張 敏 楊 立

北京市通州區(qū)婦幼保健院新生兒科，北京 101100

早產(chǎn)兒急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是新生兒重癥監(jiān)護(hù)中常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)病率和病死率極高，主要病理特征為細(xì)胞免疫和凝血系統(tǒng)異常引發(fā)肺泡膜損傷、肺水腫，導(dǎo)致氧合功能嚴(yán)重受損，嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒的生存和發(fā)育[1]。中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是由中性粒細(xì)胞釋放的一種特殊細(xì)胞外陷阱，由游離DNA（cell free-DNA，cf-DNA）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等組成[2]。當(dāng)中性粒細(xì)胞受到感染或激活時(shí)，NETs 會形成并釋放，起到限制病原微生物擴(kuò)散的作用。然而，過度活化的NETs 可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的過度放大和組織損傷，在多種疾病中發(fā)揮著不可忽視的作用[3]。纖溶酶原激活抑制劑1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是一種調(diào)節(jié)凝血和纖溶平衡的重要蛋白質(zhì)，其可抑制纖溶系統(tǒng)的活化，導(dǎo)致血栓形成和肺泡膜微循環(huán)障礙，與肺細(xì)胞損傷和纖維化進(jìn)程相關(guān)[4]。NETs 和PAI-1 可能參與了ARDS 的發(fā)生、發(fā)展，但二者與早產(chǎn)兒ARDS 的研究相對缺乏。因此，本研究旨在探究早產(chǎn)ARDS 患兒血漿NETs、PAI-1 的水平變化與患兒預(yù)后結(jié)局的關(guān)聯(lián)，以期為臨床早產(chǎn)兒ARDS 的診斷、個(gè)體化治療提供新思路。

圖1 cf-DNA、PAI-1 預(yù)測早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良的ROC 曲線

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020 年1 月至2022 年12 月北京市通州區(qū)婦幼保健院收治的早產(chǎn)ARDS 患兒125 例作為研究對象（ARDS 組），其中男71 例，女54 例；胎齡28～36周，平均（30.69±3.17）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①ARDS 的診斷符合《“新生兒急性呼吸窘迫綜合征”蒙特勒標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》[5]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②胎齡28～37 周；③需行氣管插管有創(chuàng)通氣；④監(jiān)護(hù)人對收集新生兒資料進(jìn)行研究具有知情權(quán)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并先天性血液系統(tǒng)疾病；②合并其他先天性呼吸系統(tǒng)疾??；③合并染色體異常、遺傳代謝性疾病、先天性心臟病等；④合并心、肝、腎功能嚴(yán)重?fù)p害。本研究經(jīng)北京市通州區(qū)婦幼保健院倫理委員會的審批同意（2022-TZFY-010-01）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 收集并統(tǒng)計(jì)患兒的基本資料，包括性別、孕齡、Apgar 評分、出生方式、出生體重、ARDS 分級、孕婦產(chǎn)前激素使用情況及妊娠糖尿病情況。

1.2.2 樣本采集 采集入組對象出生1 d 內(nèi)靜脈血2 ml，靜置1 h，3 500 r/min 離心8 min（離心半徑為14.5 cm），分離血漿，置于-80℃冷藏器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化指標(biāo)的檢測 常溫溶解樣本，基于PicoGreen熒光染料法，使用熒光酶標(biāo)儀測定血漿cf-DNA 水平，DNA 檢測試劑盒購于美國Invitrogen 公司（貨號：UA20200100595）；雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測NE、TNF-α、PAI-1 水平，NE 檢測試劑盒購于深圳晶美生物技術(shù)有限公司（貨號：SZBD20153768），TNF-α檢測試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司（貨號：SZBD20204783），PAI-1 檢測試劑盒購于上海杏宜生物科技有限公司（貨號：SZBD2018034765）。

1.2.4 患兒預(yù)后監(jiān)測 收集并統(tǒng)計(jì)患兒預(yù)后信息，預(yù)后不良定義為患兒死亡、病情無好轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)院治療、有創(chuàng)通氣＞10 d，其余情況為預(yù)后良好。并據(jù)此進(jìn)行分組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；等級資料比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析使用Pearson 檢驗(yàn)；早產(chǎn)ARDS 預(yù)后不良的影響因素采用logistic 回歸分析；cf-DNA、PAI-1 對早產(chǎn)兒ARDS 預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估，曲線下面積比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

