安 娜 李 艷 廖柳鳳 梁寧生

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院臨床藥學(xué)科，廣西南寧 530021

目前，多重耐藥菌已經(jīng)廣泛分布全世界各地，研究表明，我國革蘭氏陰性桿菌的耐藥高于革蘭氏陽性球菌及真菌，甚至有些對碳青霉烯類抗菌藥物出現(xiàn)了耐藥[1-5]?？咕氖菑V泛存在于生物體內(nèi)的天然多肽，其具有廣譜抗菌等特點[6-8]。人們相繼從高等動植物中分離獲得抗菌肽，并發(fā)現(xiàn)抗菌肽對部分細(xì)菌、真菌、病毒及癌細(xì)胞等均具有強(qiáng)有力的殺傷作用[9-10]。大量的文獻(xiàn)報道這些分子是高度特異性的抗微生物化合物，極具成為新型抗菌藥物的潛力[11-15]。因此，對抗菌肽的殺菌活性研究逐漸成為熱點。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一類能夠參與水解磷脂sn-2 鍵的酶，具有抗菌、抗感染、抗腫瘤等多種生物活性[16-17]。近年來，越來越多的研究表明，PLA2氨基末端衍生肽在抗細(xì)菌感染方面具有重要作用[18-20]。為了進(jìn)一步探討其抗細(xì)菌活性的機(jī)制，本文研究了PLA2氨基末端衍生肽的合成及其抗細(xì)菌活性。

1 材料與方法

1.1 PLA2 氨基端肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 的合成

①材料準(zhǔn)備：細(xì)胞培養(yǎng)液（批號：2010060303）、血清（批號：19110502）、胰蛋白酶（批號：2009240202）、膠原蛋白酶（批號：9001121）等，上述試劑均由浙江森瑞生物科技有限公司提供。②細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)臈l件下，待細(xì)胞生長到所需密度后，加入胰蛋白酶和膠原蛋白酶進(jìn)行消化。③提取PLA2：將消化后的細(xì)胞離心，取上清液，加適量硫酸銨溶液沉淀。沉淀物即為PLA2。④氨基端肽的制備：將PLA2溶解在緩沖液中，加入胰蛋白酶水解，得到氨基端肽。⑤純化氨基端肽：將水解產(chǎn)物進(jìn)行離子交換和凝膠過濾色譜，得到純化的氨基端肽。在Fmoc 固相合成法中α-氨基用Fmoc 保護(hù)基（圖1）進(jìn)行保護(hù)，側(cè)鏈則采用Boc作為保護(hù)基。所有的抗菌肽均由上海波泰生物科技有限公司根據(jù)本研究的設(shè)計合成。

圖1 Fmoc 固相合成法合成多肽機(jī)制與工藝流程

圖2 PLA2 氨基末端衍生肽質(zhì)譜圖

1.2 PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 的殺菌實驗

1.2.1 儀器Thermo 420 型恒溫氣浴搖床為美國Thermo Electron 公司產(chǎn)品；J3-NAPCO-5410 型二氧化碳培養(yǎng)箱購自克勒格瓦尼（上海）分析儀器有限公司；微量加樣器1 000、200、50、10 μl 各1 支購自日本NICIRYO公司；pH 計購自美國ORION Research 公司；HWS-20恒溫水浴箱購自江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；漩渦振蕩器購自江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；Anke TGL-16C 臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；Hettic 臺式高速冷凍離心機(jī)320/320R 購自德國Hettic 公司；TU-1810S紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司；Techcompvis7200 可見分光光度計購自上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2.2 細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株 革蘭氏陽性菌：枯草桿菌（ATCC 63501）；一種革蘭氏陰性菌：大腸埃希菌（ATCC44113）。以上標(biāo)準(zhǔn)菌株均來自廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室。

1.2.3 藥品與試劑①上海波泰生物科技有限公司合成的PLA2氨基末端11、15、20 個氨基酸殘基的多肽PLA2N11（批號：10081311，純度≥95%）、PLA2N15（批號：10101326，純度≥98%）、PLA2N20（批號：10101479，純度≥98%）。②4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes，批號：230-907-9）和1%小牛血清白蛋白（BSA，批號：A8010）購自北京Solarbio 公司。③LB 培養(yǎng)基粉（批號：1009533）及LB 營養(yǎng)瓊脂（批號：100127）購自生物工程（上海）有限公司。④RPMI 1640（批號：970810）購自GIBCOBRL 公司。

1.3 殺菌實驗方法

采用瓊脂鋪板計數(shù)法。①細(xì)菌培養(yǎng)：取過夜的枯草桿菌和大腸埃希菌按照1∶50 的比例加入3 ml 的新鮮LB 培養(yǎng)液中，置于37℃的恒溫?fù)u床孵育2.5 h，達(dá)到對數(shù)生長期。②菌液制備：室溫下1 000 r/min 離心45 s 后收集細(xì)菌，用生理鹽水洗滌細(xì)菌并再次離心，棄上清液，將所得細(xì)菌沉淀物溶于500 μl 滅菌生理鹽水。③實驗分組：制備RPMI-1640 反應(yīng)體系，依次將10 μl 細(xì)菌和10 μl 多肽（實驗組，其作用濃度分別為7.81、31.25、125.00、500.00 μg/ml）或生理鹽水（對照）加入80 μl 反應(yīng)體系中，混勻，置于37℃的恒溫水浴鍋中2h。④計算殺菌率：2h 后取出反應(yīng)液40μl，以滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍稀釋，保存于無菌培養(yǎng)皿中，加入LB 營養(yǎng)瓊脂6 ml 搖勻，37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。殺菌率=（1-實驗組菌落形成單位）/對照菌落形成單位×100%。合成后進(jìn)行純度檢測、分子量檢測及穩(wěn)定性檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用origin 8.0 進(jìn)行圖像繪制，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLA2 氨基末端衍生肽的一級結(jié)構(gòu)特點

