王更芳,周曉莉,郭 媛,饒 秋

尿路上皮病變的組織學(xué)形態(tài)具有多樣性,不同組織學(xué)分型對應(yīng)的臨床結(jié)果和生物學(xué)行為不同,導(dǎo)致后續(xù)的治療和預(yù)后存在差異[1-3]。尿路上皮病變的診斷主要依靠組織學(xué)檢查,然而有時良、惡性病變在形態(tài)上存在重疊,鑒別診斷困難。免疫組化在輔助鑒別診斷方面具有局限性[4]。膀胱鏡活檢組織病理檢查是診斷的金標(biāo)準(zhǔn),然而,診斷的準(zhǔn)確性取決于膀胱鏡醫(yī)師和病理醫(yī)師的個人經(jīng)驗,由于取樣誤差,不能排除假陰性的可能。因此,發(fā)掘較為客觀、敏感、特異的檢測方法很有必要。DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。DNA甲基化檢測不僅可應(yīng)用于活檢、冷凍及石蠟包埋組織[6-8],也可應(yīng)用于癌癥患者的外周血和其他體液,為許多包括泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤患者提供了非侵入性分子篩查方法[9-10]。SEPT9屬于GTP結(jié)合蛋白,參與細(xì)胞膜運(yùn)輸、胞質(zhì)分裂、血管生成和細(xì)胞增殖[11]。SEPT9已被證實在結(jié)直腸癌中具有表觀遺傳修飾作用,檢測血漿中ctDNA SEPT9甲基化可用于早期篩查[12]。有研究發(fā)現(xiàn),尿液中的SEPT9甲基化檢測可作為監(jiān)測膀胱癌很有前途的標(biāo)志物[10]。本研究通過對160例尿路上皮病變石蠟組織進(jìn)行SEPT9甲基化檢測,探討SEPT9甲基化檢測在尿路上皮良、惡性病變中的鑒別診斷意義,嘗試通過聯(lián)合使用SEPT9甲基化檢測降低膀胱鏡活檢組織的假陰性率。

1 材料與方法

1.1 組織樣本選取收集2014年1月～2023年12月常州市第二人民醫(yī)院膀胱鏡活檢、電切、手術(shù)切除的經(jīng)明確病理診斷的非浸潤性尿路上皮病變160例,由2位經(jīng)驗豐富的病理診斷醫(yī)師對所有切片按WHO(2022)泌尿與男性生殖系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)重新閱片。最終診斷為扁平狀尿路上皮病變43例,其中包括尿路上皮急、慢性炎15例,不典型增生11例,異型增生10例,原位癌7例;乳頭狀尿路上皮病變41例,包括乳頭狀瘤3例、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤16例、低級別乳頭狀尿路上皮癌12例、高級別乳頭狀尿路上皮癌10例;內(nèi)翻性尿路上皮病變76例,包含腺性膀胱炎21例、內(nèi)翻性尿路上皮乳頭狀瘤20例、內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤10例、低級別內(nèi)翻性尿路上皮癌15例、高級別內(nèi)翻性尿路上皮癌10例。另收集15對尿路上皮癌和癌旁組織進(jìn)行臨床驗證。癌組織經(jīng)組織病理確診,而癌旁組織則分別采集離癌組織相對較近和較遠(yuǎn)的組織。相對較近的癌旁組織,對照HE染色刮取距離癌組織1～2 cm的正常尿路上皮細(xì)胞;相對較遠(yuǎn)的癌旁組織,選擇離腫瘤最遠(yuǎn)處的遠(yuǎn)端切緣尿路上皮組織。另選12對首次膀胱鏡活檢為炎癥或良性病變、后續(xù)活檢或電切為癌的組織。對上述組織分別進(jìn)行SEPT9甲基化檢測。

