李思敏 張 杰 宋曉雨 王 旭

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,鄭州,450046; 2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州,450000)

認(rèn)知功能障礙疾病是一類能夠影響患者認(rèn)知功能疾病的統(tǒng)稱,根據(jù)認(rèn)知損害程度不同可分為輕度認(rèn)知功能障礙(Mild Cognitive Impairment,MCI)和癡呆。阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)和血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)是老年人最常見的認(rèn)知障礙疾病,嚴(yán)重威脅老年人身心健康,降低老年人生命質(zhì)量且加劇社會負擔(dān)[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國60歲及以上人群癡呆患病率為6.0%,其中AD為3.9%,VD為1.6%[2]。目前上市治療癡呆的藥物僅在疾病早期具有較好療效,長期使用效果不佳,并不能有效阻止病情的發(fā)展。因此,深入研究其發(fā)病機制及中藥干預(yù)的靶點和機制能夠為臨床治療認(rèn)知障礙疾病提供依據(jù)。

認(rèn)知障礙在中醫(yī)學(xué)屬于“呆癥”“健忘”范疇,其病因主要責(zé)之腎精虧虛,痰濁瘀血阻竅[3]。20世紀(jì)初,癡呆“啟動于腎虛,進展于痰瘀火,惡化于虛極毒盛”的病機假說被提出,補腎則是最基本的治療原則,貫穿整個疾病過程[4]。通過對中醫(yī)藥治療癡呆的古今醫(yī)案進行數(shù)據(jù)挖掘,證明石菖蒲和熟地黃是治療癡呆的高頻藥物,同時也是核心藥對[5-6]。石菖蒲始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有化濕開胃、開竅豁痰、醒腦益智的功效,是古方里治療老年癡呆癥的常用藥,可減少神經(jīng)元凋亡、抗氧化應(yīng)激、抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)等[7-8]。《本草綱目》中記載熟地黃能填骨髓、生精血,為養(yǎng)血滋陰、補精益髓良藥,具有調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)與受體的表達、抗氧化、抗衰老等作用[9]。熟地黃補血養(yǎng)陰、填精益髓,兼能補血;石菖蒲開竅醒神、益智化痰,亦能安神,二者配伍合用,能從病機上改善癡呆患者髓海不足、氣血虧虛的癥狀,同時也能開竅豁痰,達到標(biāo)本兼顧、虛實同治的效果。故本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)知識篩選石菖蒲-熟地黃對認(rèn)知障礙疾病的有效成分、作用靶點和相關(guān)通路,并通過實驗驗證,全面探究藥物與疾病存在的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 石菖蒲-熟地黃藥對有效成分篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索石菖蒲、熟地黃的化學(xué)成分,以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18為條件篩選出藥物有效成分[10];結(jié)合文獻報道對其有效成分進行補充和完善,盡可能多地收集藥物的有效成分[11-12]。

1.2 藥物有效成分潛在靶點預(yù)測與篩選 在TCMSP檢索藥物有效成分有關(guān)的潛在靶蛋白,將候選的藥物有效成分與其潛在的靶點進行整理,然后在Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中,選擇已驗證的,物種來源為Human的基因,將靶點蛋白名轉(zhuǎn)換成基因名。

1.3 認(rèn)知障礙疾病相關(guān)靶點的獲取 在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org/)及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org/)中分別以“cognitive dysfunction”“cognitive impairment”為關(guān)鍵詞進行檢索,物種選擇“人類”,整合后去掉重復(fù)值,篩選相關(guān)性得分≥6的基因,得到認(rèn)知障礙疾病相關(guān)靶點。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了更直觀反應(yīng)藥物、有效成分、疾病之間的關(guān)系,運用Cytoscape(3.7.1)(http://cytoscapeweb.cytoscape.org/)軟件,構(gòu)建“有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,再將共有基因?qū)隨TRING(www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖,節(jié)點之間的相互關(guān)系用邊來表示,利用Cytoscape作圖,并使用其Network Analysis插件對相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進行拓撲性質(zhì)分析。

1.5 靶點通路富集分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)將篩選矯正后的靶點導(dǎo)入,選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”提交后設(shè)定物種為Homo sapiens獲得基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析中生物過程(Biologial Process,BP)、分子功能(Molecular Fuction,MF)、細胞組分(Cellular Component,CC)以及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路富集,并通過微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)平臺對其富集結(jié)果進行可視化,結(jié)果分別以氣泡圖和表格展示。

