李 倩 陳 臣 胡 燕 謝曉林 劉 濤

新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）為急性腦血管病的一種類型，預(yù)后很差，嚴重威脅人類健康及社會生產(chǎn)力[1-2]。在我國，ICH 所占比例很高，明顯高于西方國家，且給社會及家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[3-4]。ICH 后的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷的重要因素，小膠質(zhì)細胞被認為是最早激活的炎癥效應(yīng)細胞，活化的小膠質(zhì)細胞有M1 和M2 兩種表型，不同表型的小膠質(zhì)細胞起著損傷和保護的雙重作用，但這一雙重作用的病理改變及其具體機制尚不明確[5-6]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，大黃能明顯改善急性期ICH 大鼠的神經(jīng)功能缺損評分[7-8]。因此，本研究采用大黃的有效成分大黃酸，探討該藥對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞極化表型及相關(guān)炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞及藥物 小膠質(zhì)細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)環(huán)境：MEM、10%FBS 及1%PS，37 ℃，5%CO2，飽和濕度。大黃酸購于上海麥克林生化科技有限公司（貨號：R817294）。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清[蘇州依科賽生物（ExCell Bio）科技股份有限公司，貨號：FND500]；MEM培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號：FND500）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：70-EK182-96）；白細胞介素（interleukin，IL）-6 ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：70-EK106/2-96）；IL-1β ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：70-EK101B-96）；一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A014-1）；Anti-Human CD86（B7-2）PE（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：85-12-0869-41）；Anti-Human CD206（MMR）PE-Cyanine7（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：85-25-2069-41）。生物安全柜及CO2細胞培養(yǎng)箱（上海力康儀器有限公司，HF1200LC及Smart Cell HF-90）；臺式低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器有限公司，型號：TDL-60B）；流式細胞儀（美國BD 公司，貨號：LSRFortessa）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8 檢測細胞活力 取生長狀態(tài)良好的小膠質(zhì)細胞，制備成5×104個/ml 單細胞懸液，接種至96孔板中（100 μl/孔），培養(yǎng)過夜細胞貼壁后，取生長狀態(tài)良好，匯合率達90%的小膠質(zhì)細胞，胰酶消化細胞后，用培養(yǎng)基制備成5×104個/ml 單細胞懸液，接種至培養(yǎng)板中，置37 ℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 待細胞貼壁后，將細胞分為7 組，每組5個復(fù)孔。空白組以完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，LPS 組加入1 μg/ml LPS 誘導(dǎo)4 h，不同大黃酸組分別用0.1、1、10、20、50 μmol/L 大黃酸預(yù)處理2 h 后，加入1 μg/ml LPS 誘導(dǎo)4 h[9]。干預(yù)完成后，收集上清，各孔加入100 μl 10%的CCK-8 溶液，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，在1 h后，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的OD 值。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察 根據(jù)CCK-8 檢測結(jié)果，最終確定大黃酸低、中、高劑量組分別為1、10、20 μmol/L，即分為空白組，LPS 組，大黃酸低、中、高劑量組，每組3個復(fù)孔。干預(yù)完成后，放置于倒置顯微鏡上，觀察小膠質(zhì)細胞形態(tài)，并取3 個視野拍照。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞中CD86+（M1 型）和CD206+（M2 型）的比例 按上述干預(yù)完成后，收集細胞，PBS 重懸洗滌2 次，離心，棄上清。加入PBS 計數(shù)至1×107/ml，吸取100 μl 細胞懸液至流式管中，每管加入5 μl CD86-PE、CD206 PE-Cy7 抗體；4 ℃避光孵育20 min，離心，棄上清，用400 μl 預(yù)冷的PBS 重懸細胞，過200 目無菌篩網(wǎng)；上流式細胞儀檢測CD86+、CD206+細胞比例。

1.2.4 采用ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量 取上述分組細胞上清液，進行TNF-α、IL-1β、IL-6 含量檢測，參考試劑盒方法進行試劑配置，將各種試劑移至室溫平衡至少0.5 h，加入300 μl 洗液靜置浸泡30 s，棄洗液將微孔板拍干，標(biāo)準(zhǔn)孔加入100 μl，2 倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓准尤?00 μl 培養(yǎng)基，樣本孔加入100 μl 細胞培養(yǎng)上清，每孔加50 μl 稀釋的檢測抗體，室溫孵育1.5 h，棄液，每孔300 μl 洗液洗板6 次，每孔加100 μl 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min。再次封板振蕩室溫孵育1.5 h，每孔加100 μl 顯色底物，避光室溫孵育5～30 min，每孔加100 μl 終止液，顏色出現(xiàn)變化，30 min 內(nèi)使用酶標(biāo)儀進行雙波長檢測。

1.2.4 細胞中誘導(dǎo)型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）水平檢測 取生長狀態(tài)良好匯合率達90%的小膠質(zhì)細胞，用完全培養(yǎng)基制備成5×104個/ml 單細胞懸液，接種至6 孔板中（2 ml/孔），培養(yǎng)過夜細胞貼壁后，按照上述實驗方法進行干預(yù)，同時準(zhǔn)備對照組細胞，每組6 個復(fù)孔；干預(yù)完成后，收集細胞進行iNOS 含量檢測，參考試劑盒相關(guān)方法。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸干預(yù)后HMC3 增殖情況