1.2 SEPT9 DNA甲基化檢測每個病例選取代表性石蠟包埋組織,切取5 μm厚石蠟卷。相對較近的癌旁組織,每個病例選取1個代表性蠟塊,切5 μm厚白片,撈在載玻片上,對照HE染色刮取目的區(qū)域以富集1～2 cm范圍內(nèi)的正常尿路上皮細(xì)胞。相對較遠(yuǎn)的癌旁組織,則選擇遠(yuǎn)端切緣尿路上皮組織切5 μm厚石蠟卷。FFPE DNA提取試劑盒(購自廈門艾德生物公司)提取DNA,為確保DNA樣品的質(zhì)量,使用安捷倫生物分析儀NanoDrop(賽默飛世爾科技,美國)評估DNA樣品的濃度、純度。確保濃度>10 ng/μL,純度(A260/A280比值)在1.5～2.2之間,質(zhì)控合格后取100 μL總質(zhì)量為200 ng的DNA,按SEPT9甲基化處理試劑盒(購自北京博爾誠科技公司)說明書進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理,最后將DNA按比例加入相應(yīng)體積的PCR反應(yīng)液和PCR聚合酶,每次實驗均設(shè)陰性和陽性對照,按照說明書上機(jī)。使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀擴(kuò)增45個熱循環(huán)后讀取數(shù)據(jù)結(jié)果。當(dāng)內(nèi)參28≤β-ACTB≤32時,以ΔCt(ΔCtSEPT9=CtSEPT9-Ctβ-ACTB)作為循環(huán)閾值,計算SEPT9基因甲基化的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,繪制散點(diǎn)圖。分類資料分析采用χ2檢驗。對SEPT9在各類病變中的甲基化水平進(jìn)行顯著性分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。ROC曲線分析計算敏感性、特異性。采用約登指數(shù)(敏感性+特異性-1)計算最佳臨界值。當(dāng)約登指數(shù)取最大值0.891時,建立最佳臨界值ΔCt為5.34(P<0.000 1)。SEPT9甲基化ΔCt值≤5.34判為陽性,ΔCt值>5.34判為陰性。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征扁平狀尿路上皮病變：(1)不典型增生,尿路上皮正常或輕度增厚,從基底部到表層結(jié)構(gòu)清晰,極性明顯;細(xì)胞增大,胞質(zhì)豐富,核大小一致;固有層有炎癥反應(yīng)(圖1)。(2)尿路上皮異型增生,細(xì)胞排列輕度紊亂,核大小差異不大(圖2)。(3)尿路上皮原位癌,細(xì)胞排列紊亂,極向和黏附性消失,細(xì)胞體積增大,多形性明顯,核染色質(zhì)粗糙或凝塊狀,核仁大而明顯(圖3)。乳頭狀尿路上皮病變：(1)尿路上皮乳頭狀瘤,呈外生性生長,纖維血管軸心被覆正常的尿路上皮,乳頭游離細(xì)長,無分枝或有小分支,細(xì)胞無異型,無核分裂象(圖4)。(2)低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤,與乳頭狀瘤相似,層次增厚(>10層),細(xì)胞大小一致,極性明顯,細(xì)胞無異型或輕度異型,罕見核分裂象(圖5)。(3)低級別乳頭狀尿路上皮癌,極向輕度紊亂,細(xì)胞異型性明顯,可見核分裂象(圖6)。(4)高級別乳頭狀尿路上皮癌,極性紊亂,細(xì)胞大小極不一致,核大,核仁明顯,核分裂象易見,核染色質(zhì)濃縮,細(xì)胞間黏附性差(圖7)。內(nèi)翻性尿路上皮病變：(1)腺性膀胱炎,表面黏膜組織正?；蛟龊?固有膜內(nèi)可見Brunn巢,細(xì)胞無異型性,無核分裂象(圖8)。(2)內(nèi)翻性尿路上皮乳頭狀瘤,固有膜內(nèi)乳頭呈小梁狀生長,梁周邊上皮細(xì)胞柵欄狀排列,中央為流水樣排列,梁與梁之間相互吻合,細(xì)胞無明顯異型(圖9)。(3)內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤,固有層內(nèi)尿路上皮明顯增厚(>10層細(xì)胞)、無吻合;細(xì)胞極向明顯、輕度不典型(圖10)。(4)低級別內(nèi)翻性尿路上皮癌,固有膜內(nèi)見寬窄不一、不規(guī)則的乳頭狀細(xì)胞索或細(xì)胞巢,可見纖維脈管軸心;細(xì)胞輕度異型,少量核分裂象(圖11);常伴有外生乳頭狀結(jié)構(gòu)。(5)高級別內(nèi)翻性尿路上皮癌,尿路上皮在固有膜內(nèi)呈不規(guī)則乳頭狀,乳頭相互融合,呈實體狀,表面被覆的腫瘤細(xì)胞厚薄不一;細(xì)胞大小不一、多形性、排列雜亂;細(xì)胞核大、深染,易見核分裂象(圖12),常伴有外生乳頭狀結(jié)構(gòu)。

