李 楊,楊 眉,徐 緩,雷 松

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)水平的提高,腎穿刺活檢術(shù)開(kāi)展得越來(lái)越廣泛,已成為明確腎臟疾病性質(zhì)和病理類型的重要檢查方法,這對(duì)確定疾病的治療方案和預(yù)后判斷有重要意義[1]。然而,腎活檢涉及的幾種病理檢查方法在組織取材大小、所需觀察腎小球數(shù)量以及固定保存方法等均存在顯著差異,因此對(duì)腎活檢病理組織取材有較高的要求。目前,腎活檢病理組織取材均是在穿刺室現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行,受多種因素影響導(dǎo)致組織取材失誤較多。為此,本實(shí)驗(yàn)嘗試使用UW器官保存液(UW液)在低溫浸泡條件下轉(zhuǎn)運(yùn)新鮮腎活檢組織到病理室集中進(jìn)行規(guī)范化取材,以避免病理取材失誤問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取我院行腎活檢穿刺、經(jīng)體視鏡觀察穿刺組織中腎小球較充分的樣本40例,其中一部分組織按常規(guī)腎活檢病理取材,設(shè)為對(duì)照組;在保證臨床病理檢查的基礎(chǔ)上,剩余的腎組織作為實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組在4 ℃預(yù)冷UW液中浸泡保存,浸泡時(shí)間分別為2 h、8 h、24 h和48 h,每組各10份樣本。

1.2 保存溶液器官保存液(UW液-ViaSpan),百時(shí)美施貴寶公司生產(chǎn),無(wú)菌分裝至1.5 mL試管中,每管1 mL,4 ℃存放。

1.3 方法

1.3.1取材 UW液浸泡后的各實(shí)驗(yàn)組樣本取材同對(duì)照組一致,光鏡檢查樣本用10%福爾馬林固定;電鏡檢查樣本用戊二醛固定;免疫熒光檢查樣本用OCT冷凍劑冷凍包埋。

1.3.2切片及染色 光鏡檢查標(biāo)本按常規(guī)病理組織制樣處理,石蠟切片分別進(jìn)行HE、過(guò)碘酸-雪夫氏(PAS)、Masson三色和過(guò)碘酸六胺銀(PASM)染色;免疫熒光檢查樣本經(jīng)冷凍切片后,進(jìn)行IgA、IgG、IgM、C3、C4、C1q、κ和λ直接免疫熒光染色;電鏡檢查按常規(guī)組織電鏡制樣處理。石蠟HE切片及特殊染色切片使用普通光學(xué)顯微鏡觀察;免疫熒光染色切片使用OLUMPUS BX41熒光顯微鏡觀察;超薄切片使用日立H-7650型透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

光鏡HE觀察結(jié)果：2 h組腎小球和腎小管各組織結(jié)構(gòu)保存良好,與對(duì)照組比較差別不明顯;8 h組腎小管少量上皮細(xì)胞腫脹、脫落;24 h組腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死較8 h組明顯,但對(duì)觀察腎小管及間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化程度等病變影響不明顯;48 h組腎小管上皮細(xì)胞脫落、壞死加重,灶性小管基底帶裸露,腎小球部分結(jié)構(gòu)較模糊(圖1)。

圖1 光鏡HE結(jié)果：A.對(duì)照組;B. 2 h組;C. 8 h組;D. 24 h組;E. 48 h組 圖2 電鏡結(jié)果：A.對(duì)照組;B. 2 h組;C. 8 h組;D.24 h組;E. 48 h組 圖3 特殊染色：A.24 h組PAS染色;B.Masson染色;C.PASM染色

電鏡觀察結(jié)果：2 h組腎小球各組織結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存良好,與對(duì)照組差異不明顯;8 h組雖有部分腎小球亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕度腫脹,但對(duì)觀察腎小球疾病超微結(jié)構(gòu)的改變影響不明顯,如腎小球各結(jié)構(gòu)增生情況,基底膜厚度,足突融合程度,以及電子致密物和異常結(jié)構(gòu)物質(zhì)沉積部位、多少及形狀等;24 h組部分病例腎小球亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存狀態(tài)與8 h組相似,但部分病例亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)腫脹、破壞較明顯,對(duì)腎小球疾病的觀察有一定影響;盡管48 h組部分病例仍能觀察到電子致密物沉積部位,但是腎小球各組織結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞較重,因此不適合進(jìn)行腎小球疾病相關(guān)超微結(jié)構(gòu)變化的觀察(圖2)。

特殊染色顯示各組腎組織結(jié)構(gòu)、病變結(jié)構(gòu)和特殊成分均能正常著色,不受UW液浸泡時(shí)間影響。以24 h組為例,PAS染色基底膜、小球囊壁及其他PAS陽(yáng)性物質(zhì)呈紅色;Masson染色免疫復(fù)合物呈紅色、膠原纖維呈綠色;PASM染色基底膜和小球囊壁呈黑色、免疫復(fù)合物呈紅色(圖3)。