125 例早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良47 例，預(yù)后良好78 例。

2.1 兩組一般資料和生化指標(biāo)比較

預(yù)后不良組cf-DNA、NE、TNF-α、PAI-1 水平高于預(yù)后良好組（P＜0.05）。兩組Apgar 評分、出生體重、ARDS 分級、分娩方式、產(chǎn)前激素使用、妊娠糖尿病比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料和臨床資料比較

2.2 早產(chǎn)ARDS 患兒cf-DNA 與NE、TNF-α 的相關(guān)性

早產(chǎn)ARDS 患兒cf-DNA 與NE、TNF-α 呈正相關(guān)（r=0.645、0.687，P＜0.001）。

2.3 早產(chǎn)ARDS 患兒不良預(yù)后的影響因素

以早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后為因變量（不良=1、良好=0），cf-DNA、NE、TNF-α、PAI-1 為自變量（原值帶入）進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析。結(jié)果顯示，cf-DNA、PAI-1 水平升高是早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（OR=2.188、2.303，P＜0.05）。見表2。

表2 早產(chǎn)ARDS 患兒不良預(yù)后的影響因素

2.4 cf-DNA、PAI-1 對早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良的預(yù)測效能

cf-DNA、PAI-1 聯(lián)合預(yù)測早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良的曲線下面積高于各指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測（Z=3.272、2.229，P=0.001、0.026）。見圖1、表3。

表3 cf-DNA、PAI-1 對早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良的預(yù)測效能

3 討論

ARDS 是各種肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的肺組織彌漫性損傷，以頑固性低氧血癥、呼吸困難為主要臨床特征，在小胎齡、低體重的早產(chǎn)兒中時(shí)有發(fā)生[6]。早產(chǎn)兒肺炎、胎糞吸入、圍生期窒息、菌血癥等導(dǎo)致ARDS 的肺內(nèi)外因素更易發(fā)生，加之其免疫力低下、抗外界環(huán)境能力差，患兒病情難以控制、預(yù)后極差[7]。ARDS 的主要病理機(jī)制是肺泡上皮、內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起終末微血管-肺泡屏障功能不全，體液滲入肺泡中造成肺水腫，引起肺通氣、換氣障礙，此過程與中性粒細(xì)胞過渡活化、炎癥反應(yīng)過渡激活、凝血纖溶系統(tǒng)失衡有關(guān)[8]。cf-DNA、PAI-1 分別是中性粒細(xì)胞激活、凝血系統(tǒng)失衡的重要標(biāo)志物，二者可能與早產(chǎn)兒ARDS 的發(fā)生密切相關(guān)。

當(dāng)機(jī)體受病原微生物侵襲時(shí)，中性粒細(xì)胞被激活釋放出一種以DNA 為基本框架且附著大量顆粒蛋白、肽類物質(zhì)的網(wǎng)狀纖維，即為NETs[9]。cf-DNA、NE是NETs 的主要成分，二者可較好地反映機(jī)體NETs水平[10]。NETs 的形成可以捕獲、消滅入侵的病原微生物，但過量產(chǎn)生的NETs 不僅直接損傷組織細(xì)胞，還可對炎癥介質(zhì)和蛋白質(zhì)進(jìn)行招募，進(jìn)而放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致組織上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[10-11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷發(fā)生時(shí)，NETs 可激活并誘導(dǎo)M0 亞型巨噬細(xì)胞向M1 型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而導(dǎo)致TNF-α 過度分泌加重炎癥反應(yīng)，同時(shí)TNF-α 亦可促進(jìn)NETs 形成，進(jìn)一步加重肺組織損傷[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷大鼠肺泡灌洗液中NETs 形成明顯增加、肺組織炎癥反應(yīng)明顯；使用DNA 降解酶干預(yù)后NETs 顯著下降，且肺組織損傷減輕[13]。提示清除NETs 有助于肺組織損傷恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組cf-DNA、NE、TNF-α 水平高于預(yù)后良好組。提示患兒體內(nèi)中性粒細(xì)胞高反應(yīng)性、NETs 生成明顯，且隨著NETs 生成增多，患兒肺組織損害程度越明顯，病情亦越重，預(yù)后越差。本研究結(jié)果顯示，早產(chǎn)ARDS 患兒cf-DNA 水平與NE、TNF-α 水平呈正相關(guān)。進(jìn)一步說明NETs 水平越高，其對肺組織的炎癥損傷越重。本研究結(jié)果顯示，cf-DNA 是早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。提示其與患兒預(yù)后具有較好的量化關(guān)系，也間接提示NETs 是預(yù)測早產(chǎn)ARDS 患兒預(yù)后不良的有效標(biāo)志物之一。筆者推測，早產(chǎn)ARDS 患兒肺組織上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯，外界病原微生物入侵后，刺激中性粒細(xì)胞活化，進(jìn)而釋放NETs 發(fā)揮滅菌作用，但在此過程中NE、TNF-α 等炎癥因子亦大量生成，進(jìn)而加重肺組織細(xì)胞上皮-內(nèi)皮屏障的破壞，加速肺水腫、促進(jìn)ARDS 的進(jìn)展，導(dǎo)致患兒病情加重、預(yù)后不良[10-13]。