1.6 動物實驗驗證

1.6.1 材料與方法

1.6.1.1 動物 于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司購入60只體質(zhì)量(210±10)g的6～8周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級健康雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠(實驗動物合格證號SCXK(魯)20190003)。所有動物飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院中心實驗室,溫度21～23 ℃、濕度60%、12 h循環(huán)照明,讓其自由攝食、飲水。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批(倫理審批號:PZ-HNSZYY-2022-007)。

1.6.1.2 藥物 熟地黃顆粒(批號:21040059)、石菖蒲顆粒(批號:20120086),均由河南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。根據(jù)《中華人民共和國藥典》及結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗稱取熟地黃、石菖蒲比例為3∶2免煎顆粒劑,純水配制后于-20 ℃冰箱保存。甘露特納膠囊(上海綠谷制藥有限公司,批號:210106)。

1.6.1.3 試劑與儀器 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(北京索萊寶科技有限公司,批號:820F036)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號:E-EL-R2856c)、兔抗白細胞介素(Interleukin-6,IL-6)(Immunoway,美國,批號:YT5348)、兔抗Toll樣受體4(Toll-like Receptor 4,TLR4)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:19811-1-AP)、兔抗核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)p65(Cell Signaling,美國,批號:8242)、兔抗p-NF-κB p65(Cell Signaling,美國,批號:3031)、鼠抗β-actin(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:YM3029)、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:SA00001-2)、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:SA00001-1);腦立體定位儀(瑞沃德生命科技有限公司,型號:68537型)、高速離心機(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份有限公司,型號:D3024型)、高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司,型號:KZ-II型)、全波長酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司,美國,型號:Multiskan GO型)、垂直電泳槽(BioRad,美國,型號:Mini-PROTEAN型)、電泳轉(zhuǎn)印儀(BioRad,美國,型號:Mini Trans-Blot型)、掃描儀(尼康映像儀器銷售有限公司,日本,型號:LiDE300型)、Morris水迷宮設(shè)備(上海欣軟信息科技有限公司,型號:XR-XM101型)。

1.6.2 方法

1.6.2.1 分組與模型制備 采用隨機數(shù)字法將60只大鼠分成假手術(shù)組,模型組,石菖蒲-熟地黃低、中、高劑量組,甘露特納膠囊組,每組10只。參考文獻[13-14],采用雙側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)中樞神經(jīng)炎癥損傷的認(rèn)知障礙模型。將大鼠用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后固定于腦立體定位儀上,清理頭頂毛發(fā)并用聚維酮碘消毒,切開顱頂正中處皮膚,鈍性分離暴露顱骨板。以前囟為坐標(biāo)原點,于前囟中線后1.0 mm,左右旁開1.6 mm,深3.6 mm于側(cè)腦室各鉆一小孔,以1 μL/min的速度將LPS(5 μg/μL,10 μL)緩緩注入,留針10 min,緩慢退針防止漏液,聚維酮碘消毒后縫合傷口,假手術(shù)組注射等量生理鹽水。術(shù)后給予青霉素鈉涂抹傷口,連續(xù)3 d。

1.6.2.2 給藥方法 側(cè)腦室注射3 d后開始灌胃給藥,根據(jù)人和動物體表面積換算公式,以中劑量為臨床等效劑量,石菖蒲-熟地黃低、中、高劑量組給藥濃度分別為1.3 g/kg、2.6 g/kg、5.2 g/kg,甘露特納膠囊組給藥濃度為93.75 mg/kg,假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水,1次/d,連續(xù)8周。

1.6.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1)Morris水迷宮實驗:本實驗在直徑120 cm的水池中進行,平臺直徑15 cm,攝像頭置于水池中央正上方,水面高于平臺1～2 cm,水溫維持在(25±0.5)℃,水中倒入墨汁,使平臺隱藏,水池壁邊緣均勻放置4個不同形狀物件作為空間參照物,并將水池劃分為4個象限。前5 d分別將各組大鼠從4個象限沿水池壁放入,設(shè)置大鼠游泳時間為2 min,軟件自動記錄大鼠游泳軌跡以及找到平臺時間并記為潛伏期。第6天撤平臺,于平臺對側(cè)象限任一入水點放入大鼠,記錄大鼠在2 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)和原平臺象限停留時間,以此評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶力。2)ELISA檢測大鼠血清TNF-α含量:腹主動脈采血后靜置2 h,于4 ℃ 3 000 r/min,離心半徑10 cm,離心15 min后取上清液,分裝后放-80 ℃冰箱保存。按照試劑盒說明書進行操作。3)蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測相關(guān)蛋白含量:末次行為學(xué)實驗結(jié)束后,10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉后斷頭處理,冰上快速分離出海馬組織存于凍存管,-80 ℃冰箱保存。使用時取海馬組織解凍后加入裂解液,于勻漿器勻漿,冰上裂解1 h后4 ℃ 12 000 r/min,離心半徑10 cm,離心15 min,二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法測定蛋白濃度,根據(jù)蛋白分子量大小配制適合濃度的膠后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌、孵一抗(TLR4 1∶1 000、NF-κB p65 1∶1 000、p-NF-κB p65 1∶1 000、IL-6 1∶1 000、β-actin 1∶10 000),孵二抗(1∶10 000)、洗膜、顯影。

