張 雨，李 崴，王麗娟，李方巍,*，曾名湧,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)三亞海洋研究院，海南三亞 572000；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）作為新興食品原料，生長(zhǎng)周期短、成活率高、營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其是蛋白含量達(dá)到50%～60%[1]，且氨基酸種類豐富。相關(guān)研究表明Glu、Asp、Lys、His、Ser 和Cys 是肽與亞鐵離子的主要螯合位點(diǎn)[2]，因此鈍頂螺旋藻具備螯合鐵的條件。我國(guó)螺旋藻年產(chǎn)量（約9000 t）居世界首位，占全球微藻總產(chǎn)量的40%～50%[3]。但是，螺旋藻由于特殊性氣味和對(duì)熱、光的敏感性等問(wèn)題，其生產(chǎn)應(yīng)用仍有許多瓶頸問(wèn)題需要解決，例如直接加工新鮮螺旋藻產(chǎn)品不易儲(chǔ)存和有刺激性氣味，而傳統(tǒng)的熱噴霧干燥會(huì)導(dǎo)致大部分生物活性成分的損失等。本文通過(guò)對(duì)螺旋藻進(jìn)行精深加工，以期提高螺旋藻中生物活性成分的利用率。目前螺旋藻的加工應(yīng)用主要有兩方面：一方面是直接加工的粉末等產(chǎn)品；另一方面是精深加工的螺旋藻生物活性成分，精深加工產(chǎn)品種類單一，并且關(guān)于螺旋藻蛋白肽高值化利用的研究鮮有報(bào)道。因此，如何提高螺旋藻的接受度，實(shí)現(xiàn)螺旋藻蛋白肽高值化利用，是拓寬螺旋藻在食品加工領(lǐng)域中應(yīng)用的重要方向。

鐵是基本的微量營(yíng)養(yǎng)素之一，是人體代謝過(guò)程所必需的。然而，缺鐵是最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺乏癥之一[4]。口服補(bǔ)鐵劑已成為缺鐵患者的首要選擇。由于亞鐵鹽類等傳統(tǒng)補(bǔ)鐵劑受食品中其他成分的影響而導(dǎo)致生物利用度有限，且在加工儲(chǔ)存中穩(wěn)定性較差，因此，蛋白肽亞鐵螯合物營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉、生物利用度高、食用安全可靠，可用作新型補(bǔ)鐵劑[5-6]。迄今為止，已經(jīng)成功提取了燕麥[7]、大豆[8-9]、羅非魚[10]、玉米[11]和海參[12]等可食用動(dòng)植物蛋白中具有鐵螯合活性的蛋白肽，且制備出蛋白肽亞鐵螯合物。鈍頂螺旋藻是優(yōu)質(zhì)蛋白的來(lái)源，通過(guò)酶法水解可以獲得生物活性肽，不僅能提供人類營(yíng)養(yǎng)，而且具有提供人體生理機(jī)能的功效，因此可以作為鐵螯合肽的來(lái)源。不僅豐富鐵螯合肽的來(lái)源，同時(shí)也利用量子化學(xué)計(jì)算探究肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)。

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合物的制備條件，采用熒光光譜分析研究肽結(jié)構(gòu)變化、分子量測(cè)定研究參與螯合的肽類型和掃描電鏡分析觀察微觀結(jié)構(gòu)，隨后又利用氨基酸組成實(shí)驗(yàn)探究螯合位點(diǎn)、多肽序列分析和量子化學(xué)計(jì)算模擬螯合物的結(jié)構(gòu)模型、FTIR 光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，期望能初步闡釋螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合物的形成機(jī)制，以期為豐富鐵強(qiáng)化劑種類和拓寬螺旋藻的應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鈍頂螺旋藻粉 新大澤公司；氯化亞鐵、抗壞血酸、無(wú)水乙醇、醋酸鈉、鄰菲啰啉、PBS 緩沖液干粉、鹽酸羥胺等為分析純、溴化鉀（光譜純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg）北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸 分析純，北京化工廠。

GL-21M 高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)有限公司；SCIENTZ-10ND 冷凍干燥機(jī)、XMTD-8222數(shù)顯恒溫水浴鍋 寧波新芝生物科技有限公司；AL104 精密電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司；DW-86L-388A 超低溫冰箱 海爾公司；UV-2550酶標(biāo)儀、LC-20AD 高效液相色譜儀 日本島津公司；TSK gel GMPWXL 凝膠色譜柱 日本Tosoh（TSK 東曹）公司；F-4600 熒光分光光度計(jì)、S-510 掃描電子顯微鏡 日本日立公司；NicoletiS10 傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛公司；200-PC 差示掃描量熱儀（DSC）德國(guó)NETZSCH 儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 螺旋藻蛋白提取工藝 根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]中的方法提取、純化螺旋藻蛋白。

