張 偉 楊 直 金朦娜 郭 成 汪玉軍 文 波 申屠銀洪

1.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310017；2.浙江桐君堂中藥飲片有限公司，浙江杭州 311500

六神曲又稱(chēng)神曲，始載于唐《藥性論》，為傳統(tǒng)復(fù)方天然發(fā)酵曲劑[1]；由苦杏仁、青蒿、蒼耳草、辣蓼、赤小豆按照一定的比例混合，再加入面粉和麥麩后經(jīng)發(fā)酵而成[2]；現(xiàn)代研究表明，其含有酵母菌、霉菌、麥角固醇、揮發(fā)油、苷類(lèi)等，具有消食健胃、和中止瀉的功效[3-4]。目前全國(guó)各地六神曲在組方、配伍、發(fā)酵工藝等有所不同，有青蒿、蒼耳、辣蓼采用新鮮榨汁，亦有干品煎煮入藥；面粉和麥麩比例也不相同，導(dǎo)致顏色、質(zhì)地及表面特征上差異較大[5-6]。此外，部分省份還加入其他成分輔助發(fā)酵，如《江西省中藥炮制規(guī)范2008 年版》[7]規(guī)定加入甘草粉6 kg；《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范2002 年版》[8]（處方二）加入酵母粉38 g；《浙江省中藥炮制規(guī)范2015 年版》[9]規(guī)定加入米曲霉孢子進(jìn)行發(fā)酵。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方面，江西省、湖北省、陜西省的炮制規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目較全面，江西省、湖北省制訂了黃曲霉毒素控制項(xiàng)，其他省份標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目較少，多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀項(xiàng)[10-16]。

本研究以浙產(chǎn)六神曲為對(duì)象，以《浙江省中藥炮制規(guī)范2015 年版》[9]規(guī)定的發(fā)酵條件：置溫度為28℃、相對(duì)濕度為70%～80%的溫室里，待其遍布“黃衣”時(shí)為參考。通過(guò)設(shè)置不同的溫濕度條件，對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行測(cè)定研究，探索六神曲最佳發(fā)酵條件。本研究選取了苦杏仁中的苦杏仁苷、辣蓼和蒼耳草中的黃酮類(lèi)成分（蘆丁、槲皮素）和酚酸類(lèi)成分（香草酸、阿魏酸）為代表，考察不同發(fā)酵條件下5 種成分的變化情況，為發(fā)酵條件的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)[17]；同時(shí)建立測(cè)定六神曲中苦杏仁苷、香草酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素5 個(gè)組分含量的高效液相色譜法，為制訂六神曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝條件的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters E2695 高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Mil lipore 公司）；XP204 電子天平（瑞士MettlerToledo 公司，十萬(wàn)分之一）；XS105DU 電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，百萬(wàn)分之一）；恒溫水浴鍋（德國(guó)Memmert 公司）。

1.2 對(duì)照品及試劑

苦杏仁苷（批號(hào)：110820-202109，含量：93.1%）、槲皮素（批號(hào)：100081-201610，含量：99.1%）、香草酸（批號(hào)：110776-201503，含量：99.8%）、阿魏酸（批號(hào)：110773-201915，含量：99.4%）、蘆?。ㄅ?hào)：100080-202012，含量：91.6%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)Merk 公司）；磷酸、甲醇為分析純購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；去離子水。

1.3 樣品

六神曲樣品由浙江桐君堂中藥飲片有限公司生產(chǎn)提供（批號(hào)：200805），發(fā)酵條件為：溫度為25℃、30℃、35℃，相對(duì)濕度為60%、70%、80%、90%，發(fā)酵時(shí)間為3 d，樣品制備過(guò)程同標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定制法。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ChromCore AR C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，0.08%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫。洗脫程序：0～12.0 min，10.0%→12.5%A；12.0～19.2 min，12.5%→24.5%A；19.2～31.2min，24.5% →37.5% A；31.2～31.6 min，37.5% →52% A；31.6～43.6min，52%A；43.6～47.6 min，52%→100%A；47.6～56.6 min，100%A；56.6～56.7 min，100%→10%A；56.7～65.0 min，10%A。流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：對(duì)照品溶液2 μl、供試品溶液5 μl；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 精密稱(chēng)取苦杏仁苷、香草酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇配制成濃度分別為120 μg/ml 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱(chēng)取樣品粉末約5 g，精密加入70%甲醇100 ml，稱(chēng)定重量，加熱回流2 h，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液50 ml，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml 使溶解，置分液漏斗中，加水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次20 ml。合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 ml 量瓶中。相關(guān)色譜圖見(jiàn)圖1～3。

