姚夢(mèng)礎(chǔ) 徐建波 謝 宇▲

1.江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇淮安 223300；2.江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇淮安 223300

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中國(guó)年新發(fā)病例38.9 萬(wàn)，居惡性腫瘤第4 位，而年死亡病例達(dá)33.6 萬(wàn)，居第2 位，疾病負(fù)擔(dān)沉重[1]。乙型或丙型肝炎病毒感染、酒精濫用和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）等是HCC 的主要危險(xiǎn)因素[2]。但HCC 發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制尚不明確，因此研究識(shí)別新的HCC 分子標(biāo)志物有助于HCC的早期診斷和治療[3]。

細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂是惡性腫瘤主要特征之一[4]。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白異常表達(dá)對(duì)包括HCC 在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用[5-6]。而作為細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之一的細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白（cycle division cycle-associated protein，CDCA）家族由8 個(gè)成員組成，在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且與多種腫瘤密切相關(guān)[7-10]。本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了HCC患者的cDNA 基因表達(dá)譜，評(píng)估CDCA 在HCC 中的表達(dá)特征及不同的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系，單因素及多因素Cox 模型分析影響HCC 預(yù)后的因素。本研究豐富了CDCA 與肝癌的關(guān)系研究，并明確了影響肝癌生存獨(dú)立危險(xiǎn)因素，以期為探索HCC 的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后判斷等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及數(shù)據(jù)篩選

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//cancergenome.nih.gov/）下載HCC 編碼蛋白基因數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)，通過(guò)RSEM 標(biāo)準(zhǔn)化。納入肝癌及正常肝組織所有基因表達(dá)數(shù)據(jù)完整的病例，排除臨床病理信息及無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間、總體生存時(shí)間（overall survival，OS）數(shù)據(jù)不完整的病例，最終納入分析266 例HCC 組織及50 例正常肝組織樣本，以HCC 組織CDCA 表達(dá)水平的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)分組，其中CDCA1 為6.82，CDCA2 為5.32，CDCA3 為6.97，CDCA4 為7.19，CDCA5 為7.95，CDCA6為6.41，CDCA7 為4.35，CDCA8 為7.42。均以CDCA基因表達(dá)量≥中位數(shù)的患者為高表達(dá)組（133 例），否則為低表達(dá)組（133 例）。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

選取江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院2019 年6 月至2020 年6 月經(jīng)病理診斷的HCC 組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本24 例，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為8 組，每組3 對(duì)HCC 及癌旁組織。本研究經(jīng)江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（YX-P-2019-023-01）。

試劑和主要儀器：CDCA1（英國(guó)abcam 公司，貨號(hào)：ab230313）；CDCA2（英國(guó)abcam 公司，貨號(hào)：ab214289）；CDCA3（美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)：15594-1-AP）；CDCA4（英國(guó)abcam 公司，貨號(hào)：ab192237）；CDCA5（美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)：67418-1-Ig）；CDCA6（美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)：15579-1-AP）；CDCA7（美國(guó)Proteintech 公司，15249-1-AP）；CDCA8（美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)：12465-1-AP）；顯微鏡（尼康株式會(huì)社，ECLIPSE 50i）和分析軟件（NIS-Elements v4.0）。

采用免疫組織化學(xué)染色法觀察：HCC 及癌旁組織石蠟切片分別經(jīng)脫蠟、脫水，枸櫞酸緩沖液（pH=6.0），微波爐抗原修復(fù)（高火10 min，低火10 min）自然冷卻；PBS 沖洗3 次，3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS 沖洗3 次，小牛血清封閉10 min，甩干。加相應(yīng)一抗，以PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，4 ℃孵育過(guò)夜，次日37 ℃水浴箱復(fù)溫45 min；滴加羊抗兔二抗工作液，室溫孵育10 min；新鮮配制的DAB 避光顯色；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件及GraphPad Prism 軟件（版本5）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析HCC 患者預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，采用log-rank χ2檢驗(yàn)比較組間OS 差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 患者的一般資料

266 例HCC 患者中男177 例，女89 例；年齡：＜65 歲151 例，≥65 歲115 例；組織學(xué)分級(jí)：低級(jí)別170 例，高級(jí)別96 例；T 分期：T1期140 例，T2期70例，T3期48 例，T4期8 例；TNM 分期：Ⅰ期138 例，Ⅱ期69 例，Ⅲ期56 例，Ⅳ期3 例；血管侵犯169 例，未侵犯97 例。