1.2.1.1 破壁 取適量鈍頂螺旋藻粉，將其溶于0.01 mol/L pH6.8 的PBS 中，配制成料液比為1:10（w/v）的懸浮液，攪拌15 min，在-20 ℃下冷凍90 min，然后分別在37 ℃和4 ℃下解凍，如此反復(fù)3 次。凍融完成后，在4 ℃下離心（10000 r/min，20 min），取上清液于4 ℃下冷藏保存。

1.2.1.2 鹽析 取破壁離心后的上清液進(jìn)行攪拌，同時(shí)緩緩加入碾壓均勻的（NH4）2SO4固體至濃度為50%達(dá)到飽和（5～10 min 內(nèi)完成），攪拌40 min 使（NH4）2SO4固體顆粒溶解完全。

1.2.1.3 透析 將鹽析溶液在4 ℃下離心（8000 r/min，15 min），然后將沉淀放入去離子水中于4 ℃下使用截留分子量為8～10 kDa 的透析袋透析，間隔2 h 更換純水至少3 次，最后一次過(guò)夜后透析結(jié)束。

收集透析后的樣品于-80 ℃中凍藏4 h 以上，然后真空冷凍干燥制成粉末并于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 螺旋藻蛋白酶解工藝 根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]中的方法酶解螺旋藻蛋白。以實(shí)驗(yàn)室中制得的螺旋藻蛋白為底物，胰蛋白酶的酶解條件為溫度37 ℃，pH8，料液比為1:10（w/v），加酶量3%，酶解反應(yīng)2 h，沸水滅酶 10 min，冷卻至室溫，8000×g 離心15 min，收集酶解上清液，凍干為螺旋藻蛋白肽凍干粉，于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]中的方法提取、純化螺旋藻蛋白。

1.2.3 螺旋藻肽亞鐵螯合物的制備條件優(yōu)化

1.2.3.1 螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合物的制備工藝 根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]中的方法制備螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合物。稱取一定量的螺旋藻蛋白肽凍干粉于錐形瓶中，加入去離子水控制料液比，再加入一定量抗壞血酸混勻，調(diào)節(jié)pH，根據(jù)不同質(zhì)量比加入氯化亞鐵，在設(shè)定的溫度下水浴加熱40 min，然后加入6 倍體積的無(wú)水乙醇，在室溫下靜置，離心（4000 r/min，10 min），除去上清液，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀后再次離心，反復(fù)3 次，收集沉淀，凍干，用研缽研磨凍干產(chǎn)物得到粉末，于-20 ℃冷凍保存。

以螯合率及螯合物得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究螺旋藻蛋白肽濃度、蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比、溫度和pH 四個(gè)因素對(duì)螯合效果的影響。單因素實(shí)驗(yàn)條件如表1 所示。

表1 螯合反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of single factor experiment for chelating reaction

1.2.3.2 螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合物制備條件的響應(yīng)面優(yōu)化 基于制備螯合物的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以螯合物得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取pH（A）、螺旋藻蛋白肽濃度（B）和蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比（C）為影響因素，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。具體試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of RSM

1.2.4 螯合率及螯合物得率的測(cè)定 采用鄰菲啰啉比色法[14]測(cè)鐵含量。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用硫酸亞鐵銨準(zhǔn)確配制鐵離子濃度為10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取50 mL 容量瓶分別加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次加入1 mL 鹽酸溶液（1 moL/L），1 mL 10%鹽酸羥胺溶液，1 mL 濃度為0.12%的鄰菲啰啉和5 mL 10%的醋酸鈉溶液，用去離子水定容，獲得鐵離子的終濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 μg/mL。將溶液于室溫下放置30 min，以鐵離子濃度為0 μg/mL 的溶液作為空白，測(cè)定吸光度A510nm。通過(guò)計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.1162x+0.0016（R2=0.9997）。

1.2.4.2 樣品螯合率及螯合物得率的測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]中的方法測(cè)定樣品中的鐵含量。稱取0.05 g 的螯合物，加入2 mL 濃鹽酸，后用去離子水定容至100 mL 容量瓶中，搖勻。吸取5 mL 樣品溶液于50 mL 容量瓶中，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)定吸光度。樣品中鐵離子含量根據(jù)式（1）計(jì)算。螯合率及螯合物得率分別按式（2）、式（3）計(jì)算。

式中：c—經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到的濃度，μg/mL；v0—樣品定容后體積，mL；v1—取樣體積，mL；m—取樣的質(zhì)量，g。

