趙子琪，劉燁瑀，于 爽，遲雪梅，金書(shū)寒，陳立功,4，張慶芳，王曉輝,*

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116000；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116622；3.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116622；4.深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，廣東深圳 518000）

果膠是一種廣泛存在于植物細(xì)胞壁中的復(fù)雜多糖，主鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)α-1,4-糖苷鍵聚合而成的D-吡喃半乳糖醛酸，側(cè)鏈則由各種多糖組成，如L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-半乳糖等[1]。果膠酶（pectinase）是指能降解果膠物質(zhì)的多酶復(fù)合體系，能夠降解果膠的多種結(jié)構(gòu)[2]。根據(jù)果膠酶對(duì)果膠物質(zhì)中半乳糖醛酸骨架的作用模式，可將該酶分為聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectate lyase，PL）與果膠甲酯酶（pectin methyl esterase，PE）三大類(lèi)[2]，不同的果膠酶切割果膠中不同類(lèi)型的α-1,4-糖苷鍵[3-4]。根據(jù)最適酶活性pH 又可將其分為堿性和酸性兩大類(lèi)[5-7]。堿性果膠酶主要應(yīng)用于食品生產(chǎn)過(guò)程中，幫助分解果膠，改善產(chǎn)品的質(zhì)地和口感[8]，對(duì)于胃腸道疾病患者來(lái)說(shuō)，果膠的有效降解可以減輕胃腸道的負(fù)擔(dān)，改善消化吸收。此外，果膠酶還可以用于治療炎癥和腫瘤等疾病，其降解果膠的能力可以幫助減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡[9-10]；在酒類(lèi)釀造過(guò)程中分解果膠，促進(jìn)酒液的澄清和過(guò)濾；預(yù)處理食品加工業(yè)中含果膠的廢水[11]，酸性果膠酶則主要用于提取和澄清果蔬汁和果酒，降低產(chǎn)品的渾濁度和黏度、選擇性水解組織中間薄片的多糖來(lái)保持植物細(xì)胞的完整性從而提高單細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量，單細(xì)胞產(chǎn)品可用作嬰兒制品、乳制品的成分[12]。

在果膠酶的天然來(lái)源中，微生物因其具有廣泛的適應(yīng)性、多樣的代謝途徑、高效的酶系統(tǒng)以及生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)條件易控制、分布廣等優(yōu)勢(shì)而成為了果膠酶的主要來(lái)源[13]。其中真菌、細(xì)菌、放線菌和酵母菌等都能產(chǎn)生果膠酶[14-15]，尤其以曲霉屬最為常見(jiàn)[16-17]。目前，全球果膠酶市場(chǎng)正處于快速增長(zhǎng)階段，幾乎占據(jù)全球酶市場(chǎng)的25%[18]。這主要得益于果制品行業(yè)的發(fā)展，以及人們對(duì)優(yōu)質(zhì)健康食品的需求增加。然而，相比于國(guó)外，我國(guó)對(duì)果膠酶的研究起步較晚[19-20]，無(wú)論是在研究水平、領(lǐng)域、手段方面還是開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面與國(guó)外都存有一定差距[19-21]。尤其是缺乏產(chǎn)高活性酶的菌種，目前能應(yīng)用于工業(yè)中的果膠酶多來(lái)源于真菌[22]，其大多存在產(chǎn)酶活性較低、能耗過(guò)高等問(wèn)題，因而無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)上的需求，導(dǎo)致效價(jià)高的商品果膠酶產(chǎn)量仍很低。因此，找到一種新型優(yōu)質(zhì)菌種來(lái)制備果膠酶是非常有必要的，海洋環(huán)境具有高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn)，能很大程度上賦予微生物果膠酶新的代謝機(jī)制與基因特性，有利于優(yōu)勢(shì)菌株的篩選。

