3 batches

        3 批自制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

        4 結(jié) 語(yǔ)

        對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽作為肼的有機(jī)衍生物,是塞來(lái)昔布合成工藝中的關(guān)鍵中間體,其含量對(duì)于制備塞來(lái)昔布的工藝而言,是十分重要的質(zhì)量研究?jī)?nèi)容。本試驗(yàn)根據(jù)高效液相色譜法測(cè)得的相關(guān)數(shù)據(jù),建立了一套對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的高效液相色譜檢測(cè)方法,用于控制關(guān)鍵中間體的質(zhì)量,即采用高效液相色譜法,色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18 柱(4.6×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:緩沖液(1.65 g 庚烷磺酸鈉置于1 000 mL 容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,用三氟乙酸調(diào)pH 值至2.5)∶乙腈=88∶12;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm;柱溫為25 ℃。

        經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明該方法可以直接用于檢測(cè)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量。本試驗(yàn)開發(fā)的方法通過(guò)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和方法學(xué)考察,表明該方法具有分析時(shí)間短、方法穩(wěn)定準(zhǔn)確、專屬性、重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn),可用于對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的質(zhì)量研究。目前針對(duì)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽多為合成工藝的研究,而本試驗(yàn)僅完成了含量測(cè)定方法的確定。下一步需要對(duì)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽進(jìn)行更多的質(zhì)量研究,如性狀、鑒別(色譜法和光譜法)、有關(guān)物質(zhì)及穩(wěn)定性研究等,為塞來(lái)昔布及其制劑的質(zhì)量控制提供更多參考依據(jù)。

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