式中：m—螯合物中鐵的質(zhì)量，mg；m0—加入反應(yīng)體系中鐵的質(zhì)量，mg。

式中：m1—反應(yīng)所得螺旋藻肽亞鐵螯合物的質(zhì)量，mg；m2—加入體系中蛋白肽及氯化亞鐵的質(zhì)量和，mg。

1.2.5 熒光光譜測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12]使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定螺旋藻蛋白肽及其螯合物的熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)295～500 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度為5 nm，電壓為400 V，記錄測(cè)定結(jié)果。

1.2.6 分子量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]取約10 mg 樣品，溶解于1 mL 的水中并混合均勻，用注射器吸取水溶液用0.45 μm 的分子膜過(guò)濾，微量注射器吸取100 μL 濾液，注入GPC 色譜組，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3+0.06% NaN3水溶液，流動(dòng)相流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃。GPC 實(shí)驗(yàn)確定分子量及其分布時(shí)，采用窄分布聚乙二醇作為標(biāo)樣，從而得到其校正曲線，將校正曲線的縱坐標(biāo)換成與分子尺寸有關(guān)的參數(shù)，即可獲得適合于各種高聚物的校正曲線。有了校正曲線，即可根據(jù)VE讀得相應(yīng)的分子量。本實(shí)驗(yàn)校正曲線公式為y=405005x+6×106（R2=0.6468）。

1.2.7 掃描電鏡（SEM）測(cè)定 取少量螺旋藻肽粉及肽亞鐵螯合物均勻涂抹于樣盤上，進(jìn)行噴金處理后，再對(duì)樣盤進(jìn)行抽真空處理。利用熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡分別于500 倍、1000 倍、10000 倍下獲取圖像，觀察螺旋藻蛋白肽和螺旋藻肽亞鐵螯合物的微觀結(jié)構(gòu)[12]。

1.2.8 氨基酸組成測(cè)定 利用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定螺旋藻蛋白肽及螯合物的氨基酸組成。準(zhǔn)確稱取適量樣品，移取3.0 mL 6 mol/L 鹽酸溶液含0.1%苯酚溶液至樣品瓶中，超聲溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至安培瓶中，連續(xù)5 次，充氮，熔封，烘箱110 ℃水解24 h 后，N2吹干鹽酸，加3.0 mL 水復(fù)溶。移取上述溶液200 μL 加入稀釋后的A 溶液100 μL 和稀釋后的B 溶液100 μL，搖勻，室溫反應(yīng)60 min；然后加入正己烷溶液400 μL 旋緊蓋子后振搖5～10 s，室溫靜置分層，取下層200 μL 溶液，加入800 μL 水混合均勻，再取200 μL 加入800 μL 水混合均勻，用孔徑為0.22 μm 有機(jī)膜過(guò)濾，待分析。具體參數(shù)：流動(dòng)相A 0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（pH6.50）:乙腈=93:7；流動(dòng)相B 水:乙腈=20:80；色譜柱C18，5 μm，4.6×250 mm；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL；工作站記錄時(shí)間60 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束得到樣品中各類氨基酸含量，并對(duì)比每種氨基酸的含量[12]。

1.2.9 螺旋藻蛋白肽序列分析 取10 μL 流動(dòng)相A 液（100%水、0.1%甲酸）溶解凍干粉末，4 ℃下離心（14000×g，20 min），取1 μg 上清液進(jìn)樣，液質(zhì)檢測(cè)。具體參數(shù)：流動(dòng)相A 100%水、0.1%甲酸；流動(dòng)相B 80%乙腈、0.1%甲酸；質(zhì)譜儀 Q Exactive HFX；離子源Nanospray Flex?（NSI）；離子噴霧電壓2.4 kV；離子傳輸管溫度275 ℃。質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，生成質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)（.raw）。數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇是以所需物種、數(shù)據(jù)庫(kù)注釋完備性及序列可靠性為參考依據(jù)的。在選擇數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，遵循如下原則，若為已經(jīng)測(cè)序生物，直接選用該物種數(shù)據(jù)庫(kù)，若為非測(cè)序生物，則選擇與被測(cè)樣品最為相關(guān)的大類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。采用Peaks 8 軟件搜庫(kù)。

