補 娟 史 深 葉勒丹·馬漢 王兆霞 周 玲

(1 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究與轉(zhuǎn)化中心,烏魯木齊,830001; 2 新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心消毒與感染控制中心,烏魯木齊,830002)

炎癥是一種機體適應(yīng)性防御反應(yīng),但長期過度的炎癥會對身體產(chǎn)生有害影響,引起一系列疾病如糖尿病、哮喘和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等,在嚴(yán)重情況下,甚至威脅人類生命[1-4]。因此,研究安全有效的抗炎藥物具有重要的意義。

核因子κB是炎癥反應(yīng)中的重要信號通路,激活核因子κB可誘導(dǎo)如白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)、環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)等炎癥介質(zhì)的表達[5],阻斷核因子κB的活化,可以抑制炎癥介質(zhì)的表達,發(fā)揮抗炎作用。因此,抑制核因子κB信號通路是開發(fā)抗炎藥物的重要靶點。

刺槐素(Acacetin)是一種天然黃酮類藥物,可從多種植物中提取獲得,具有多種藥理作用[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),刺槐素可以抑制炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達,對炎癥疾病如支氣管炎、哮喘、肺損傷、腸炎等具有保護作用,但是刺槐素的抗炎作用機制還不明確[7-10]。因此我們用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞,研究刺槐素是否通過抑制核因子κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細(xì)胞 采用6～8周C57BL/6J小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞。小鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)提供(許可證號:SCXK(新)2018-0002;倫理批號:KY2020041050),飼養(yǎng)在通風(fēng)良好、溫度、濕度適宜的環(huán)境中,自由飲水及進食。分離骨髓巨噬細(xì)胞,加入含10%胎牛血清(Fatal Bovine Serum,FBS)及1%雙抗的杜氏改良培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modification of Eagle′s Medium,DMEM)(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)7～8 d,細(xì)胞生長匯合至80%后進行實驗。

1.1.2 藥物 刺槐素(sigma公司,美國,貨號:00017,批號:BCBT8459,二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)配置為10 mmol/L的母液,用于稀釋成不同濃度的工作液)。

1.1.3 試劑與儀器 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor,GM-CSF)(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P00184)、LPS(sigma公司,美國,L2630);DMEM(高糖)培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗(10 000U)(GIBCO公司,美國,貨號分別為:C11965500BT,15140-122);FBS(中國Excell Bio公司,貨號:FND500);CCK-8試劑盒(APExBIO公司,美國,貨號:K1018);核因子κB p65、磷酸化核因子κB p65(Phosphonated NF-κB p65,p-NF-κB p65,p-p65)、核因子κB抑制蛋白α(Inhibitor of Nuclear Factor kappa B Alpha,IκBα)抗體(Abcam公司,美國,貨號分別為:ab32536,ab76302,ab32518);磷酸化-IκBα(Phosphonated IκBα,p-IκBα)抗體(CST公司,美國,貨號:5209s);二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法蛋白定量試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司,貨號:DQ111-01);山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Abcam公司,美國,貨號:ab150077);臺式離心機(上海力申科學(xué)儀器有限公司,型號:Neofuge),酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司,型號:xMarkTM),化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司,型號:Chemiscope 3000),蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司,美國,型號:Mini-PROTEAN Tetra system),電泳儀(北京六一生物科技有限公司,型號:DYCZ-24DN),電子天平(Sartorius公司,德國,型號:CP324S),脫色搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司,型號:TS-3D),共聚焦顯微鏡(卡爾蔡司光學(xué)有限公司,德國,型號:LSM700)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測刺槐素對小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的毒性作用 將細(xì)胞接種于96孔板,每孔4×103個細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中孵育12 h。加入不同濃度(5 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L)的刺槐素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。設(shè)定5個平行組,24 h后,每孔加入10 μL的CCK8試劑,放置培養(yǎng)箱孵育1 h,酶標(biāo)儀(450 nm)測吸光度值(A)。根據(jù)公式:細(xì)胞活力(%)=(各濃度給藥組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%,計算細(xì)胞增殖情況。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果,選擇10 μmol/L刺槐素作為后續(xù)研究劑量。

