王 洋 奚 志 王 銘 修佳琦 李 冰 楊霄鵬

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南鄭州 450003

先兆子癇是一種嚴(yán)重的妊娠期高血壓疾病，通常在懷孕20 周后表現(xiàn)為血壓升高和蛋白尿等主要癥狀，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡率和發(fā)病率升高的原因[1-2]。全球范圍內(nèi)，卒中是主要的死亡和殘疾原因之一，其中缺血性卒中占卒中總數(shù)的63%左右，給全世界帶來(lái)了巨大的疾病負(fù)擔(dān)[3]。多項(xiàng)研究表明，先兆子癇增加了孕產(chǎn)婦患心血管疾病、糖尿病和卒中的風(fēng)險(xiǎn)[4-6]，這些風(fēng)險(xiǎn)可能在分娩后數(shù)月至數(shù)年內(nèi)出現(xiàn)[7]。因此研究這2 種疾病之間的聯(lián)系對(duì)于預(yù)防長(zhǎng)期卒中風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。但這些研究大多是觀察性的，不能建立因果關(guān)系，因?yàn)榭赡艽嬖诨祀s因素和反向因果關(guān)系的干擾。孟德爾隨機(jī)化（Mendelian randomization，MR）是一種流行病學(xué)研究方法，利用與暴露密切相關(guān)并滿足特定假設(shè)的遺傳變異作為工具變量[8-9]。由于這些工具變量在減數(shù)分裂時(shí)隨機(jī)分配，MR 可以模擬隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，最大限度地減少混雜，并且不受外部干擾的影響，因此可提供更可靠的因果關(guān)系分析[10-11]。本研究利用大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）數(shù)據(jù)集，采用兩樣本MR 方法，進(jìn)一步探討先兆子癇與缺血性卒中及其亞型之間的因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

先兆子癇的匯總數(shù)據(jù)集來(lái)自FinnGen 聯(lián)盟，其中包括3 903 例病例和114 753 例對(duì)照。研究的結(jié)局均來(lái)自于MEGASTROKE 聯(lián)盟，并且根據(jù)Org 10172 試驗(yàn)在急性卒中治療分類中進(jìn)行定義，即缺血性卒中（34 217 例病例和406 111 例對(duì)照）及其3 種亞型，其中包括大動(dòng)脈卒中（4 373 例病例和146 392 例對(duì)照）、小血管卒中（5 386 例病例和192 662 例對(duì)照）和心源性卒中（7 193 例病例和204 570例對(duì)照）[12-13]。

1.2 研究方法

1.2.1 研究設(shè)計(jì) 根據(jù)STROBE-MR 指南[14]，對(duì)先兆子癇和缺血性卒中與其亞型進(jìn)行了兩樣本MR 分析，用作工具變量（instrumental variable，IV）的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）必須遵循3個(gè)重要假設(shè)[15]。假設(shè)1 是工具變量與先兆子癇強(qiáng)相關(guān)。假設(shè)2 是工具變量獨(dú)立于任何潛在的混雜因素。假設(shè)3 是工具變量?jī)H通過(guò)先兆子癇影響缺血性卒中及其亞型。見圖1。

圖1 研究流程

1.2.2 工具變量選擇 確定全基因組顯著性閾值：首先，確定全基因組顯著性閾值為P＜5×10-6，以確保選擇具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因型[16]。設(shè)定連鎖不平衡參數(shù)閾值：將去連鎖不平衡參數(shù)閾值設(shè)為r2＜0.001，同時(shí)限定遺傳距離為10 000 kb，以保證所選工具變量的獨(dú)立性。使用F 統(tǒng)計(jì)量評(píng)估工具變量：計(jì)算F 統(tǒng)計(jì)量來(lái)評(píng)估工具變量的弱工具變量偏倚[17]。F 統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算公式為F=β2/S.E.2，其中β 表示對(duì)先兆子癇的估計(jì)遺傳效應(yīng)，S.E.表示遺傳效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。選擇F統(tǒng)計(jì)量＞10 的工具變量，以確保工具變量具有足夠的預(yù)測(cè)能力。進(jìn)行SNP 的隨機(jī)化處理：在選擇工具變量之后，通過(guò)隨機(jī)化方法去除模糊和回文的SNP，確保所選SNP 的準(zhǔn)確性和一致性。檢查結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)中的P值：匯總檢查結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)中的P 值，剔除與缺血性卒中及其亞型高度相關(guān)的SNP，閾值設(shè)定為P＞5×10-6。確保所選SNP 與結(jié)局變量無(wú)關(guān)，確保工具變量的排他性。