1.2.10 螺旋藻肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)模型 采用量子化學(xué)計(jì)算及波函數(shù)分析方法[16]對(duì)螺旋藻肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。量子化學(xué)計(jì)算前，根據(jù)1.2.9 中測(cè)得的主要螯合肽段的來(lái)源和序列，從PDB 庫(kù)（https://legacy.uniprot.org/）中下載藻藍(lán)蛋白（1HA7）、別藻藍(lán)蛋白（1B33）結(jié)構(gòu)，目標(biāo)肽段的位置及結(jié)構(gòu)則利用Autodock 4.2.6 軟件獲取。使用Gaussian 16（A.03）程序完成分子結(jié)構(gòu)的幾何優(yōu)化和單點(diǎn)能計(jì)算。量子化學(xué)計(jì)算則通過(guò)密度泛函理論（DFT）方法進(jìn)行。幾何優(yōu)化及單點(diǎn)能計(jì)算采用hf 函數(shù)結(jié)合3-21G 基組實(shí)現(xiàn)。最后，通過(guò)Multiwfn 3.8完成獨(dú)立梯度模型（IGM）分析[17]，并借助Visual Molecular Dynamics（VMD）程序繪制結(jié)構(gòu)模型及等值面圖。

1.2.11 FTIR 光譜測(cè)定 稱取約2 mg 螯合物樣品放入瑪瑙研缽中，加入干燥過(guò)的光譜純KBr 200 mg，在紅外燈下混合研磨均勻，使其粒度在2.5 μm 以下，裝入壓片模具，抽氣加壓，壓力約為60 MPa，維持3～5 min，卸掉壓力則可得一透明的KBr 樣品片，利用NicoletiS10 紅外分光光度計(jì)在波數(shù)范圍500～4000 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描，定性分析后得到紅外光譜圖。同時(shí)按照同一操作方法進(jìn)行螺旋藻蛋白肽凍干粉末的空白樣品制備。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)做三次平行，采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析，應(yīng)用 Origin 8.5 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻肽亞鐵螯合物制備的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 肽濃度對(duì)螯合反應(yīng)的影響 如圖1 所示，在肽濃度為1%時(shí)螯合率和螯合物得率最高。隨著溶液中肽液濃度的增加，亞鐵離子與蛋白肽之間的接觸機(jī)率減小，降低了亞鐵離子與結(jié)合位點(diǎn)之間接觸的概率，同時(shí)也降低了單位質(zhì)量蛋白肽與亞鐵離子的結(jié)合，因?yàn)槎嚯闹g產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。綜合考慮螯合率和螯合物得率，初步選擇螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合反應(yīng)的肽液濃度為1%。

圖1 肽濃度對(duì)螯合率和螯合物得率的影響Fig.1 Effects of peptides concentration on chelating rate and chelate yield of samples

2.1.2 蛋白肽與亞鐵鹽質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖2 所示，在蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比為6:1 時(shí)螯合率（79.59%±1.2135%）最高，蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比為8:1 時(shí)螯合率（79.20%±1.1801%）出現(xiàn)不顯著性（P＞0.05）降低；在蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比為5:1 時(shí)螯合物得率（40.31%±0.0673%）達(dá)到最大。因?yàn)榈鞍纂?氯化亞鐵質(zhì)量比太小，形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且生成的螯合物易分解[15]；反之，當(dāng)肽與鐵結(jié)合位點(diǎn)飽和后，肽與亞鐵鹽質(zhì)量比增大，導(dǎo)致多肽之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，影響螯合反應(yīng)正常進(jìn)行。綜合考慮螯合率和螯合物得率，初步選擇螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合反應(yīng)的質(zhì)量比為6:1。

圖2 蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比對(duì)螯合率和螯合物得率的影響Fig.2 Effects of SP/FeCl2·4H2O ratio on chelating rate and chelate yield of samples

2.1.3 pH 對(duì)螯合反應(yīng)的影響 如圖3 所示，在pH6時(shí)螯合率達(dá)到最大值。當(dāng)pH 較低時(shí)，-COOH 的H+在pH 升高時(shí)更容易被電離，提供了更多的機(jī)會(huì)與亞鐵離子結(jié)合[18]。在堿性條件下，溶液中OH-的濃度增加，OH-將與供電子基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)亞鐵離子而形成羥基螯合物，進(jìn)而生成氫氧化亞鐵沉淀，因此不適合在堿性條件下進(jìn)行螯合反應(yīng)[19]。螯合物得率雖在pH6時(shí)有下降，但總體是增加的，這一結(jié)果與廉雯蕾[15]研究米蛋白肽亞鐵螯合反應(yīng)的結(jié)果相似。綜合考慮螯合率和螯合物得率，初步選擇螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合反應(yīng)pH 為6。

圖3 pH 對(duì)螯合率和螯合物得率的影響Fig.3 Effects of pH on chelating rate and chelate yield of samples