圖1 尿路上皮不典型增生：上皮細(xì)胞增厚,極性明顯,固有層炎細(xì)胞浸潤 圖2 尿路上皮異型增生：尿路上皮增厚,細(xì)胞排列輕度紊亂 圖3 尿路上皮原位癌：細(xì)胞排列紊亂,極性和黏附性消失,多形性明顯 圖4 尿路上皮乳頭狀瘤：外生性生長,纖維血管軸心被覆正常的尿路上皮,乳頭游離細(xì)長,無分枝,細(xì)胞無異型 圖5 低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤：細(xì)胞層數(shù)超過10層,大小一致,極性明顯 圖6 低級別乳頭狀尿路上皮癌：極向輕度紊亂,細(xì)胞異型性明顯 圖7 高級別乳頭狀尿路上皮癌：極性紊亂,失黏附,核分裂象易見(箭頭) 圖8 腺性膀胱炎：尿路上皮表面黏膜組織正常,固有膜內(nèi)可見Brunn巢,細(xì)胞無異型性 圖9 內(nèi)翻性尿路上皮乳頭狀瘤：固有膜內(nèi)乳頭呈小梁狀生長,梁與梁之間相互吻合 圖10 內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤：固有層內(nèi)尿路上皮明顯增厚(>10層細(xì)胞)、無吻合。細(xì)胞大小一致、輕度不典型 圖11 低級別內(nèi)翻性尿路上皮癌：固有層內(nèi)見寬窄不一、不規(guī)則、無吻合的乳頭狀細(xì)胞索或細(xì)胞巢,可見纖維脈管軸心。細(xì)胞輕度異型 圖12 高級別內(nèi)翻性尿路上皮癌：固有膜內(nèi)乳頭相互融合,呈實體狀,細(xì)胞大小不一、多形性、核大、深染

2.2 160例尿路上皮病變組織SEPT9甲基化檢測結(jié)果43例扁平狀尿路上皮病變中,急、慢性炎性病變SEPT9甲基化檢測均為陰性,不典型增生、異型增生、原位癌SEPT9甲基化陽性率分別為9%(1/11)、100%(10/10)、100%(7/7);41例乳頭狀尿路上皮病變中,3例乳頭狀瘤SEPT9甲基化檢測均為陰性,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤、低、高級別乳頭狀尿路上皮癌SEPT9甲基化陽性率分別為100%(16/16)、92%(11/12)、100%(10/10);76例內(nèi)翻性尿路上皮病變中,腺性膀胱炎、內(nèi)翻性尿路上皮乳頭狀瘤、內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤、低、高級別內(nèi)翻性尿路上皮癌中SEPT9甲基化陽性率分別為10%(2/21)、5%(1/20)、100%(10/10)、93%(14/15)、100%(10/10)(表1)。良性病變與惡性病變間SEPT9基因甲基化水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1,圖13)。SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與低度惡性潛能尿路上皮腫瘤的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為100%、94%、87%和100%;SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與惡性病變的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為98%、94%、96%和97%(表2)。

表1 不同類型尿路上皮病變中的SEPT9基因甲基化情況

表2 尿路上皮良惡性病變鑒別診斷中SEPT9甲基化檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值

圖13 尿路上皮良、惡性病變中SEPT9甲基化水平：***P<0.000 1

2.3 尿路上皮癌和癌旁組織中SEPT9甲基化檢測結(jié)果15例遠(yuǎn)端切緣組織SEPT9甲基化檢測均為陰性,15例癌組織和7例鄰近癌旁組織SEPT9甲基化檢測陽性。15例癌組織中,10例高級別乳頭狀尿路上皮癌均伴有浸潤;另5例低級別乳頭狀尿路上皮癌中有2例伴有浸潤。7例鄰近癌旁組織SEPT9甲基化陽性病例中,6例高級別乳頭狀尿路上皮癌均伴有浸潤,1例低級別乳頭狀尿路上皮癌無浸潤。8例鄰近癌旁組織SEPT9甲基化陰性病例中,4例高級別乳頭狀尿路上皮癌均伴有浸潤,4例低級別乳頭狀尿路上皮癌中2例伴有肌層浸潤,2例無浸潤。部分病例鄰近癌組織的正常尿路上皮細(xì)胞發(fā)生了DNA甲基化,提示這部分SEPT9甲基化陽性病例表觀遺傳修飾異常,與肌層浸潤無關(guān)(圖14)。