2.2 CDCA 在數(shù)據(jù)庫(kù)HCC 組織中的表達(dá)

與正常肝組織比較，CDCA1～8 在HCC 組織中表達(dá)水平升高（P＜0.001）。見圖1。

圖1 CDCA 在HCC 組織與正常肝組織中表達(dá)情況

2.3 CDCA 在臨床HCC 組織中的表達(dá)

臨床HCC 組織中CDCA1-8 的表達(dá)水平高于癌旁組織。見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)染色觀察肝細(xì)胞癌組織及其癌旁組織中細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白表達(dá)（40×）

2.4 生存分析和多變量分析

CDCA1/2/5/6/8 高表達(dá)組總生存率低于低表達(dá)組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CDCA1～8 表達(dá)高、低兩組HCC 患者生存分析

2.5 單因素和多因素Cox 回歸分析OS 與CDCA 表達(dá)水平及臨床病理特征的關(guān)系

Cox 單因素分析結(jié)果顯示，年齡、腫瘤大小分期（T3/T4）、TNM 分期（Ⅲ期）和CDCA1/2/3/5/6/8 與OS 相關(guān)（P＜0.05）。性別：男=1，女=2；病理分級(jí)：中低級(jí)別=1，高級(jí)別=2；血管侵犯：無(wú)侵犯=1，有侵犯=2；T 分期與TNM 分期：Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，CDCA6、CDCA8、年齡、腫瘤大小分期T3/T4是HCC OS 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC 患者總生存率的單因素與多因素分析

3 討論

細(xì)胞分裂和自主生長(zhǎng)功能障礙是包括HCC 在內(nèi)的惡性腫瘤的重要標(biāo)志，對(duì)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后有很大影響[11-12]。因此，發(fā)掘新的、有效的生物標(biāo)志物將有利于HCC 的治療及對(duì)預(yù)后的判斷。CDCA 在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)。如CDCA5 在結(jié)腸癌及乳腺癌，CDCA7 在卵巢癌，CDCA3 在腎癌，CDCA1～8在肺癌及頸部鱗狀細(xì)胞中表達(dá)明顯升高[13-18]。本研究基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，探討CDCA 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織比較，HCC組織中CDCA 表達(dá)升高，且臨床標(biāo)本免疫組織化學(xué)提示相同的結(jié)果。

CDCA 在惡性腫瘤中的高表達(dá)往往意味患者更短的生存時(shí)間。如乳腺癌及結(jié)腸癌中CDCA5 高表達(dá)者OS 更短[13-14]。卵巢癌中CDCA7 表達(dá)增高患者生存時(shí)間更短[15]。肺癌中CDCA8 高表達(dá)患者其OS 更短[19]。在子宮內(nèi)膜癌中，CDCA1/2/3/4/5/8 高表達(dá)總體預(yù)后更差[20]。本研究通過(guò)比較CDCA 高低表達(dá)組之間OS 的差異，結(jié)果顯示，CDCA1/2/5/6/8 高表達(dá)患者OS 更短，提示大部分CDCA 表達(dá)水平可以作為肝癌患者生存預(yù)后的潛在指標(biāo)之一。

細(xì)胞周期中主要有G1～S、S 期和G2～M3期3 個(gè)檢查點(diǎn)，它們可為修復(fù)DNA 損傷提供時(shí)間，維持遺傳穩(wěn)定性[21]。目前已有報(bào)道CDCA2、CDCA3 和CDCA6 參與DNA 復(fù)制、G1～S 期轉(zhuǎn)換和CDK 抑制蛋白抑制，并在人鱗狀細(xì)胞癌、口腔癌等中過(guò)表達(dá)[18，22-23]。CDCA3 可以與Skp1 和cullin 結(jié)合，從而影響SCF 復(fù)合體對(duì)CDK 抑制蛋白泛素化來(lái)調(diào)節(jié)G1/S 期過(guò)渡[22]。此外，Wee1 作為一種重要的有絲分裂抑制劑，CDCA3 通過(guò)介導(dǎo)Wee1 的降解在G2期發(fā)揮作用[24]。CDCA6 可能與前列腺癌的DNA 復(fù)制和細(xì)胞有絲分裂有關(guān)[25]。本研究中單因素及多因素Cox 分析發(fā)現(xiàn)，CDCA1/2/3/5/6/8表達(dá)水平、肝癌大小、年齡與患者預(yù)后密切相關(guān)，且CDCA6/8、年齡，腫瘤大小分期（T3/T4）是HCC OS 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，提示CDCA 與HCC 的增殖密切相關(guān)，促進(jìn)腫瘤增殖進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，CDCA6/8 是判定HCC 進(jìn)展和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，為研發(fā)作用于CDCA6/8 的治療HCC 靶向藥物提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)支撐。然而，本研究?jī)H探討了CDCA 不同表達(dá)量與HCC 的相關(guān)性，尚未闡明其促進(jìn)HCC 發(fā)展的分子機(jī)制，需在今后進(jìn)一步深入研究。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。