本研究從海洋底泥樣品中篩選到一株高產(chǎn)低溫堿性果膠酶的放線菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA 序列測(cè)定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析確定該菌菌屬，并研究了其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，旨在發(fā)現(xiàn)新的優(yōu)質(zhì)低溫酶源微生物資源，推動(dòng)相關(guān)行業(yè)發(fā)展，同時(shí)該研究為后續(xù)提取果膠酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)和高效、低能耗大批量生產(chǎn)果膠酶提供了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海泥樣品 中國(guó)遼寧省大連市渤海海域（121°78′85.74′ E，39°01′79.06′ N）60～100 m 深度處海底泥；果膠 上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Bioscreen C 自動(dòng)微生物鑒定分析儀 Biolog 公司；CI－L 型顯微鏡 尼康儀器（上海）有限公司；BPC-150F 型培養(yǎng)箱 上海茸研儀器有限公司；Multiskan 1510 酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems 公司；D-37520 低溫冷凍離心機(jī) Thermo 公司；CRY-2112 恒溫?fù)u床 上海茸研儀器有限公司；DK-S600 電動(dòng)恒溫水浴鍋 上海景洪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 初篩培養(yǎng)基[21,23]（g/L）：果膠30.0，NaNO33.0，K2HPO4·3H2O 3.3，KCl 0.5，F(xiàn)e2（SO4）30.01，（NH4）2SO420，MgSO40.24，CaCl20.15，KH2PO43.8，溴酚藍(lán) 0.2，瓊脂粉20.0，pH 自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏粉5.0，蛋白胨8.0，氯化鈉10.0，pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基[24]（g/L）：果膠2.0，K2HPO40.01，MgSO40.05，F(xiàn)eSO40.001，（NH4）2SO42.0，pH 自然。

1.2.2 菌株分離純化與初篩 稱取海泥10.0 g，置于裝有若干玻璃珠和90 mL 無(wú)菌水的250 mL 錐形瓶中，放于恒溫?fù)u床，30 ℃、160 r/min、2 h 充分打散。再?gòu)纳鲜鲥F形瓶取1 mL 加入到99 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min 富集培養(yǎng)24 h。用0.85%（m/V）無(wú)菌生理鹽水對(duì)菌懸液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，將梯度為10-1～10-7的樣品稀釋液各取200 μL 涂布到初篩培養(yǎng)基上（每個(gè)梯度做3 組平行實(shí)驗(yàn)），25 ℃倒置培養(yǎng)48 h。待長(zhǎng)出菌落后，及時(shí)挑取長(zhǎng)勢(shì)良好、外觀不同的單菌落進(jìn)行分離純化，后將純化過(guò)的菌株點(diǎn)種在初篩培養(yǎng)基上（每株菌做三組平行實(shí)驗(yàn)），25 ℃倒置培養(yǎng)48 h。使用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)量培養(yǎng)基上的黃色水解圈直徑（Dp）和菌落直徑（Dc）[21]，挑選出Dp/Dc 值較大的6 株菌株作為復(fù)篩的目標(biāo)菌株[22]。

1.2.3 產(chǎn)果膠酶菌株的復(fù)篩 挑取初篩得到6 株單菌落分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。以接種量為2%（v/v）將活化24 h 的培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（100/250 mL）中，25 ℃、180 r/min 發(fā)酵72 h。發(fā)酵液4 ℃、8000 r/min 離心20 min 后，取等量上清液適當(dāng)稀釋作稀釋粗酶液，使用3,5-二硝基水楊酸法（DNS 法）[25]制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定酶活進(jìn)行復(fù)篩，底物為0.5%的果膠液。酶活力單位定義（U）：在25 ℃，pH 為7.0 的反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol 還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量。發(fā)酵液酶活力單位定義為每毫升發(fā)酵液含酶活單位（U/mL）。選取酶活最高的菌株，用甘油管保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)果膠酶活性曲線測(cè)定 粗酶液的制備：取復(fù)篩選出的菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基25 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。以接種量為2%（v/v）將活化24 h 的培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（100/250 mL）中，25 ℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h。將發(fā)酵液4 ℃、8000 r/min 離心20 min 后取上清液適當(dāng)稀釋即為粗酶液。

挑取上述酶活最高菌株的單菌落于基礎(chǔ)培養(yǎng)基（100/250 mL）中在25 ℃、180 r/min 培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，以未接種單菌落的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，當(dāng)培養(yǎng)液的OD600 值達(dá)到0.5 時(shí)，以接種量為1%（v/v）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用自動(dòng)微生物鑒定分析儀（每孔250 μL，25 ℃）進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，每隔8 h 檢測(cè)一次OD600，連續(xù)檢測(cè)4 d，得到連續(xù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)處的OD600 值并繪制生長(zhǎng)曲線[26]。