圖1 溶劑色譜圖

圖2 對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 供試品溶液色譜圖

2.3 線(xiàn)性關(guān)系

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取適量，加甲醇逐步稀釋?zhuān)瞥蓾舛确謩e為10、20、40、80、120 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以各組分濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明，5 種組分在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。見(jiàn)表1。

表1 5 種成分的線(xiàn)性關(guān)系結(jié)果

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，苦杏仁苷、香草酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素峰面積的RSD 值分別為0.67%、0.81%、0.87%、0.81%、0.82%。表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批發(fā)酵條件（30 ℃，80%）的六神曲樣品6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。苦杏仁苷、香草酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素峰面積的RSD 值分別為1.2%、1.7%、1.2%、1.8%、1.5%。表明重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，在0、4、8、12、24 h 內(nèi)按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定?？嘈尤受铡⑾悴菟?、蘆丁、阿魏酸、槲皮素峰面積的RSD 值分別為1.5%、0.9%、1.0%、0.7%、0.7%。表明24 h 內(nèi)溶液的穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.7.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取苦杏仁苷、香草酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇配制成濃度分別為360、250、75、50、25 μg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.7.2 樣品溶液 取樣品粉末約2.5 g，共6 份，精密稱(chēng)定，分別于250 ml 具塞錐形瓶中，分別加入苦杏仁苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 ml，香草酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1 ml，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)。苦杏仁苷、香草酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素峰面積的RSD 值均≤1.1%。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 含量測(cè)定

取不同發(fā)酵條件的六神曲樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算六神曲中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。六神曲最佳發(fā)酵參數(shù)工藝為溫度30 ℃，相對(duì)濕度80%，發(fā)酵時(shí)間3 d。

表3 不同發(fā)酵條件下各組分的含量（μg/g）

3 討論

3.1 不同發(fā)酵條件對(duì)苦杏仁苷含量的變化

本研究結(jié)果顯示，溫度（25 ℃）一定，通過(guò)改變不同的濕度（60%、70%、80%、90%）條件下，苦杏仁苷的含量差異較??；而溫度為30 ℃或35 ℃時(shí)，苦杏仁苷的含量遠(yuǎn)高于25 ℃。查閱相關(guān)資料顯示，苦杏仁中的苦杏仁苷經(jīng)酶解可以分解為氫氰酸和苯甲醛，且苦杏仁苷能在醋酸酸性環(huán)境中穩(wěn)定存在，酸性條件也能抑制D-和L-苦杏仁苷的異構(gòu)[18-20]。六神曲是發(fā)酵產(chǎn)物，pH 為5.5 條件下的神曲酶活力最高[21]。綜合分析認(rèn)為，苦杏仁苷酶解與溫度相關(guān)，溫度越高酶解活性越強(qiáng)，是導(dǎo)致其含量變化的主要因素。亦有報(bào)道稱(chēng)，生苦杏仁從發(fā)酵第1 天起，就檢測(cè)不到苦杏仁苷的峰，說(shuō)明發(fā)酵條件會(huì)影響苦杏仁苷的穩(wěn)定，但研究是將生品干青蒿、干蒼耳、干辣蓼粉碎入藥而非煎煮，與傳統(tǒng)工藝制法不一致[22-26]。

3.2 不同發(fā)酵條件與總含量的相關(guān)性

不同發(fā)酵條件下的六神曲中成分含量有存在較大差異，而這種差異勢(shì)必會(huì)對(duì)六神曲的功效產(chǎn)生影響。當(dāng)溫度相同而濕度不同時(shí)，六神曲中5 種成分總量一直在變動(dòng)，表明六神曲的發(fā)酵與溫度密切相關(guān)。當(dāng)溫度不變而濕度改變時(shí)，濕度為80%苦杏仁苷的含量遠(yuǎn)高于其他濕度，5種成分的含量值最高，其他有效成分也相對(duì)穩(wěn)定。綜合以上研究結(jié)果，六神曲最佳發(fā)酵參數(shù)工藝為溫度30 ℃，相對(duì)濕度80%，發(fā)酵時(shí)間3 d，此發(fā)酵參數(shù)與《浙江省中藥炮制規(guī)范2015 年版》[9]規(guī)定的發(fā)酵條件基本一致，且各個(gè)組分的含量要優(yōu)于其他發(fā)酵條件，為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定提供了數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也詮釋了發(fā)酵工藝參數(shù)的合理性。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。