2 結(jié)果

2.1 石菖蒲-熟地黃有效成分獲取 TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到石菖蒲有效成分105個,熟地黃化學(xué)成分76個。結(jié)合文獻進行補充,最終篩選出石菖蒲-熟地黃藥對中26個有效成分。見表1。

表1 石菖蒲與熟地黃有效成分

2.2 認(rèn)知功能障礙疾病靶點的獲取結(jié)果 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到認(rèn)知功能障礙相關(guān)靶點10 571個,篩選后得到1 735個認(rèn)知功能障礙疾病候選靶點基因,與OMIM中得到的疾病基因取并集,最終得到1 881個疾病靶點基因。

2.3 “有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 “有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)對應(yīng)18個有效成分。根據(jù)Degree值(表示每個節(jié)點相互關(guān)聯(lián)個數(shù)),Degree值較高的化合物有山柰酚(Kaempferol)、8-異戊烯基山柰酚(8-Isopentenyl-kaempferol)、β-細辛醚(β-asarone)、梓醇(Catalpol)、豆甾醇(Stigmasterol)。這些化合物可能是石菖蒲-熟地黃藥對治療認(rèn)知功能障礙疾病的關(guān)鍵化合物。見圖1。

圖1 石菖蒲-熟地黃藥對治療認(rèn)知功能障礙的“有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將共有基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。共涉及63個節(jié)點,404條邊,節(jié)點表示靶蛋白,邊表示蛋白間相互作用關(guān)系,節(jié)點的大小和顏色與Degree值成正比,越接近橙色度值越高,邊的寬度和顏色與此邊連接的2個節(jié)點間的互相作用的關(guān)系強弱成正比。根據(jù)Degree值進行排列,發(fā)現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的靶蛋白分為蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)1、IL-6、TNF、Jun原癌基因(Jun Proto-oncogene,JUN)、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、FOS原癌基因(Fos Proto-oncogene,FOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合合酶(Nitric Oxide Synthase 3,NOS3)、雌激素受體1(Estrogen Receptor 1,ESR1)、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2(Prostaglandin Synthase 2,PTGS2)、NFκB抑制因子(NF-κB Inhibitor Alpha,NFκBIA)。見圖2。

圖2 靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 石菖蒲-熟地黃藥對治療認(rèn)知功能障礙的潛在作用靶點的GO分析

KEGG通路富集結(jié)果顯示,石菖蒲-熟地黃治療認(rèn)知功能障礙關(guān)鍵靶標(biāo)所參與的通路主要涉及AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、阿爾茨海默病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、多巴胺能突觸通路、Toll樣受體通路、NF-κB信號通路等,可認(rèn)為是石菖蒲-熟地黃治療認(rèn)知功能障礙的核心通路。前15條通路見圖3,表2。

表2 KEGG富集分析潛在相關(guān)通路靶點(前15條)

2.6 實驗結(jié)果驗證

2.6.1 對認(rèn)知障礙模型大鼠Morris水迷宮實驗的影響

2.6.1.1 定位航行實驗結(jié)果 在定位航行實驗中,

各組大鼠逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)推移呈遞減趨勢。模型組和假手術(shù)組從第3天起差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在第3、4、5天,與模型組比較,石菖蒲-熟地黃中、高劑量組與甘露特納膠囊組逃避潛伏期顯著縮短,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。石菖蒲-熟地黃低劑量組從第4天起開始與模型組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。其中石菖蒲-熟地黃高劑量組效果最佳,但與甘露特納膠囊組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠定位航行平均逃避潛伏期比較

2.6.1.2 空間探索實驗結(jié)果 在第6天撤平臺后的空間探索實驗中,與假手術(shù)組比較,模型組在原平臺象限停留時間和穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05);石菖蒲-熟地黃中、高劑量組以及甘露特納膠囊組在原平臺象限停留時間和穿越平臺次數(shù)與模型組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);石菖蒲-熟地黃低劑量組與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。石菖蒲-熟地黃高、中、低劑量組與甘露特納膠囊組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠空間探索實驗結(jié)果比較