在每次檢測(cè)OD600 的同時(shí)，吸取1.7 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的果膠底物溶液于具塞比色管中，加入0.3 mL 稀釋酶液，25 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)30 min 后取出，加入3 mL DNS 試劑，充分混勻后立即用沸水浴30 min 滅活，然后定容至25 mL；以高溫煮沸滅活10 min 后的酶稀釋液作為空白對(duì)照[27-28]，各取200 μL于96 孔板中，用酶標(biāo)儀在540 nm 處測(cè)OD值，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組各做3 次平行實(shí)驗(yàn)取平均值，兩者的差值即為還原糖的產(chǎn)生量，后根據(jù)OD540 差值計(jì)算酶活大小并繪制產(chǎn)酶活性曲線。

1.2.5 菌株的形態(tài)鑒定 將復(fù)篩所得的最高酶活的菌株進(jìn)行平板劃線分離純化，25 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌株生長(zhǎng)狀況、菌落形態(tài)以及革蘭氏染色鏡下結(jié)果。

1.2.6 菌株的生理生化鑒定 利用Biolog 自動(dòng)鑒定儀檢測(cè)該菌株對(duì)碳源的利用率。參照文獻(xiàn)[15]所用方法。

1.2.7 菌株的16S rDNA 序列測(cè)定及同源性分析將保存的菌株平板送往大連寶生物公司并對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA 分析鑒定：采用PCR 擴(kuò)增目的片段，記錄擴(kuò)增序列結(jié)果并進(jìn)行電泳檢測(cè)，采用數(shù)據(jù)庫(kù)同源對(duì)比法，利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將目的菌株LY-1 的16S rDNA 序列與Gen-Bank/DDBJ/EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)中菌的16S rDNA 序列進(jìn)行比較鑒定，找出與目的菌株基因序列同源性較高的已知分類(lèi)地位的菌種。采用Mega X 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[29]。結(jié)合上述Biolog 自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)結(jié)果，進(jìn)行分析，得到準(zhǔn)確鑒定結(jié)果。

1.2.8 酶學(xué)特性研究

1.2.8.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性分析 在pH 為7 的條件下，將待測(cè)果膠酶液樣品分別在5～80 ℃的水浴環(huán)境下與果膠底物進(jìn)行酶反應(yīng)30 min，以DNS 法測(cè)定果膠酶酶活力，以最高酶活為100%計(jì)，繪制果膠酶最適反應(yīng)溫度的相對(duì)酶活曲線，得到最適反應(yīng)溫度。將果膠酶液樣品分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80 ℃下保溫處理2 h，后置于最適溫度的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)30 min，測(cè)定酶活力。以最大酶活值定義為100%，繪制果膠酶熱穩(wěn)定性的相對(duì)酶活曲線，每個(gè)溫度檢測(cè)3 組平行。

1.2.8.2 最適pH 和pH 穩(wěn)定性分析 分別配制不同pH3.0～12.0 的緩沖溶液，pH3.0～5.0 的Phosphate citrate 緩沖液、pH6.0～10.0 的Tris-HCl 緩沖液、pH為11.0～12.0 的Na2HPO4-NaOH 緩沖溶液。用不同pH 的緩沖溶液稀釋粗酶液并配制相應(yīng)pH 的果膠底物，用DNS 法在20 ℃條件下測(cè)不同pH 的果膠酶酶活力，將最大酶活值定義為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，繪制果膠酶最適反應(yīng)pH 的相對(duì)酶活曲線，得到酶的最適pH。將待測(cè)果膠酶液樣品在不同pH 緩沖液中放置2 h，再將其置于最適pH 條件下酶解反應(yīng)30 min，以最大活力為100%計(jì)，繪制果膠酶pH 穩(wěn)定性的相對(duì)酶活曲線。每個(gè)pH 檢測(cè)3 組平行。

1.2.8.3 兩種濃度下的不同金屬離子對(duì)酶活的影響 在溫度20 ℃、pH 為8 的情況下，在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 和5 mmol/L 且含有Co2+、Na+、Mn2+、Zn2+、Ba2+、Hg2+、Cu2+、K+、Mg2+、Ca2+的金屬離子試劑，在對(duì)照組中添加相應(yīng)體積的緩沖液PB，并在測(cè)量酶活性后計(jì)算其相對(duì)活性。每種金屬離子檢測(cè)3 組平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均為三組平行。使用 GraphPad Prism9.5.1軟件對(duì)篩菌結(jié)果、菌株生長(zhǎng)量以及酶活性高低等數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株初篩結(jié)果