圖14 癌組織、鄰近癌旁組織、遠(yuǎn)端切緣組織中SEPT9甲基化水平

2.4 初次活檢為炎癥、良性病變而后續(xù)活檢、電切為癌的組織SEPT9甲基化檢測結(jié)果對12例膀胱鏡活檢未取到癌細(xì)胞,而后續(xù)活檢、電切證實為尿路上皮癌的組織進(jìn)行SEPT9甲基化檢測。12例首次活檢病理為炎癥或良性病變的組織中,有8例SEPT9 DNA甲基化檢測為陽性,陽性率為67%(8/12);12例再次活檢、電切病理證實為癌的組織SEPT9甲基化檢測均為陽性,陽性率100%(12/12)。提示SEPT9甲基化陽性而活檢為陰性的病例需密切隨訪,必要時再次活檢(圖15)。

3 討論

扁平狀尿路上皮病變中不典型增生、異型增生、原位癌三者的生物學(xué)行為、預(yù)后和治療方式均不同。不典型增生屬于反應(yīng)性、增生性病變;異型增生屬癌前病變,進(jìn)展為原位癌的可能性為20%;60%～80%的尿路上皮原位癌可能進(jìn)展為浸潤性癌,并且易復(fù)發(fā),需進(jìn)行灌注治療[13]。因此明確診斷非常必要,但三者的形態(tài)學(xué)存在重疊。不典型增生,尿路上皮輕度增厚,核大小一致;異型增生,細(xì)胞極性稍紊亂,核大小差異不大。兩者界限不明顯,尤其是活檢組織、機(jī)械損傷嚴(yán)重時因組織小,細(xì)胞形態(tài)模糊,診斷重復(fù)性差。本研究中不典型增生SEPT9甲基化陽性率9%(1/11),異型增生甲基化陽性率100%(10/10),原位癌甲基化陽性率100%(7/7)。提示不典型增生與異型增生在形態(tài)學(xué)上鑒別診斷困難時,可行SEPT9甲基化檢測輔助診斷。異型增生與原位癌SPET9甲基化檢測結(jié)果均為陽性。因此,SPET9甲基化檢測在異型增生和原位癌之間不具有鑒別診斷作用。

膀胱乳頭狀尿路上皮腫瘤在膀胱活檢標(biāo)本中非常常見。乳頭狀尿路上皮腫瘤分為尿路上皮乳頭狀瘤、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤、低、高級別乳頭狀尿路上皮癌。尿路上皮乳頭狀瘤屬于良性病變,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤具有一定的復(fù)發(fā)率。有研究顯示隨訪128個月,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤的復(fù)發(fā)率為20.1%,其中9%患者復(fù)發(fā)仍為低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤,9.5%患者進(jìn)展為低級別乳頭狀尿路上皮癌,1.6%患者進(jìn)展為高級別乳頭狀尿路上皮癌,因此此類病例需密切隨訪[14]。低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤與乳頭狀瘤在形態(tài)學(xué)上是一個連續(xù)的譜帶,并且乳頭狀瘤、不典型增生、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤可共同存在于同一病例中[15]。因此單從形態(tài)學(xué)上難以鑒別。本組中3例尿路上皮乳頭狀瘤SEPT9甲基化均為陰性,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤SEPT9甲基化陽性率為100%(16/16)。提示尿路上皮乳頭狀瘤與乳頭狀尿路上皮惡性病變的SEPT9甲基化水平存在差異,鑒于本組病例數(shù)較少,需累積病例進(jìn)一步驗證。有研究表明低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤和低級別非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌形態(tài)學(xué)相似,分子遺傳學(xué)改變相同,復(fù)發(fā)和進(jìn)展風(fēng)險也類似[15]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤、低、高級別乳頭狀尿路上皮癌中SEPT9甲基化陽性率分別為100%(16/16)、92%(11/12)、100%(10/10),這三種乳頭狀尿路上皮惡性病變之間SEPT9甲基化水平相似。

內(nèi)翻性尿路上皮病變是病理診斷中的難點(diǎn)[16]。在大多數(shù)情況下,腺性膀胱炎在形態(tài)學(xué)上較容易診斷。然而,在尿路上皮明顯增生的病例中,腺性膀胱炎易與具有內(nèi)翻性生長模式伴有腺樣結(jié)構(gòu)的尿路上皮癌混淆[17]。內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤由于細(xì)胞大小、極性一致,核分裂象罕見,與內(nèi)翻性尿路上皮乳頭狀瘤形態(tài)學(xué)相似,僅在厚度上超過正常尿路上皮細(xì)胞層數(shù),鑒別診斷困難。本研究中腺性膀胱炎、內(nèi)翻性乳頭狀瘤、內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤SEPT9甲基化陽性率分別為10%(2/21)、5%(1/20)、100%(10/10)。內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤中SEPT9甲基化陽性率明顯高于良性病變,因此在鑒別困難時SEPT9基因甲基化水平可以作為參考。內(nèi)翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤、低、高級別內(nèi)翻性尿路上皮癌中SEPT9甲基化陽性率分別為100%(10/10)、93%(14/15)、100%(10/10)。在內(nèi)翻性惡性病變之間SEPT9表觀遺傳學(xué)相似,SEPT9甲基化檢測無鑒別診斷作用。