2.1.4 溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響 如圖4 所示，當(dāng)溫度增加到60 ℃時(shí)，螯合率和螯合物得率達(dá)到最大值；當(dāng)溫度在60 和80 ℃之間時(shí)，螯合率沒(méi)有顯著變化，螯合物得率小幅度減小。表明適當(dāng)?shù)臒崽幚泶龠M(jìn)了螯合作用進(jìn)行，使其更易達(dá)到穩(wěn)定的螯合物結(jié)構(gòu)[20]。綜合考慮螯合率和螯合物得率，初步選擇螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合反應(yīng)的溫度為60 ℃。

圖4 溫度對(duì)螯合率和螯合物得率的影響Fig.4 Effects of temperature on chelating rate and chelate yield of samples

2.2 螺旋藻肽亞鐵螯合物制備工藝響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并考慮到實(shí)際所得的螯合物可能附著有亞鐵離子對(duì)螯合率的測(cè)定影響較大，因此選擇螯合物得率為響應(yīng)值，選取肽液濃度（A）、pH（B）和肽亞鐵鹽質(zhì)量比（C）三個(gè)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，總共17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，具體方案及結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results and design of response surface experiment

2.2.2 回歸方程建立及方差分析 利用Design-Expert 8.0.5 軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到螯合物得率對(duì)以上三個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=42.91+0.63A-0.60B-2.25C-0.073AB+0.49AC-1.46BC-1.53A2-2.13B2-3.02C2。為檢驗(yàn)該回歸方程的有效性，對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA analysis of regression model

由表4 可知，模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型相符；失擬項(xiàng)P值為0.7681＞0.05，不顯著，表明回歸方程的擬合程度較好；回歸決定系數(shù)R2=0.9517，模型校正系數(shù)R2Adj=0.8897，變異系數(shù)C.V.僅為2.45%，說(shuō)明該模型試驗(yàn)誤差較小，可信度高。因此，可用此模型分析和預(yù)測(cè)螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合物的制備工藝。

根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程分別繪制響應(yīng)曲面圖，利用Design-Expert 8.0.6 軟件得到各因素相互作用的響應(yīng)面和等高線圖，如圖5～圖7 所示。再結(jié)合表4 中的P值可知，模型的一次項(xiàng)C 對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01），A、B 項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著；交互項(xiàng)BC 對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)B2、C2對(duì)響應(yīng)值均有顯著（P＜0.05）影響，表明各因素對(duì)螯合物得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)螯合物得率的影響從大到小分別是蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比＞螺旋藻蛋白肽濃度＞pH。在三個(gè)因素兩兩交互作用中，pH 與蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比交互作用顯著，其他因素的交互作用不顯著。

圖5 因素A 和B 交互作用對(duì)螯合物得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction between factors A and B on the yield of chelates

圖6 因素A 和C 交互作用對(duì)螯合物得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the interaction between factors A and C on the yield of chelates

圖7 因素B 和C 交互作用對(duì)螯合物得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the interaction between factors B and C on the yield of chelates

2.2.3 螯合工藝最佳參數(shù)確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件模擬，初步得到了螺旋藻肽亞鐵螯合物的最佳制備工藝條件：pH5.98，蛋白肽/氯化亞鐵質(zhì)量比5.64:1，蛋白肽濃度1.07%，溫度60 ℃，時(shí)間40 min。在此條件下，螯合物得率達(dá)43.37%。為了驗(yàn)證該最適工藝條件的準(zhǔn)確性，根據(jù)實(shí)際情況將工藝條件調(diào)整為pH6，肽亞鐵質(zhì)量比6:1，蛋白肽濃度1%，溫度60 ℃，時(shí)間40 min，重復(fù)進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，螺旋藻肽亞鐵螯合物螯合物得率為44.13%±0.4267%，與理論計(jì)算值的誤差0.76%。說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝條件初步為最適工藝條件。

2.3 熒光光譜分析

熒光光譜是研究參與螯合反應(yīng)的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)構(gòu)變化及與其他分子結(jié)合的重要研究工具[21]。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光是由芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸在一定的激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)出的內(nèi)源性熒光，肽發(fā)生折疊會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[22]。如圖8 所示，在305 以及338 nm 處螺旋藻肽亞鐵螯合物的熒光強(qiáng)度明顯低于螺旋藻肽的熒光強(qiáng)度，可以推測(cè)螺旋藻肽與亞鐵離子螯合后形成的新結(jié)構(gòu)導(dǎo)致熒光猝滅，同時(shí)也表明螯合反應(yīng)中螺旋藻肽發(fā)生了明顯的折疊[21]。綜合上述結(jié)果，螺旋藻肽內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅的原因是螯合反應(yīng)后產(chǎn)生了新結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低[23]。

圖8 螺旋藻肽與肽亞鐵螯合物的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra of spirulina peptide and peptide ferrous chelate