如表1 所示，計(jì)算出培養(yǎng)基中菌株的Dp/Dc 值，并挑選出Dp/Dc 值較大的6 株作為目標(biāo)復(fù)篩菌株并繼續(xù)培養(yǎng)。其編號(hào)分別為L(zhǎng)Y-1，LY-6，LY-7，LY-9，LY-11，LY-16。其中LY-11 的Dp/Dc 值最大為5.28±0.35，LY-7 的Dp/Dc 最小為3.15±0.35。

表1 產(chǎn)果膠酶菌株初篩結(jié)果Table 1 Results of the initial screening of pectinaseproducing strains

2.2 產(chǎn)酶菌株復(fù)篩結(jié)果

根據(jù)DNS 法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.9614x+0.0276（R2=0.9880），表明線性擬合良好可用于果膠酶活力的計(jì)算。挑取上述初篩得到的Dp/Dc 值較大的菌株LY-1，LY-6，LY-7，LY-9，LY-11，LY-16 進(jìn)行平板劃線得到單菌落后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，用DNS 法對(duì)其粗酶液進(jìn)行酶活檢測(cè)，每株菌進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。因?yàn)槊富盍蜏y(cè)定的吸光度值呈正比例線性關(guān)系，故用吸光度值的大小來(lái)代表其粗酶液的酶活力的大小酶活檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示，其中編號(hào)為L(zhǎng)Y-1 的菌株酶活力（30.56 U/mL）顯著高于其他5 個(gè)菌株（P＜0.05）。

圖1 6 株菌的酶活測(cè)定Fig.1 Enzyme activity assay of 6 strains of bacteria

2.3 菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶活性曲線

復(fù)篩選出的Dp/Dc 值最大且酶活性最高的菌株LY-1 為目的菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定并用其制取的酶液進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果如圖2，菌株LY-1 接種發(fā)酵24 h 內(nèi)為遲緩期。接種后24～56 h 達(dá)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，生長(zhǎng)曲線上的活菌數(shù)呈線性增加，而酶活相對(duì)于生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)出了一定的滯后性，在32～64 h 內(nèi)呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，此時(shí)的菌株的形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，因此研究菌株的性狀以此時(shí)期為最好[30]。56 h 后進(jìn)入平穩(wěn)期，菌群的生長(zhǎng)總數(shù)處于較平坦的階段，酶活也在此段時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高值。接種72 h后為衰落期，酶活性也開(kāi)始同步減小，故確定接種后培養(yǎng)64 h 為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖2 LY-1 菌株生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酶活性曲線Fig.2 Growth curve and enzyme production activity curve of LY-1 strain

2.4 菌株的形態(tài)與鑒定

2.4.1 菌株的形態(tài) 如圖3a 所示在固體種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌株LY-1，單菌落形態(tài)為點(diǎn)或圓形，邊緣呈波狀，顏色為淺白或乳白色，表面扁平，無(wú)光澤，無(wú)氣味，表面干燥，不透明，菌落部分聚生，上似有一薄層“干粉”狀物質(zhì)，且菌株的革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，可初步鑒定為放線菌。圖3b 為菌株LY-1 的顯微形態(tài)，可見(jiàn)單菌株多呈球形或者橢球形，其分布特點(diǎn)大致為多菌聚集狀或單菌分散狀。

圖3 菌株LY-1 在平板上的菌落形態(tài)及在顯微鏡下的菌體形態(tài)Fig.3 Colony morphology of strain LY-1 on a plate and cell morphology under a microscope

2.4.2 LY-1 號(hào)菌株生理生化鑒定 通過(guò)Biolog 細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀對(duì)菌株的碳源利用率以及化學(xué)敏感程度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2 所示，對(duì)比鑒定后初步判斷該菌種為鏈霉菌屬Streptomycessp.LY-1，PROB 值為0.929，Organism Type 為革蘭氏陽(yáng)性鏈霉菌。

表2 菌株LY-1 碳源利用實(shí)驗(yàn)Table 2 Strain LY-1 carbon source utilisation experiments