2.6.2 石菖蒲-熟地黃對大鼠血清TNF-α表達水平的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,石菖蒲-熟地黃中、高劑量組以及甘露特納膠囊組大鼠血清TNF-α水平顯著降低(均P<0.05)。石菖蒲-熟地黃高、中、低劑量組與甘露特納膠囊組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表5。

表5 石菖蒲-熟地黃對認(rèn)知障礙大鼠血清TNF-α表達水平的影響

2.6.3 石菖蒲-熟地黃對大鼠海馬區(qū)TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6表達的影響 結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬組織中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6蛋白表達量上升(均P<0.05);與模型組比較,石菖蒲-熟地黃低、中、高劑量組以及甘露特納膠囊組海馬組織中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6表達量均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與甘露特納膠囊組比較,石菖蒲-熟地黃中、高劑量組大鼠海馬IL-6表達降低(均P<0.05),TLR4、p-核因子κB p65/核因子κB p65無明顯差異。見圖4,表6。

圖4 海馬組織中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-6的蛋白條帶

表6 石菖蒲-熟地黃對認(rèn)知障礙大鼠TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6表達的影響

3 討論

機體防御感染以及修復(fù)損傷的過程稱為炎癥,是一種保護性反應(yīng),但過度強烈的炎癥和持續(xù)的慢性炎癥與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。神經(jīng)炎癥已被證實參與調(diào)節(jié)與學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能障礙相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如AD、帕金森病(Parkinson′s Disease,PD)等的發(fā)病發(fā)展過程[16]。石菖蒲能夠通過抗炎、清除Aβ、調(diào)控膽堿能系統(tǒng)、增強突觸可塑性、抗氧化等作用改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶力[17]。臨床上常用于治療認(rèn)知功能障礙含石菖蒲-熟地黃藥對的中藥復(fù)方,如地黃飲子、地黃益智方、腦還丹等,被證實可通過抑制海馬神經(jīng)元凋亡、減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷等途徑改善大鼠學(xué)習(xí)記憶力[18-20]。本課題組前期研究表明,以石菖蒲-熟地黃為主藥的補腎通絡(luò)方可上調(diào)磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)通路的活性,抑制淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)的表達和細胞凋亡,促進突觸損傷修復(fù),調(diào)節(jié)突觸可塑性,起到神經(jīng)保護作用[21]。以上研究結(jié)果表明,石菖蒲-熟地黃藥對在治療認(rèn)知功能障礙中具有潛在的價值,本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)知識進行預(yù)測并對結(jié)果進行實驗驗證,探討其治療認(rèn)知功能障礙的可能作用機制。

通過數(shù)據(jù)庫篩選,以及相關(guān)文獻對中藥的主要化合物予以補充,獲得“石菖蒲-熟地黃”藥對作用于認(rèn)知功能障礙的核心有效成分山柰酚、8-異戊烯基山柰酚、β-細辛醚、梓醇、豆甾醇等。其中石菖蒲的有效成分中山柰酚活性最高,熟地黃有效成分中梓醇活性最高。既往研究表明,山柰酚和豆甾醇具有很好的抗炎和抗氧化的作用,另外山柰酚還有抗抑郁、抗驚厥、抗癡呆等作用[22-23]。其可通過抑制NF-κB通路的激活、下調(diào)p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)位、抑制小膠質(zhì)細胞激活從而抑制炎癥介質(zhì)[IL-6、誘生型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)、環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和TNF-α]的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激,進而改善Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷[24]。構(gòu)建的有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)表明石菖蒲-熟地黃通過多成分作用于多個靶點,山柰酚可能通過CASP3、TNF、AKT1、IL-6、B細胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma 2,Bcl-2)等靶點起作用,而CASP3也同時受到梓醇、桃葉珊瑚苷、豆甾醇等成分的影響。梓醇可通過下調(diào)BCL2關(guān)聯(lián)X蛋白(BCL2-Associated X,Bax),上調(diào)Bcl-2的表達,來抑制海馬神經(jīng)細胞的凋亡,從而改善學(xué)習(xí)記憶力[25]。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)石菖蒲-熟地黃治療認(rèn)知功能障礙可能與對藥物的反應(yīng)、對LPS的反應(yīng)、化學(xué)突觸傳遞、衰老、記憶、興奮性突觸后電位等過程密切相關(guān)。近年來大量研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)炎癥在認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[26]。PATLOLA等[27]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)[IL-6、IL-1β、TNF-α以及C反應(yīng)蛋白(C-reactive Protein,CRP)]水平升高與認(rèn)知障礙密切相關(guān)。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁組成成分,為一種常見內(nèi)毒素,是常用的神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)劑。通過腦室注射LPS,與脂多糖結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide Binding Protein,LBP)結(jié)合,作用于TLR4/CD14炎癥復(fù)合體進而激活其下游IKKα/β、NF-κB炎癥信號通路,促使小膠質(zhì)細胞和TNF-α、COX-2、iNOS、IL-1β等炎癥介質(zhì)活化,在老年斑附近過度表達,引發(fā)中樞神經(jīng)炎癥,導(dǎo)致海馬突觸功能障礙、神經(jīng)抑制和神經(jīng)元細胞死亡[28]。ZHOU等[29]實驗證明二甲雙胍通過阻斷NF-κB通路從而減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠突觸功能障礙和認(rèn)知障礙。故本文實驗部分采用雙側(cè)腦室注射LPS來誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥引起的認(rèn)知障礙損傷模型。