1.2.3 MR 分析 采用逆方差加權(quán)法（inverse-variance weighted，IVW）作為主要的分析方法，并使用加權(quán)中位數(shù)法（weighted median，WM）和MR-Egger 截距法進(jìn)一步證明結(jié)果的穩(wěn)定性。

1.2.4 敏感性分析 用IVW 的Cochran Q 統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)異質(zhì)性，P＜0.05 提示GWAS 數(shù)據(jù)中的遺傳工具變量存在異質(zhì)性，采用IVW 隨機(jī)效應(yīng)模型分析關(guān)聯(lián)；反之，則采用IVW 固定效應(yīng)模型[18]。應(yīng)用MR-Egger 截距法和MR-PRESSO 方法測(cè)試多效性，如果P＜0.05 則提示結(jié)果具有顯著的多效性[19]。此外，使用留一法分析測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)健性。留一法通過(guò)依次消除每個(gè)SNP分析計(jì)算剩余SNP 的結(jié)果，并與MR 分析的總效應(yīng)大小進(jìn)行比較，以評(píng)估結(jié)果是否受到某些SNP 的顯著影響[20]。Bonferroni 校正通過(guò)對(duì)P 值的臨界值進(jìn)行校正，消除了所有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的可能性。而P 值為0.0125～0.0500 被視為具有潛在的因果關(guān)系；P＜0.0125 被視為具有顯著的因果關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.1.2 軟件“TwoSampleMR”包和“MRPRESSO”包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

7 個(gè)與先兆子癇相關(guān)的SNP 被選擇作為遺傳工具變量，其F 統(tǒng)計(jì)量為21.21～25.08，均滿足F＞10的閾值，表明弱工具變量偏倚不太可能存在。在IVW 方法中，沒(méi)有證據(jù)證明先兆子癇與缺血性卒中的發(fā)病率增加相關(guān)（OR=1.05；95%CI：0.96～1.15，P=0.312）。在對(duì)缺血性卒中亞型的分析中發(fā)現(xiàn)，基因預(yù)測(cè)的先兆子癇可增加小血管卒中的患病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.21，95%CI：1.05～1.40，P=0.008），并且在MR-Egger 回歸和加權(quán)中位數(shù)法中可觀察到相同的效應(yīng)大小方向，經(jīng)過(guò)Bonferroni 校正之后，因果關(guān)系仍然顯著。然而未發(fā)現(xiàn)先兆子癇與大動(dòng)脈卒中（OR=1.12，95%CI：0.89～1.40，P=0.326）和心源性卒中（OR=1.01，95%CI：0.86～1.20，P=0.857）之間存在因果關(guān)系（圖2～3）。在敏感性分析中，當(dāng)探究先兆子癇與缺血性卒中及大動(dòng)脈卒中的因果效應(yīng)時(shí)異質(zhì)性檢驗(yàn)的P＜0.05，因此采用IVW 隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)效應(yīng)估計(jì)。MR-PRESSO檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)異常離群值的存在。MR-Egger 回歸法也未發(fā)現(xiàn)水平多效性（圖2）。留一法未發(fā)現(xiàn)對(duì)效應(yīng)估計(jì)值影響較大的SNP，再次表明結(jié)果的穩(wěn)定（圖4）。

圖2 先兆子癇與缺血性卒中及其亞型因果關(guān)系分析及敏感性分析結(jié)果森林圖

圖3 孟德爾隨機(jī)化分析散點(diǎn)圖

圖4 孟德爾隨機(jī)化分析“留-法”示意圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)遺傳預(yù)測(cè)的先兆子癇與缺血性卒中（僅限于小血管卒中）之間存在因果關(guān)系。根據(jù)Chuang 等[6]的一項(xiàng)大型隊(duì)列研究，患有先兆子癇的女性的卒中發(fā)病率更高。在整個(gè)隨訪期間，與對(duì)照組比較，先兆子癇患者的缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（P＜0.001），并且于分娩后1～3 年內(nèi)達(dá)到峰值。這項(xiàng)研究顯示這2 個(gè)特征之間具有相關(guān)性，而不能提供因果關(guān)系的證據(jù)。然而最近一項(xiàng)MR 研究顯示沒(méi)有證據(jù)證明先兆子癇與缺血性卒中之間具有因果關(guān)系[16]。上面所提到的研究都沒(méi)有進(jìn)一步探究先兆子癇對(duì)于缺血性卒中亞型的影響。本研究擴(kuò)展了以前研究的不足，提示由遺傳預(yù)測(cè)的先兆子癇與缺血性卒中的因果關(guān)系僅限于小血管卒中，而非所有的缺血性卒中。經(jīng)過(guò)敏感性分析證明結(jié)果是穩(wěn)健的。