用GenⅢ微孔板測(cè)試LY-1 菌株碳源利用度以及相關(guān)酶學(xué)特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表2 可知，該菌株充分利用了D-葡萄糖、柳醇、i-肌醇、D-甘露醇、山梨醇、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、果膠，也可以部分利用松三糖、D-半乳糖等碳源，而蔗糖、L-鼠李糖、棉子糖、海藻糖等其他碳源的利用率比較差。淀粉水解強(qiáng)，不產(chǎn)生硫化氫，不分解纖維素。明膠液化，牛奶凝固并胨化。

2.4.3 LY-1 菌株16S rDNA 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 菌株LY-1 的16S rDNA 測(cè)序長(zhǎng)度為1396 bp。如圖4 所示，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜結(jié)果中可以看到擴(kuò)增后的目的基因條帶介于1000 bp 和2000 bp 之間，與16S rDNA 測(cè)序結(jié)果相符。

圖4 菌株LY-1 的16S rDNA 電泳圖譜Fig.4 Electrophoretic profile of 16S rDNA of strain LY-1

通過(guò)菌落形態(tài)以及鏡下特征可以初步鑒定出所得的菌株LY-1 為放線菌，并結(jié)合其生理生化鑒定結(jié)果和培養(yǎng)特性的綜合比較，最終確定菌株LY-1 為鏈霉菌屬。將獲得的序列結(jié)果通過(guò)與Gen-Bank/DDBJ/EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因序列進(jìn)行同源對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)菌株LY-1 與放線菌橄欖灰鏈霉菌（Streptomyces olivogriseus）標(biāo)準(zhǔn)菌株AB184486.1 的相似度達(dá)到99.79%，表明兩者的親緣關(guān)系最近，結(jié)合上述菌株的形態(tài)及生理生化特征可以鑒定LY-1 為放線菌橄欖灰鏈霉菌，基于菌株16S rDNA 基因構(gòu)建的菌株LY-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5 所示。

圖5 基于菌株16S rDNA 基因構(gòu)建的菌株LY-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain LY-1 constructed based on 16S rDNA gene sequence

2.5 酶學(xué)特性

2.5.1 最適溫度以及溫度穩(wěn)定性 如圖6 中a 所示，菌株LY-1 從低溫至20 ℃區(qū)間酶活性呈上升趨勢(shì)，在15～25 ℃區(qū)間內(nèi)具有較高的酶活性，相對(duì)酶活高達(dá)90%以上，在20 ℃時(shí)菌株酶活達(dá)到最高值，故酶的最適反應(yīng)溫度在20 ℃左右，從20 ℃開(kāi)始，隨著溫度的升高，酶活性開(kāi)始緩慢下降，45 ℃以后，活性開(kāi)始下降至80%以下。根據(jù)Marx 等[31]的定義，通常把最適催化溫度在30 ℃左右而在0 ℃仍然具有催化效率的酶稱為低溫酶。真菌來(lái)源果膠酶最適作用溫度一般在30 ℃左右，如Sudeep 等[32]發(fā)現(xiàn)的Aspergillusspp.Gm 最適作用溫度為30 ℃，細(xì)菌果膠酶最適溫度相對(duì)于真菌果膠酶而言較高，能夠達(dá)到50～60 ℃。而上述結(jié)果表明該菌株所產(chǎn)果膠酶的最適作用溫度為20 ℃具有良好的低溫耐受性并且對(duì)常溫也有一定的抵抗能力；對(duì)酶的熱穩(wěn)定性研究如圖6 中b 所示：當(dāng)溫度升至60 ℃時(shí)保存2 h 其酶活性仍在70%以上，說(shuō)明此酶對(duì)溫度的適應(yīng)性較強(qiáng)[32]，更適合工業(yè)生產(chǎn)。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)果膠酶活力的影響（a）及果膠酶的熱穩(wěn)定性（b）Fig.6 Effect of fermentation temperature on pectinase activity(a) and thermostability of pectinase (b)