2.4 分子量測(cè)定

如圖9 所示，重均分子量的分布曲線顯示，與螺旋藻蛋白肽相比，螯合物的分子質(zhì)量較小，且螯合物的主要出峰時(shí)間（16.49、18.17 min）也比蛋白肽（16.70、18.43 min）的晚。根據(jù)凝膠色譜法（Gel Permeation Chromatography，GPC）的原理，分子量越小，通過(guò)時(shí)間越長(zhǎng)，由出峰時(shí)間也可知，螯合物的平均相對(duì)分子質(zhì)量比蛋白肽更小，與重均分子量分布曲線結(jié)果相符。由表5 也可看出，螺旋藻蛋白肽的平均相對(duì)分子質(zhì)量大于螺旋藻肽亞鐵螯合物的平均相對(duì)分子質(zhì)量。推測(cè)亞鐵離子主要與短肽相結(jié)合，且肽與螯合物的平均相對(duì)分子質(zhì)量均分為三部分，螯合物最大平均分子量為82837 Da，而蛋白肽的最大平均分子量為959262 Da。研究表明，肽與金屬的比例大約在2:1 至40:1 之間變化，取決于金屬類型、純度和肽的結(jié)合強(qiáng)度[24]。螯合物分子量為2702 Da 的肽段占比最多（59.96%），蛋白肽的肽段分子量基本為4806 Da（52.8%）和225 Da（44.29%），根據(jù)肽段分子量分布推測(cè)亞鐵離子可以與兩個(gè)及兩個(gè)以上的短肽結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的螯合結(jié)構(gòu)。

圖9 相對(duì)分子量分布曲線圖（A）和色譜圖（B）Fig.9 Molecular weight distribution curve (A) and chromatogram curve (B)

表5 螺旋藻蛋白肽及螺旋藻肽亞鐵螯合物的相對(duì)分子量分布Table 5 Relative molecular weight distribution of spirulina peptide and peptide ferrous chelate

2.5 掃描電鏡（SEM）分析

圖10 為在500 倍、5000 倍和10000 倍的顯微鏡下觀察到的螺旋藻蛋白肽（SP）和螯合物（SP-Fe）的微觀結(jié)構(gòu)?？梢钥闯?，SP 表面光滑致密，呈片狀；在不同放大倍數(shù)下表面呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則分布的裂紋，這是由于在真空冷凍干燥過(guò)程中水分散失造成的。而當(dāng)SP 與亞鐵離子螯合時(shí)，SP-Fe 表現(xiàn)出松散和表面粗糙的塊狀結(jié)構(gòu)。SP-Fe 微觀結(jié)構(gòu)的變化是由于SP 與亞鐵離子在螯合過(guò)程中的相互作用，破壞了肽表面原有的致密結(jié)構(gòu)，而不是兩者之間簡(jiǎn)單的物理混合，這一結(jié)論與海參卵水解產(chǎn)物-鈣螯合物的研究結(jié)果一致[25]。同時(shí)也符合熒光光譜結(jié)果，表明螯合反應(yīng)后產(chǎn)生了新結(jié)構(gòu)[26]。

圖10 螺旋藻蛋白肽（SP，A-1、A-2、A-3）及螺旋藻肽亞鐵螯合物（SP-Fe2+，B-1、B-2、B-3）的微觀結(jié)構(gòu)Fig.10 Microstructure of SP (A-1,A-2,A-3) and SP-Fe2+(B-1,B-2,B-3)

2.6 氨基酸組成分析

螺旋藻蛋白肽和螺旋藻蛋白肽亞鐵螯合物的氨基酸組成及相對(duì)含量見(jiàn)表6。數(shù)據(jù)表明，螯合前后氨基酸的相對(duì)含量有所變化。蛋白肽的總氨基酸含量為48.03%，螯合物的總氨基酸含量為20.03%。與蛋白肽相比，螯合物的總氨基酸含量有所減少，這是由于螺旋藻蛋白肽中存在鐵結(jié)合位點(diǎn)，螯合反應(yīng)后鐵與蛋白肽結(jié)合生成了新結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究證明，多肽與金屬離子有不同的結(jié)合位點(diǎn)，包括末端-NH2和-COOH 基團(tuán)、多肽鍵和氨基酸的活性側(cè)鏈（如天冬氨酸和谷氨酸）[27]。在本研究中，螺旋藻蛋白肽與亞鐵離子結(jié)合后，酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、精氨酸、賴氨酸的相對(duì)含量均有所增加，表明谷氨酸和天冬氨酸的羧基、精氨酸的氨基、賴氨酸的胍基可能是主要的鐵結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)甘氨酸和組氨酸含量分別提高了0.307%和0.249%，表明甘氨酸和組氨酸在鐵螯合中也發(fā)揮了重要作用。也有研究表明，半胱氨酸的羥基及巰基側(cè)鏈有較好的金屬螯合活性[24]，其在螺旋藻蛋白肽螯合前的相對(duì)含量為0.127%，螯合后相對(duì)含量為0.301%，說(shuō)明半胱氨酸也可能提供了亞鐵離子的結(jié)合位點(diǎn)。