PLA2N11含有2 個堿性氨基酸（2 個賴氨酸），該蛋白質(zhì)具有兩個正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)。氨基酸之間通過肽鍵相連，形成了肽鏈。PLA2N15含有4 個堿性氨基酸；與PLA2N11比較，PLA2N15具有更多的堿性氨基酸，具有更多的正電荷側(cè)鏈基團(tuán)。PLA2N15的第一個特點在于其豐富的脯氨酸和賴氨酸。PLA2N15中谷氨酸和天冬氨酸含量較高。PLA2N20含有7 個堿性氨基酸（4 個賴氨酸，2 個精氨酸，1 個組氨酸），PLA2N20具有更多的堿性氨基酸，正電荷側(cè)鏈基團(tuán)更強(qiáng)。PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20均不含酸性氨基酸。此外，疏水性氨基酸比例較高，PLA2N20可達(dá)到0.600。PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20質(zhì)譜圖。見圖2。

2.2 多 肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20對枯草桿菌殺菌活性比較

與對照比較，多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20對革蘭氏陽性菌枯草桿菌殺菌活性更強(qiáng)，各多肽間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)多肽作用濃度為500.00 μg/ml 時，PLA2N15對枯草桿菌殺菌率可達(dá)99.8%，高于PLA2N11、PLA2N20，及對照（P＜0.05）。見表1。

表1 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對枯草桿菌殺菌活性比較（%，，n=4）

表1 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對枯草桿菌殺菌活性比較（%，，n=4）

注 與對照比較，aP＜0.05；與PLA2N11 比較，bP＜0.05；與PLA2N15 比較，cP＜0.05。PLA2：磷脂酶A2。

2.3 多 肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20對大腸埃希菌殺菌活性比較

與對照比較，各多肽不同作用濃度時對大腸埃希菌殺菌活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；多肽作用濃度為7.81、125.00、500.00 μg/ml 時，PLA2N15的殺菌活性均高于PLA2N11和PLA2N20（P＜0.05）；多肽作用濃度為31.25 μg/ml 時，PLA2N15的殺菌活性低于PLA2N11的殺菌活性，且高于PLA2N20的殺菌活性（P＜0.05）。見表2。

表2 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對大腸埃希菌殺菌活性比較（%，，n=4）

表2 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對大腸埃希菌殺菌活性比較（%，，n=4）

注 與對照比較，aP＜0.05；與PLA2N11 比較，bP＜0.05；與PLA2N15 比較，cP＜0.05。PLA2：磷脂酶A2。

3 討論

抗菌肽通過靜電吸引力與細(xì)菌細(xì)胞膜帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合，引起膜破裂，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[21]。本研究的殺菌試驗選擇了枯草桿菌和大腸埃希菌，結(jié)果表明，當(dāng)作用濃度為500.00 μg/ml 時PLA2N15對枯草桿菌、大腸埃希菌的殺菌率分別為99.8%、56.4%，優(yōu)于PLA2N11、PLA2N20。關(guān)于PLA2N15在動物或人體內(nèi)的使用濃度需要進(jìn)一步的科學(xué)研究和實驗驗證。在動物或人體內(nèi)，藥物濃度受到許多因素的影響，包括藥物的吸收、分布、代謝和排泄等。因此，預(yù)測PLA2N15在人體內(nèi)的濃度需要基于藥代動力學(xué)模型和相關(guān)參數(shù)的測定。需要注意的是，藥物在體內(nèi)的濃度并不是越高越好，而是需要在達(dá)到治療效果的同時，避免出現(xiàn)不良反應(yīng)。結(jié)合本研究的結(jié)果，多肽的抗菌活性與其攜帶的凈正電荷及堿性氨基酸數(shù)量的密切相關(guān)，但不一定是正相關(guān)。部分抗菌肽表現(xiàn)出隨正電荷適當(dāng)增加而殺菌活性增強(qiáng)，其可能原因是抗菌肽與細(xì)菌之間的靜電吸引力增強(qiáng)[22-23]。

在確定合成肽的抗細(xì)菌活性過程中，需要進(jìn)行大量的細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏實驗。盡管面臨挑戰(zhàn)，但此研究仍具有明顯的優(yōu)勢，通過合成PLA2氨基末端衍生肽，有可能開發(fā)出一種全新的抗細(xì)菌感染策略，對于解決日益嚴(yán)重的抗菌藥物耐藥性問題具有重要意義[24]。但該研究也存在一定的局限，實驗成本較高，實驗周期較長。另外盡管在實驗室內(nèi)合成的肽可能具有抗細(xì)菌活性，但在臨床轉(zhuǎn)化為實際治療手段的過程中可能面臨諸多挑戰(zhàn)，例如安全性、有效性、生產(chǎn)成本等問題。

目前，隨著抗生素在臨床應(yīng)用的增加，耐藥問題越來越突出?？咕膭t具有殺菌快速、抗菌譜廣、毒副作用小、無免疫原性等優(yōu)點。且由于其特殊的殺菌機(jī)制，被抑制或殺滅的病原性微生物不會產(chǎn)生抗性菌株，不會由于耐藥性而減弱殺滅細(xì)菌的作用[25]。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，最終這些困難會得到克服。期待更多具有很好抗菌活性的抗菌肽不斷出現(xiàn)，為人類抵抗多重耐藥菌提供一道防線。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。