1.2.2 分組與模型制備 1)空白對照組:正常培養(yǎng)相應(yīng)時間;2)LPS(10 min)組:LPS(50 ng/mL)預(yù)刺激10 min;3)LPS(10 min)+刺槐素(10 μmol/L)組:LPS(50 ng/mL)預(yù)刺激10 min,隨后用刺槐素(10 μmol/L)處理0.5 h;4)LPS(30 min)組:LPS(50 ng/mL)預(yù)刺激30 min;5)LPS(30 min)+刺槐素(10 μmol/L)組:LPS(50 ng/mL)預(yù)刺激30 min,隨后用刺槐素(10 μmol/L)處理0.5 h;6)LPS(60 min)組:LPS(50 ng/mL)預(yù)刺激60 min;7)LPS(60 min)+刺槐素(10 μmol/L)組:LPS(50 ng/mL)預(yù)刺激60 min,隨后用刺槐素(10 μmol/L)處理0.5 h。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 蛋白免疫印跡檢測核因子κB p65、p-核因子κB p65、IκBα和p-IκBα:收集細(xì)胞,提取總蛋白,用BCA法蛋白定量。計算30 μg蛋白所用體積。電泳條件:濃縮膠80 V,分離膠100 V。電泳結(jié)束后,將膠上蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜上。核因子κB p65、p-核因子κB p65、IκBα、p-IκBα及β-肌動蛋白(β-actin)使用0.45 μmol/LPVDF膜,轉(zhuǎn)膜時間為60 min。轉(zhuǎn)印后的膜用封閉劑(5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA),三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)配制)在室溫下封閉2 h,將膜分別加核因子κB p65(1∶800)、p-核因子κB p65(1∶800)、IκBα(1∶1 000)及p-IκBα(1∶800)。4 ℃孵育過夜。TBST洗滌10 min×3次,加入相應(yīng)的二抗抗體(1∶5 000),室溫下孵育2 h。TBST洗滌10 min×3次,將化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液按1∶1比例配制,均加2 mL至膜上,用化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照。以目的基因條帶吸光度與β-actin條帶吸光度比值計算相對表達量。

激光共聚焦觀察核因子κB核轉(zhuǎn)位情況:調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL,滴加200 μL于黏附性載玻片上,干預(yù)完成后取出載玻片,用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗滌3次,2 min/次;4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗滌3次,2 min/次;0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)處理5 min,PBS洗滌3次,2 min/次;1%BSA室溫封閉30 min,甩干封閉液;滴加80 μL濃度為2 μg/mL的核因子κB p65抗體,每張片子滴加一種抗體;37 ℃孵育2 h,PBS洗滌3次,2 min/次;滴加80 μL濃度為2 μg/mL的山羊抗兔IgG二抗,37 ℃避光孵育1 h,PBS洗滌3次,2 min/次;滴加80 μL濃度為1 μg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI),室溫避光孵育5 min,PBS洗滌3次,2 min/次;50%甘油封片,激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 刺槐素對小鼠骨髓巨噬細(xì)胞增殖活性的影響 0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L刺槐素處理后巨噬細(xì)胞存活率分別為(100.000±18.962)%、(104.074±6.691)%、(102.263±17.242)%、(93.210±12.655)%和(82.654±16.156)%,各組間細(xì)胞存活率比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 刺槐素對核因子κB信號通路的影響 各組細(xì)胞中的核因子κB p65、IκBα的蛋白表達水平?jīng)]有差異。與空白對照組比較,LPS刺激10 min,30 min和60 min組的p-p65、p-IκBα表達水平均顯著上調(diào)(均P<0.05);與LPS(10 min)組比較,LPS(10 min)+刺槐素組p-IκBα表達顯著降低(P<0.01);與LPS(30 min)組比較,LPS(30 min)+刺槐素組p-p65(P<0.01)、p-IκBα均顯著降低(P<0.05);與LPS(60 min)組比較,LPS(60 min)+刺槐素組p-p65(P<0.05)、p-IκBα均顯著降低(P<0.001)。見圖1,表1。

表1 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中p-p65,p65,p-IκBα和IκBα的表達

圖1 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中p-p65,p65,p-IκBα和IκBα的表達(n=3)

2.3 刺槐素對核因子κB核轉(zhuǎn)位的影響 激光共聚焦結(jié)果顯示，空白對照組核因子κB p65(綠色)廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)中，未見分布于細(xì)胞核(藍色)；當(dāng)LPS刺激后，可觀察到大量的核因子κB p65定位于細(xì)胞核上，表明LPS促進核因子κB p65激活轉(zhuǎn)位入核；刺槐素處理后LPS介導(dǎo)的核因子κB p65定位于細(xì)胞核的蛋白水平顯著降低。見圖2。