本研究中SEPT9甲基化水平在良、惡性病變中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與低度惡性潛能尿路上皮腫瘤的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為100%、94%、87%和100%。SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與惡性病變的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為98%、94%、96%和97%。提示SEPT9基因甲基化可以作為相對敏感、特異的生物標(biāo)志物來區(qū)分尿路上皮良、惡性病變。有研究發(fā)現(xiàn),許多形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)正常的尿路上皮或良性病變存在與尿路上皮惡性病變相似的分子遺傳學(xué)改變[18]。而本文在6%(4/70)的良性病變中檢測到SEPT9甲基化陽性,其中包含1例不典型增生,1例腺性膀胱炎腸上皮化生,3年內(nèi)復(fù)發(fā)2次,1例旺熾性腺性膀胱炎,1例內(nèi)翻性乳頭狀瘤。本組SEPT9甲基化陽性的良性病例意義不明確,需進(jìn)一步隨訪觀察。

本研究還分析了15對癌和癌旁組織中SPET9基因甲基化水平。在癌組織和部分癌旁組織中檢測到SEPT9高水平甲基化,特別是癌旁1～2 cm附近的正常尿路上皮組織,這種變化在顯微鏡下組織學(xué)上無法觀察到,但可通過甲基化特異性的PCR檢測到。有研究發(fā)現(xiàn),形態(tài)正常的癌旁組織出現(xiàn)特征性的表觀遺傳學(xué)改變,可能是癌癥發(fā)生的早期因素[19]。Thomsen等[20]的研究顯示,CNV和DNA甲基化改變是尿路上皮癌的主要早期驅(qū)動因素。Majewski等[21]的一項研究提示,DNA甲基化的表觀遺傳改變可能導(dǎo)致隨后的基因組改變,DNA甲基化檢測可以識別具有表觀遺傳修飾缺陷的正常尿路上皮細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示15例癌組織和7例鄰近癌旁組織SEPT9基因甲基化陽性,提示部分病例癌旁組織的表觀遺傳修飾異常。

膀胱鏡活檢組織病理檢查是尿路上皮腫瘤分類和診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[22]。然而,診斷的準(zhǔn)確性取決于膀胱鏡醫(yī)師和病理醫(yī)師的個人經(jīng)驗。由于某些病灶較小或較為隱匿,以及部分病例中乳頭狀瘤、不典型增生、尿路上皮癌等組織形態(tài)共同存在,導(dǎo)致尿路上皮病變存在異質(zhì)性。有研究表明,膀胱尿路上皮癌中活檢標(biāo)本與手術(shù)標(biāo)本腫瘤分級的一致性為63.9%,并且活檢組織有遺漏惡性病變的可能性[23]。另有研究證實,在肺癌穿刺組織中,DNA基因甲基化檢測可以提高肺活檢的診斷準(zhǔn)確性,DNA甲基化檢測的優(yōu)點(diǎn)是客觀、敏感、可允許的活檢檢測范圍廣[8]。本研究對12例膀胱鏡活檢未取到癌細(xì)胞而后續(xù)再次活檢、電切證實為癌的組織都進(jìn)行了SEPT9甲基化檢測。結(jié)果顯示,12例首次活檢病理無癌細(xì)胞的組織中8例SEPT9 DNA甲基化檢測陽性,陽性率為67%(8/12);12例再次活檢病理證實為癌的組織SEPT9甲基化檢測均為陽性。提示當(dāng)臨床懷疑為惡性病變而膀胱鏡活檢病理證實為炎癥或良性的病例,SEPT9甲基化檢測為陽性時,患者需密切隨訪,必要時再次行膀胱鏡檢查。

綜上,SEPT9甲基化檢測在輔助診斷尿路上皮良、惡性病變中表現(xiàn)出高敏感性、特異性,提示在良、惡性尿路上皮鑒別診斷方面SEPT9甲基化檢測是個良好的輔助方法;同時膀胱鏡活檢病理證實為炎癥或良性病變而SEPT9甲基化檢測為陽性的患者需密切隨訪,必要時再次行膀胱鏡活檢,聯(lián)合使用SEPT9甲基化檢測可降低膀胱鏡活檢組織的假陰性率。