2.5.2 最適pH 及pH 穩(wěn)定性 對(duì)酶的最適pH，pH 穩(wěn)定性分析，結(jié)果如圖7 中a 所示，酸堿度會(huì)極大影響酶的的活性和穩(wěn)定性，隨著pH 的逐步升高，酶活力逐步上升，當(dāng)pH 為8.0 時(shí)，酶活達(dá)到最大，故此果膠酶的最適pH 在8.0 左右，即弱堿性環(huán)境下酶活達(dá)到最大，pH 過(guò)高或者偏低的情況下，酶活較低，當(dāng)pH 小于7.0（大于9.0）時(shí)，酶活性下降的較快。如圖7 中b 所示，果膠酶表現(xiàn)很高的pH 穩(wěn)定性，在pH為7.0～9.0 范圍內(nèi)保溫處理2 h，酶的殘余活力均在90%以上，在堿性環(huán)境（pH 為8.0～10.0）中隨著pH逐步升高酶的穩(wěn)定性在緩慢下降，但在pH 為10 的環(huán)境下仍能穩(wěn)定在80%以上。說(shuō)明該果膠酶在較寬的堿性范圍內(nèi)是非常穩(wěn)定的。

圖7 初始pH 對(duì)果膠酶活力的影響（a）及果膠酶的pH 穩(wěn)定性（b）Fig.7 Effect of different initial pH on pectinase activity (a) and pH stability of pectinase (b)

2.5.3 金屬離子對(duì)酶活的影響 不同金屬離子對(duì)果膠酶酶活影響不同。如圖8 所示，在果膠酶酶解反應(yīng)過(guò)程中加入不同金屬離子，1 和5 mmol/L 的Cu2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、k+、Co2+處理組相對(duì)酶活（%）均顯著大于對(duì)照組（P＜0.001），對(duì)果膠酶起促進(jìn)作用，Ba2+、Mg2+、K+和Ca2+在海洋中含量豐富，研究也表明其對(duì)海洋低溫酶活性有顯著促進(jìn)作用。其中Cu2+、Ba2+最為顯著（P＜0.001）且高濃度下的促進(jìn)作用較為明顯，在濃度為5 mmol/L 的條件下相對(duì)酶活達(dá)到了150%以上，可能是由于Ba2+、Cu2+與酶結(jié)合后改變了酶的空間結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定了酶蛋白活性的構(gòu)象，進(jìn)而提高酶活力[33]。而Mn2+、Zn2+、Hg2+、Na+處理組相對(duì)酶活力（%）小于對(duì)照組（P＜0.001），對(duì)果膠酶的酶活起抑制作用且高濃度下的抑制作用也較為明顯。由于Hg2+具有氧化巰基抑制酶活的特性，說(shuō)明該果膠酶活性中心附近可能有半胱氨酸殘基[34]。而Mn2+、Zn2+抑制酶活性可能是由于這兩種離子破壞了該酶的三維構(gòu)象，使其更易發(fā)生失活所導(dǎo)致的，所以Mn2+、Zn2+、Hg2+對(duì)該果膠酶有顯著的抑制作用。

圖8 不同濃度及種類(lèi)的金屬離子對(duì)LY-1 菌株酶活的影響Fig.8 Effects of different concentrations and types of metal ions on the enzyme activity of LY-1 strain

3 結(jié)論

以果膠為唯一碳源，利用透明圈法和DNS 法從渤海灣底泥中篩出一株高產(chǎn)低溫果膠酶的菌株LY-1，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化分析以及16S rDNA 測(cè)序分析，并在NCBI 等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)Mega構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最終確認(rèn)為是橄欖灰鏈霉菌（Streptomyces olivogriseus）。經(jīng)過(guò)酶學(xué)特性研究，發(fā)現(xiàn)此菌產(chǎn)果膠酶的最適溫度為20 ℃，在4 ℃下仍能保持70%以上的酶活力，與大部分真菌、細(xì)菌等來(lái)源的果膠酶相比具有明顯的低溫酶特性及冷適應(yīng)性，在60 ℃保存2 h 酶活仍在70%以上，表明該低溫酶也具有一定的熱穩(wěn)定性；最適酶反應(yīng)pH 為8.0，在pH 為7.0～9.0 處理2 h，其酶活力均可維持80%以上，表明該果膠酶的堿耐受性較好；金屬離子Cu2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、K+、Co2+對(duì)果膠酶活性有促進(jìn)作用，以Ba2+、Cu2+最為顯著（0.0001＜P＜0.001），而金屬離子Mn2+、Zn2+、Hg2+對(duì)果膠酶活性則有明顯的抑制作用。后續(xù)研究中可對(duì)其進(jìn)行基因克隆、酶蛋白修飾等從而進(jìn)一步提高酶活性，為開(kāi)發(fā)更高效、環(huán)境友好的生產(chǎn)工藝及低溫堿性果膠酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

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