先兆子癇對(duì)于缺血性卒中及其亞型的潛在的作用機(jī)制在很大程度上仍然是不清楚的，但已有研究提供了一些可能的解釋。一是血腦屏障的破壞，由于先兆子癇本質(zhì)上屬于一種妊娠期高血壓疾病，血壓的急劇升高，導(dǎo)致壓力迅速傳遞至脆弱的大腦微血管，導(dǎo)致血腦屏通透性增加[21]。而血腦屏障的破壞可導(dǎo)致血管內(nèi)的液體和血漿成分外滲，從而引起腦實(shí)質(zhì)局部損傷（例如腔隙性腦梗死或皮質(zhì)下小梗死）[22-23]。二是腦血流自動(dòng)調(diào)節(jié)紊亂，先兆子癇患者通常伴有動(dòng)態(tài)腦自動(dòng)調(diào)節(jié)功能受損，同時(shí)由于血管重塑或損傷加劇血管腔擴(kuò)張和狹窄，腦血流灌注不足程度加重，隨后局部腦實(shí)質(zhì)缺氧和缺血導(dǎo)致缺血性卒中的發(fā)生[24-28]。三是炎癥因子的多重作用，先兆子癇被認(rèn)為是一種炎癥性疾病，患有先兆子癇的女性循環(huán)促炎因子水平升高[29-30]。一項(xiàng)MR 分析研究也支持中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與腔隙性卒中和小血管卒中風(fēng)險(xiǎn)增加之間存在因果關(guān)聯(lián)[31]。一方面促炎因子與血腦屏障損害彼此相互作用，一些研究表明血腦屏障的損傷先于炎癥，使血漿蛋白和免疫細(xì)胞能夠進(jìn)腦實(shí)質(zhì)導(dǎo)致不良腦血管事件的發(fā)生，同時(shí)可起到放大神經(jīng)炎癥的作用；而另一些研究顯示，炎癥會(huì)進(jìn)一步加重血腦屏障損害的程度[32-33]。另一方面多重炎癥因子可引起內(nèi)皮功能障礙，誘導(dǎo)黏附分子和趨化因子的表達(dá)，將白細(xì)胞募集到腦實(shí)質(zhì)中，從而促進(jìn)血栓的形成[34]。因此，由先兆子癇所引起的腦微血管的任何結(jié)構(gòu)損傷都可能導(dǎo)致缺血性卒中的發(fā)生，仍需要進(jìn)一步研究先兆子癇與小血管卒中之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

第一，本研究提示先兆子癇與缺血性卒中之間的因果關(guān)系僅限于特定亞型，其效應(yīng)大小不容易受到反向因果關(guān)系與一些未知混雜因素的影響。第二臨床公共衛(wèi)生預(yù)防意義重大，先兆子癇對(duì)于腦血管的損害是持續(xù)存在的，甚至?xí)稹岸未驌衄F(xiàn)象”，因此對(duì)于那些可能會(huì)出現(xiàn)先兆子癇的高危人群仍然應(yīng)該長(zhǎng)期服用抗血小板藥物進(jìn)行預(yù)防，以防止不良腦血管事件的發(fā)生[30，35-36]。然而，該研究仍有一些局限性。首先，這些用于推斷先兆子癇和缺血性卒中之間因果關(guān)系的數(shù)據(jù)主要來(lái)自歐洲血統(tǒng)，因此后續(xù)需要更多的研究以確定該因果關(guān)系在其他地區(qū)和種族中是否一致。其次，本研究無(wú)法進(jìn)行年齡和性別的分層分析?，F(xiàn)有的GWAS 數(shù)據(jù)集在這2 個(gè)方面存在限制，無(wú)法提供足夠的信息來(lái)進(jìn)行深入的分層分析。因此，后續(xù)可考慮采集更為詳盡信息的個(gè)體特征以便支持更精細(xì)地分層分析。

總之，本研究探索了先兆子癇與缺血性卒中及其亞型之間的因果關(guān)系，提示先兆子癇對(duì)小血管卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高具有一定作用，對(duì)曾有先兆子癇病史的患者進(jìn)行早期干預(yù)以降低缺血性卒中的發(fā)生具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。