免疫熒光結(jié)果顯示各組抗體標(biāo)記陰/陽(yáng)性及強(qiáng)弱表達(dá)不受UW液浸泡時(shí)間影響。以24 h組為例,膜性腎病組織抗體表達(dá)結(jié)果：IgG在腎小球基底膜呈線性、細(xì)顆粒狀高亮度表達(dá),κ和λ表達(dá)強(qiáng)度次之,C3弱表達(dá),IgA、IgM、C4和C1q為陰性,與同病例對(duì)照組免疫熒光抗體表達(dá)結(jié)果一致(圖4)。此外,狼瘡性腎炎多數(shù)熒光抗體在腎小球系膜區(qū)和基底膜均有較高強(qiáng)度表達(dá),呈“滿堂亮”現(xiàn)象;而糖尿病腎病、微小病變性腎病則熒光抗體表達(dá)全部為陰性。

3 討論

根據(jù)腎活檢組織病理診斷專家共識(shí)[2-3],光鏡檢查需用福爾馬林固定組織,切片要求觀察10個(gè)及以上腎小球,因此分取的組織較大;由于電鏡觀察的組織要求取材準(zhǔn)確、體積小,需用戊二醛及時(shí)固定;而免疫熒光檢查組織需用等滲溶液低溫保濕或OCT包被,不能使用化學(xué)固定液?；谏鲜鲈?目前腎活檢病理組織的分割和固定保存均是在穿刺手術(shù)室現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行,然后轉(zhuǎn)運(yùn)到病理室進(jìn)行后續(xù)制樣和病理診斷工作。但是由于腎小球僅分布在腎皮質(zhì)區(qū),在觀察病理切片時(shí)常發(fā)現(xiàn)某項(xiàng)檢查中腎小球數(shù)量過(guò)多,而對(duì)應(yīng)的其它項(xiàng)檢查中腎小球數(shù)不足或無(wú)腎小球;有時(shí)因取材不及時(shí),造成組織細(xì)胞腫脹、壞死較明顯;另外還發(fā)現(xiàn)免疫熒光檢查的組織因失誤接觸到固定液而造成免疫標(biāo)記假陰性結(jié)果。分析問(wèn)題原因除了腎活檢組織結(jié)構(gòu)特殊和病理組織取材要求復(fù)雜外,更多是穿刺現(xiàn)場(chǎng)空間局限、取材設(shè)備不足、取材人員不專業(yè)等因素。如果能將新鮮腎活檢標(biāo)本集中轉(zhuǎn)送到病理室,在空間、取材人員和設(shè)備都具備充分條件下進(jìn)行組織取材,則既能避免取材失誤,又符合病理組織取材工作的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

為達(dá)到上述目標(biāo),本實(shí)驗(yàn)選擇使用器官保存液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。目前臨床用于保存和轉(zhuǎn)運(yùn)移植器官商品化的器官保存液較多,包括UW液、HTK液和HCA液等,采用單純冷卻法或低溫灌注法處理器官都能很好地預(yù)防組織水腫和細(xì)胞破壞。有文獻(xiàn)報(bào)道使用UW液可保存器官長(zhǎng)達(dá)72 h,并成功用于動(dòng)物器官移植[4]。我們首先使用大鼠腎組織進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用上述幾種器官保存液低溫浸泡動(dòng)物腎組織,在一定時(shí)間內(nèi)能較好保護(hù)組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu),其中UW溶液的保護(hù)作用優(yōu)于其他器官保存液,但該部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未在本文列出。因此本實(shí)驗(yàn)選用UW液來(lái)觀察其對(duì)臨床腎活檢病理組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)效果,以及是否對(duì)特殊染色及免疫熒光標(biāo)記結(jié)果有影響。結(jié)果顯示經(jīng)UW液低溫浸泡8 h內(nèi)腎組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)均改變不明顯,同時(shí)不影響組織病理學(xué)的其他檢查結(jié)果。但隨著UW液浸泡時(shí)間延長(zhǎng),腎組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)逐漸出現(xiàn)受損現(xiàn)象,對(duì)觀察腎小球疾病相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)的影響逐漸加大。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)24 h組部分病例的組織超微結(jié)構(gòu)破壞較輕和8 h組相似,但有的組織超微結(jié)構(gòu)受損較明顯,推測(cè)可能是疾病類型和病變程度不同所造成的不同生化微環(huán)境差異所引起,因此在使用UW液保存和轉(zhuǎn)運(yùn)腎活檢組織時(shí),時(shí)間越短越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,使用UW液未發(fā)現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性現(xiàn)象,不影響免疫熒光染色結(jié)果,因此可作為冷凍切片組織保存和轉(zhuǎn)運(yùn)的常規(guī)媒介液使用。本實(shí)驗(yàn)還總結(jié)了一些注意事項(xiàng)：(1)保存液溫度須控制在0～4 ℃(冰浴),如果溫度過(guò)高,會(huì)影響組織保護(hù)效果。(2)浸泡的組織不能太大,保存液只適宜保存穿刺類細(xì)小組織。(3)運(yùn)輸過(guò)程避免劇烈震動(dòng)。(4)UW液需分裝、冷凍保存,臨用時(shí)再解凍,以避免污染變質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為轉(zhuǎn)運(yùn)新鮮病理組織標(biāo)本到病理室集中進(jìn)行規(guī)范化取材提供了一種新思路,能極大提高病理組織取材準(zhǔn)確性。同時(shí)較長(zhǎng)的組織保存時(shí)間能滿足多院區(qū)或同一地區(qū)間新鮮腎活檢病理標(biāo)本轉(zhuǎn)送,對(duì)腎活檢穿刺工作有效地開(kāi)展和腎臟疾病診治水平的提高產(chǎn)生積極作用。