表6 螺旋藻蛋白肽螯合前后氨基酸對(duì)比分析Table 6 Comparative analysis of amino acids before and after chelation of Spirulina protein peptides

2.7 螺旋藻蛋白肽序列

如圖11A 所示，別藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)蛋白所含的肽段數(shù)占全部肽段數(shù)最高。多肽序列的鑒定對(duì)于研究亞鐵離子螯合肽的結(jié)構(gòu)與螯合活性之間的關(guān)系是必要的。根據(jù)多肽序列測(cè)定結(jié)果可知，螺旋藻蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后獲得了3357 種肽段，肽段長(zhǎng)度范圍為5～31 個(gè)氨基酸，其中10 個(gè)氨基酸組成以下的肽段占79.65%，且研究表明肽與金屬的比例大約在2:1 至40:1 之間變化，取決于金屬類型、純度和肽的結(jié)合強(qiáng)度[24]，因此推測(cè)亞鐵離子主要與短肽結(jié)合。同時(shí)如圖11B 所示，在這些肽段中SIVTKSIVNAD AEAR 占比最高為1.91%，其次是肽段MKTPLTEA占比為1.26%，分別屬于別藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)蛋白，同屬于藻膽蛋白，符合螺旋藻蛋白質(zhì)中藻膽蛋白含量最高的組成結(jié)構(gòu)。因此，推測(cè)亞鐵離子結(jié)合的肽段主要來(lái)自于藻膽蛋白中的別藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)蛋白。

圖11 螺旋藻中不同蛋白質(zhì)種類及含量（A）和螺旋藻中不同肽種類及含量（B）Fig.11 Types and contents of different proteins in Spirulina (A) and types and contents of different peptides in Spirulina (B)

2.8 螺旋藻肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)模型

量子化學(xué)計(jì)算通過(guò)操縱物質(zhì)的量子態(tài)，并利用其獨(dú)特的特性（如疊加和纏繞），能有效地解決量子化學(xué)中的許多重要問(wèn)題（如分子的電子結(jié)構(gòu)）并提供準(zhǔn)確的結(jié)果[28]?，F(xiàn)階段可利用量子化學(xué)計(jì)算模擬物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本研究采用含量占比最高的兩個(gè)肽段為計(jì)算模型，初步探究螺旋藻肽螯合物的模型結(jié)構(gòu)。如圖12A、圖13A 分別為別藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解獲得的含量最高的肽段SIVTKSIVNA DAEAR 和MKTPLTEA 的結(jié)構(gòu)示意圖，為后續(xù)模擬肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)提供了有力支持。研究表明，肽與金屬的比例可能在2:1 至40:1 之間變化，取決于配體類型、純度和肽的結(jié)合強(qiáng)度[25]。上述相對(duì)分子量分析結(jié)果顯示螯合物的相對(duì)分子量較小，由此參考肽與金屬2:1 的比例，分別利用兩條肽段構(gòu)建肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖12B 和圖13B 所示。在螯合物結(jié)構(gòu)模型圖中，兩種肽段均與Fe 結(jié)合，箭頭所指為Fe 原子，位于肽段中間位置，被肽段包圍，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。這與Sun 等[28]研究結(jié)果一致。圖12C～圖12D 和圖13C～圖13D 為鐵與肽段的弱相互作用獨(dú)立梯度模型（IGM）及散點(diǎn)圖，能更直觀地展現(xiàn)鐵與肽的結(jié)合位點(diǎn)。IGM 圖中隨著Sign（λ2）ρ增加，分子間的相互作用發(fā)生改變，由強(qiáng)吸引作用（藍(lán)）到范德華作用（綠）最后是強(qiáng)互斥作用（紅），中間粉色原子是鐵，能明顯看出它與周圍氧（紅）、氫（白）、氮（藍(lán)）有很強(qiáng)的靜電吸引作用，這與上述氨基酸分析結(jié)果一致，鐵主要與谷氨酸和天冬氨酸的羧基、精氨酸的氨基、賴氨酸的胍基結(jié)合。因此，通過(guò)氨基酸電負(fù)性末端包圍形成的電負(fù)性空腔是鑲嵌鐵原子的絕佳位置，更容易產(chǎn)生強(qiáng)吸引作用，形成穩(wěn)定的螯合結(jié)構(gòu)。