圖2 刺槐素對核因子κB核轉(zhuǎn)位的影響(免疫熒光染色,×200)

3 討論

刺槐素具有抗氧化作用和抗炎作用,SUN等[11]研究發(fā)現(xiàn)刺槐素可調(diào)節(jié)iNOS,COX-2,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和血紅素加氧酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1),降低炎癥介質(zhì)分泌對肺損傷發(fā)揮保護作用。HUANG和LIOU[7]發(fā)現(xiàn)刺槐素可明顯減少支氣管炎細(xì)胞中的IL-6、IL-8、細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1)、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1,對支氣管炎具有保護作用。CHEN等[8]發(fā)現(xiàn)刺槐素可抑制p38和C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal Kinase,JNK)的磷酸化,減少基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Matrix Metalloproteinase-1,MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3,MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(Matrix Metalloproteinase-13,MMP-13)的表達,對關(guān)節(jié)炎具有保護作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)刺槐素可以抑制Toll樣受體4(Toll-like Receptor 4,TLR4)/核因子κB/NOD樣受體熱蛋白3(NOD-like Receptor 3,NLRP3)信號通路,減少炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α的表達,對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[12];同時發(fā)現(xiàn)刺槐素可以通過抑制NLRP3信號通路減少老年斑的形成,改善阿爾茨海默病小鼠模型的記憶能力[13]。雖然較多研究表明刺槐素能發(fā)揮抗炎作用,在細(xì)胞實驗或動物實驗中對炎癥疾病具有預(yù)防作用,但其抗炎作用還需要進一步闡明[14-16]。本研究中我們進一步在體外運用LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,探討刺槐素的抗炎作用。我們用不同濃度的刺槐素處理小鼠骨髓巨噬細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)刺槐素對小鼠骨髓巨噬細(xì)胞具有低毒性,結(jié)合課題組前期研究結(jié)果,我們選定刺槐素濃度為10 μmol/L。

炎癥是一種涉及多種化學(xué)介質(zhì)和信號通路參與的關(guān)鍵反應(yīng),與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。巨噬細(xì)胞是對抗外源性病原體的炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞,具有病原體相關(guān)分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern,PAMP)受體,如Toll樣受體(Toll-like Receptors,TLRs)和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation Endproduct,RAGE),能夠識別細(xì)胞外抗原,如LPS。與巨噬細(xì)胞PAMP受體結(jié)合后,LPS觸發(fā)參與炎癥爆發(fā)的不同細(xì)胞內(nèi)信號通路,通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與了多種炎癥疾病過程[17-19]。LPS的促炎作用可通過核因子κB依賴的轉(zhuǎn)錄激活介導(dǎo)[20],并且我們前期研究發(fā)現(xiàn)刺槐素可抑制NLRP3炎癥小體的活化[21],而NLRP3炎癥小體活化的啟動階段可由核因子κB介導(dǎo),因此我們研究了刺槐素的抗炎作用是否與抑制核因子κB有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著LPS時間的推移,核因子κB p65的磷酸化水平顯著增加,給予刺槐素治療后,能顯著降低p65的磷酸化;我們進一步通過激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)刺槐素可以抑制核因子κB的核轉(zhuǎn)位。

核因子κB的活性受核因子κB抑制因子(Nuclear Factor κB Inhibitory Factor,IκB)調(diào)控,在細(xì)胞靜息狀態(tài),它們以二聚體的形式與IκB蛋白結(jié)合,保持無活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)[22]。LPS被巨噬細(xì)胞的TLR4識別,激活I(lǐng)κB磷酸化,促進IκB從核因子κB p50/p65二聚體上解離,解離的p50/p65轉(zhuǎn)位入核后啟動炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著LPS時間的推移,IκB的磷酸化水平顯著增加,給予刺槐素治療后,能顯著降低IκB的磷酸化。

綜上所述,本研究證實刺槐素的抗炎作用與調(diào)控核因子κB信號通路,抑制核因子κB核轉(zhuǎn)位有關(guān),為進一步認(rèn)識刺槐素的藥理作用提供了理論依據(jù)。關(guān)于刺槐素如何調(diào)控核因子κB信號通路,發(fā)揮抗炎作用還需要進一步研究。

利益沖突聲明:無。