大黃酸各濃度組OD 值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大黃酸干預(yù)后HMC3 增殖情況（）

表1 大黃酸干預(yù)后HMC3 增殖情況（）

注LPS：脂多糖。

2.2 細胞形態(tài)情況

各組HMC3 細胞形態(tài)均正常。見圖1。

圖1 不同濃度大黃酸干預(yù)后HMC3 細胞形態(tài)（n=3）

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞中CD86+和CD206+的比例情況

與空白組比較，LPS 組CD86+表達量升高，CD206+表達量降低（P＜0.05）；與LPS 組比較，大黃酸中、高劑量組CD86+表達量降低，CD206+表達量升高（P＜0.05）；與大黃酸低劑量組比較，大黃酸中、高劑量組CD86+表達量降低、CD206+表達量升高（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 流式檢測各組細胞表面CD86+、CD206+比例（n=3）

表2 大黃酸干預(yù)后各組細胞中CD86+、CD206+表達情況（%，）

表2 大黃酸干預(yù)后各組細胞中CD86+、CD206+表達情況（%，）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與大黃酸低劑量組比較，cP＜0.05。LPS：脂多糖。

2.4 大黃酸干預(yù)后各組IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達量比較

與空白組比較，LPS 組中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，大黃酸中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量降低（P＜0.05）。與大黃酸低劑量組比較，大黃酸中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α 低表達量降低（P＜0.05）。見表3。

表3 大黃酸干預(yù)后各組中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量比較（）

表3 大黃酸干預(yù)后各組中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量比較（）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與大黃酸低劑量組比較，cP＜0.05；IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α：LPS：脂多糖。

2.5 大黃酸干預(yù)后各組iNOS 活性檢測結(jié)果比較

與空白組比較，LPS 組iNOS 表達量升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，大黃酸低、中、高劑量組iNOS 表達量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 大黃酸干預(yù)后各組iNOS 活性檢測結(jié)果比較（）

表4 大黃酸干預(yù)后各組iNOS 活性檢測結(jié)果比較（）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05。iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；LPS：脂多糖。

3 討論

ICH 屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。該病多由肝腎虧虛、肝陽上亢、臟腑氣血逆亂、腦絡(luò)受損所致，臨床上多伴有大便秘結(jié)，腑氣不通，證屬本虛標(biāo)實，“痰瘀交結(jié)，氣血逆亂，腑氣不通”是其急性期病機關(guān)鍵[10-11]。此病病機雖復(fù)雜，然不外乎風(fēng)、火、氣、虛、痰、瘀，同時該病多以肝腎虧虛為本，屬本虛標(biāo)實[12-13]。腦者元神之腑，其氣與臟腑之氣相通，臟腑功能逆亂易突發(fā)該病，且元神亦易被風(fēng)、火、痰、瘀所侵擾，致“痰瘀交結(jié)，氣血逆亂，腑氣不通”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》首次提到大黃，功效“下瘀血，……蕩滌腸胃，推陳致新”。因此，急性中風(fēng)即投此藥，則腑氣暢通，升降歸位，氣血條暢，顱壓得降，血腫消退，諸癥皆消。

當(dāng)發(fā)生ICH 時，小膠質(zhì)細胞是首先被激活的炎癥效應(yīng)細胞，活化的小膠質(zhì)細胞能夠分泌大量的趨化因子、炎癥因子、蛋白酶、其他細胞毒性產(chǎn)物，增加炎癥細胞聚集，出現(xiàn)炎癥放大級聯(lián)效應(yīng)，加重神經(jīng)損傷[14-15]?；罨男∧z質(zhì)細胞可以分為M1 和M2 兩種表型，M1樣表型的激活主要發(fā)生在ICH 急性期，M2 樣表型發(fā)生在亞急性和慢性期，有助于吞噬細胞碎片和血腫清除[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后3～6 h M1 型小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯上升，而M2 型小膠質(zhì)細胞升高晚1 d 且持續(xù)時間更短[18]。在ICH 中驅(qū)動小膠質(zhì)細胞向M2 極化，可以減輕炎癥反應(yīng)達到神經(jīng)保護的作用[19-20]。丁苯酞可以促進小膠質(zhì)細胞M2 極化，從而減輕ICH 炎癥損傷[21]。此外，抑制小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)和自噬，能夠顯著減輕ICH 小鼠腦水腫，改善其神經(jīng)功能[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸在干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞極化表型中M1 比例較低，而M2 型比例較高，下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α 高等炎癥因子表達。由此可見，大黃酸通過抑制其向M1 表型轉(zhuǎn)化或誘導(dǎo)其向M2 表型轉(zhuǎn)化，從而減輕ICH 后炎癥反應(yīng)。

iNOS 作為誘導(dǎo)酶，產(chǎn)生的一氧化氮能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激和腦水腫，在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用重要[24]。研究表明抑制iNOS 的表達，能有效改善ICH 大鼠神經(jīng)功能[25]。瑞芬太尼抑制了iNOS 的表達，亦能改善大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能[26]。本研究中大黃酸干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞后，iNOS 表達下調(diào)，與同行研究結(jié)果一致。此研究結(jié)果，可為ICH 的治療提供一定的理論基礎(chǔ)，亦為今后的臨床研究提供一種思路或選擇。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。