KEGG富集得到石菖蒲-熟地黃治療認(rèn)知功能障礙關(guān)鍵靶標(biāo)所參與的通路主要涉及AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、Toll樣受體通路、NF-κB信號通路等。AGEs為晚期糖基化終末產(chǎn)物,RAGE為其受體,二者水平和癡呆的病理生理過程有關(guān)[30]。AGE和高遷移率族蛋白B1(High Mobility Group Protein B1,HMGB1)通過與RAGE結(jié)合,促進TLR2和TLR4的表達以及NF-κB核轉(zhuǎn)位,導(dǎo)致神經(jīng)炎癥并加重血腦屏障(Blood-brain Barrier,BBB)損傷[31]。IL-17是經(jīng)典的炎癥啟動因子,與細胞表面受體結(jié)合激活下游通路,誘導(dǎo)分泌TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥介質(zhì)。Toll樣受體是啟動先天性和適應(yīng)性免疫通路的模式識別受體家族,主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)駐留巨噬細胞或小膠質(zhì)細胞上表達,是神經(jīng)炎癥反應(yīng)常見的上游蛋白[32]。TLR4主要激活髓樣分化因子(Myeloid Differentiation Factor88,MyD88)依賴的通路和含TIR結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)β干擾素(TIR-domain-containing Adaptor Inducing Interferon-β,TRIF)通路[33]。其中MyD88依賴途徑由MyD88和含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接體蛋白(TIR Domain-containing Adaptor Protein,TIRAP)介導(dǎo),可誘導(dǎo)NF-κB易位和炎癥介質(zhì)(如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6)及Ⅰ型干擾素基因(如TNF、IL-12)的表達[34]。NF-κB作為TLR4信號通路的下游重要因子,在靜息狀態(tài)下與核因子抑制蛋白IκB結(jié)合表現(xiàn)為無活性狀態(tài),當(dāng)其被TLR4復(fù)合物激活后,與IκB脫離并進入細胞核,最終啟動其活性亞基NF-κB p65和NF-κB p50(以NF-κB p65為主)誘導(dǎo)釋放各種炎癥介質(zhì)[35]。因此,猜測石菖蒲-熟地黃可能通過TLR4/NF-κB這條經(jīng)典炎癥通路來改善認(rèn)知功能障礙,為此進行Morris水迷宮實驗觀察該藥對對大鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響,并對該通路的主要蛋白進行驗證。水迷宮結(jié)果顯示石菖蒲-熟地黃中、高劑量能有效改善雙側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶力障礙;ELISA結(jié)果表明石菖蒲-熟地黃中、高劑量能顯著降低大鼠血清TNF-α水平(均P<0.05);Western Blotting結(jié)果顯示,石菖蒲-熟地黃低、中、高劑量組能顯著降低認(rèn)知障礙模型大鼠海馬組織中TLR4、p-核因子κB p65/核因子κB p65、IL-6含量(均P<0.05。以上實驗結(jié)果表明,石菖蒲-熟地黃藥對可改善LPS誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶力和認(rèn)知功能,可能通過TLR4/NF-κB信號通路抑制炎癥介質(zhì)的釋放,改善神經(jīng)炎癥從而達到治療作用。

綜上所述,本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及動物實驗初步驗證了石菖蒲-熟地黃可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路,減少炎癥介質(zhì)釋放來改善中樞神經(jīng)炎癥所致認(rèn)知障礙模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶力,為石菖蒲-熟地黃治療認(rèn)知障礙疾病提供理論支持,但后續(xù)仍需要更多基礎(chǔ)實驗來探討石菖蒲-熟地黃治療認(rèn)知障礙的具體作用機制。

利益沖突聲明:無。