圖12 別藻藍(lán)蛋白分離肽段量子化學(xué)計(jì)算螯合物結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.12 Simulation diagram of chelate structure computed by quantum chemistry of allophycocyanin isolated peptide

圖13 藻藍(lán)蛋白分離肽段量子化學(xué)計(jì)算螯合物結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.13 Simulation diagram of chelate structure computed by quantum chemistry of phycocyanin isolated peptide

2.9 FTIR 光譜分析

紅外光譜分析技術(shù)可以用來(lái)探究生物聚合物中分子官能團(tuán)的變化[29]。如圖14 所示，螺旋藻蛋白肽在3236 cm-1波段處有一個(gè)吸收峰，肽與亞鐵離子螯合后，吸收峰位移至3359 cm-1，說(shuō)明氨基酸的-N-H參與了亞鐵離子的螯合反應(yīng)，同時(shí)-N-H 的電子云密度由于-N-Fe 的形成而變得更強(qiáng)[30]。在1700～1600 cm-1處的吸收波段為酰胺-I 帶，在1600～1500 cm-1處的吸收波段為酰胺-Ⅱ帶，主要為-C=O鍵的拉伸、N-H 鍵的變形及-CN 鍵的拉伸引起的振動(dòng)[30]。Chen 等[31]研究EPAH-鈣螯合物的FTIR 光譜顯示，酰胺-I、酰胺-Ⅱ和N-H 帶的吸收峰發(fā)生移位，表明羧基氧和氨基氮原子提供了鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)。螺旋藻蛋白肽與亞鐵離子螯合后特征吸收峰從1651 cm-1紅移至1654 cm-1，可能是因?yàn)?C=O與亞鐵離子結(jié)合后發(fā)生了改變，且酰胺IV 帶從615 cm-1移動(dòng)到623 cm-1，表明螺旋藻蛋白肽的酰胺鍵也參與了螯合反應(yīng)[32]。1400 cm-1附近為-COO-伸縮振動(dòng)引起的吸收峰[33]，螺旋藻蛋白肽在1409 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰，螯合后藍(lán)移至1390 cm-1，考慮可能是-COOH 與Fe2+之間形成離子鍵，中和正電荷從而行成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。由于-C-O-伸縮振動(dòng)，在1099 cm-1處的吸收峰移動(dòng)到1138 cm-1的位置，可以推測(cè)-C-O-Fe 的形成[32]。以上結(jié)果說(shuō)明螺旋藻肽在與亞鐵離子發(fā)生反應(yīng)后產(chǎn)生了新結(jié)構(gòu)，鐵主要與谷氨酸和天冬氨酸的羧基、精氨酸的氨基、賴氨酸的胍基結(jié)合，且Fe 主要與O、N、H 產(chǎn)生靜電吸引作用而結(jié)合，鑲嵌在氨基酸電負(fù)性末端形成的空腔中，與上述螯合物的弱相互作用獨(dú)立梯度模型結(jié)果一致。

圖14 螺旋藻肽及肽亞鐵螯合物的傅里葉紅外光譜Fig.14 Fourier transform infrared spectroscopy of Spirulina peptide and peptide ferrous chelates

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化得到螺旋藻肽亞鐵螯合物的初步螯合條件，為pH6、肽亞鐵質(zhì)量比6:1、肽液濃度1%、溫度60 ℃、時(shí)間40 min，在此條件下螯合物得率為44.13%。通過(guò)對(duì)比氨基酸組成可知，谷氨酸和天冬氨酸的羧基、精氨酸的氨基、賴氨酸的胍基是主要的鐵結(jié)合位點(diǎn)；熒光光譜、分子量測(cè)定、掃描電鏡、多肽測(cè)序和量子化學(xué)計(jì)算模擬螯合物結(jié)構(gòu)分析表明，螯合反應(yīng)中螺旋藻肽發(fā)生了明顯折疊引起結(jié)構(gòu)改變，形成穩(wěn)定的螯合結(jié)構(gòu)。本研究證明了螺旋藻蛋白肽與亞鐵鹽螯合反應(yīng)后產(chǎn)生了新結(jié)構(gòu)，鐵主要與谷氨酸和天冬氨酸的羧基、精氨酸的氨基、賴氨酸的胍基結(jié)合，且鑲嵌在氨基酸電負(fù)性末端形成的空腔中，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，螺旋藻蛋白肽中存在鐵結(jié)合位點(diǎn)，具有螯合鐵的潛力。研究結(jié)論為闡明蛋白肽與金屬離子的螯合機(jī)理提供了依據(jù)，有助于推進(jìn)螺旋藻肽亞鐵螯合物的應(yīng)用。

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