PAI-1 屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員之一，其可抑制鏈激酶和尿激酶的纖溶作用，抑制體內(nèi)纖溶活性、增強(qiáng)凝血活性，進(jìn)而促進(jìn)纖維蛋白的形成[14-15]。ARDS 最為顯著的組織學(xué)改變?yōu)榉窝軆?nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致上皮-內(nèi)皮細(xì)胞屏障破壞、通透性增加，富含蛋白質(zhì)的滲出液進(jìn)入肺泡造成氣體交換障礙[16]。早產(chǎn)ARDS 患兒缺氧嚴(yán)重，并可繼發(fā)感染、酸中毒，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)外源凝血途徑被異常激活，患兒處于高凝狀態(tài)，纖維蛋白大量產(chǎn)生[17]。但是，ARDS 患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞明顯，其產(chǎn)生的纖溶酶降低，加之炎癥反應(yīng)激活巨噬細(xì)胞釋放大量PAI-1，導(dǎo)致體內(nèi)凝血-纖溶系統(tǒng)平衡破壞，體內(nèi)大量的纖維蛋白不能被及時(shí)溶解、消除，進(jìn)而大量沉積于肺微循環(huán)血管、肺泡內(nèi)，引發(fā)血液循環(huán)障礙、肺組織血?dú)饨粨Q障礙，加重患兒病情[18-19]。此外，有研究證實(shí)，PAI-1 還可通過NF-κB 信號通路誘導(dǎo)小鼠肺組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重小鼠肺纖維化程度[20]。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組PAI-1 水平高于預(yù)后良好組，且可對患兒不良預(yù)后進(jìn)行獨(dú)立預(yù)測。提示PAI-1 可反映早產(chǎn)ARDS患兒病情及預(yù)測患兒預(yù)后，原因在于早產(chǎn)ARDS 患兒體內(nèi)處于高凝狀態(tài)，纖維蛋白大量形成，PAI-1 的異常釋放抑制鏈激酶和尿激酶的纖維蛋白溶解作用，導(dǎo)致機(jī)體纖溶活性降低、凝血活性增高，最終導(dǎo)致大量纖維蛋白沉積于肺泡中而形成透明膜，加重患兒病情、引發(fā)患兒預(yù)后不良[21-25]。

本研究結(jié)果顯示，cf-DNA 和PAI-1 對早產(chǎn)預(yù)測效能ARDS 患兒不良預(yù)后具有較好的預(yù)測效能，且二者聯(lián)合進(jìn)一步提升預(yù)測效能，進(jìn)一步證實(shí)二者可指導(dǎo)臨床及早評估早產(chǎn)ARDS 患兒病情，預(yù)測不良預(yù)后，并可據(jù)此及時(shí)制訂有效干預(yù)措施。

綜上所述，cf-DNA、PAI-1 水平升高是早產(chǎn)兒ARDS 患兒預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，二者聯(lián)合檢測對患兒的預(yù)后具有較高的預(yù)測效能，二者有望成為評估患兒病情及預(yù)后的可靠指標(biāo)。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。