郭雅卿，王東澍，朱 力，張惟材，劉 穎,*，王恒樑,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150028；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071）

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一種不同于煙酰胺和核黃素的第三類(lèi)氧化還原酶的輔酶[1]，具有增強(qiáng)抗氧化酶活性、促進(jìn)生成神經(jīng)生長(zhǎng)因子、抗輻射、預(yù)防慢性心力衰竭、抗高原缺氧等作用[2-5]，在功能性食品和醫(yī)藥行業(yè)都具有良好的開(kāi)發(fā)前景。目前，合成PQQ 的方式主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[6]。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法具有污染小、成本低、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，因此在工業(yè)化生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[7]。迄今自然界中只有某些革蘭氏陰性菌能夠產(chǎn)生PQQ，其中甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌的PQQ 合成水平最高[8-9]。甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，MDH）是甲基營(yíng)養(yǎng)菌代謝甲醇的關(guān)鍵酶，首先催化甲醇還原PQQ 生成PQQH2，并以細(xì)胞色素c 作為電子受體，將兩個(gè)電子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞色素c，在該過(guò)程中自由基半醌會(huì)將PQQH2再氧化回PQQ[10-11]。

甲醇脫氫酶存在于細(xì)胞周質(zhì)中，有MxaFI和XoxF兩種類(lèi)型[12-13]。MxaFI是由MxaF和MxaI所編碼的兩個(gè)α大亞基和兩個(gè)β小亞基組成的四聚體（α2β2），其中MxaF的活性位點(diǎn)需要Ca2+和PQQ 作為輔基[14-15]；XoxF型MDH 需要在活性位點(diǎn)上結(jié)合鑭系元素（如鑭或鈰等）和PQQ 才具有生物活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)甲醇的氧化[16]。HIBI 等[17]從含有La3+培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中純化的MDH 對(duì)應(yīng)于XoxF，而從Ca2+生長(zhǎng)的菌體中純化得到的MDH 與MxaF相對(duì)應(yīng)。在甲醇代謝過(guò)程中，MxaFI和XoxF兩種類(lèi)型的MDH 存在著某種聯(lián)系和分工。CHISTOSERDOVA 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MxaF缺陷菌株不能在甲醇上生長(zhǎng)，且認(rèn)為在甲基營(yíng)養(yǎng)菌中Ca2+依賴型的MxaF型MDH 是甲醇代謝中唯一活躍的MDH；后又發(fā)現(xiàn)缺失XoxF1和XoxF2的菌株不能利用甲醇作為碳源和能源生長(zhǎng)，且?guī)缀跬耆珕适Ъ状济摎涿富钚裕cMxaF敲除菌株的表型相同。隨著對(duì)甲醇脫氫酶的深入研究，發(fā)現(xiàn)La3+能夠?qū)状济摎涿高M(jìn)行調(diào)控。NAKAGAWA 等[18]向MxaF缺失株的培養(yǎng)基中補(bǔ)充La3+，發(fā)現(xiàn)能夠恢復(fù)菌體的生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)表明XoxF在菌株AM1 中作為L(zhǎng)a3+依賴型的MDH 參與甲醇代謝。

甲醇脫氫酶對(duì)菌株生長(zhǎng)及PQQ 合成有較大的影響[19]，李淼鑫等[20]發(fā)現(xiàn)提高M(jìn)DH 的表達(dá)水平能夠影響PQQ 的生物合成水平。孫曉宇等[21]通過(guò)突變甲醇脫氫酶的啟動(dòng)子來(lái)降低其活性，達(dá)到了提高PQQ 產(chǎn)量的目的。李大攀等[22]將MDH 基因敲除后，MDH 的活力、PQQ 合成水平及氧化甲醇的能力均下降。本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離篩選得到一株P(guān)QQ 產(chǎn)生菌食葡糖食甲基桿菌MP688，能夠以甲醇為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，后經(jīng)多輪物理和化學(xué)誘變得到了高產(chǎn)菌株J1-1。在前期研究結(jié)果中，將菌株J1-1中的mpq0771基因敲除后，敲除菌不能利用甲醇生長(zhǎng)，與Ca2+依賴的MDH 特征相似[21]?，F(xiàn)經(jīng)過(guò)基因比對(duì)分析，在基因組上找到了另外一個(gè)甲醇脫氫酶基因mpq2496，推測(cè)可能為L(zhǎng)a3+依賴的MDH。通過(guò)考察菌株生長(zhǎng)狀態(tài)、PQQ 合成、MDH 表達(dá)及酶活等因素，初步分析了mpq0771和mpq2496基因在菌株生長(zhǎng)代謝中的作用和關(guān)系，為闡明甲醇脫氫酶在食甲基桿菌的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提了供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食葡糖食甲基桿菌（Methylobacterium glucophilum）J1-1、大腸桿菌（Escherichia coli）pTIG、敲除菌J1-1Δmpq0771本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶（10 U/μL）、瓊脂糖凝膠DNA 回收純化試劑盒 賽默飛世爾科技公司；Pfu DNA 聚合酶（2.5 U/μL）、2×Basic Assemble Mix 北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α北京擎科生物科技有限公司；甲醇、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2、檸檬酸鐵 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LaCl3·7H2O、慶大霉素（Gentamicin，Gm）、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）分析純，上海源葉生物科技有限公司；Tris-HCl 分析純，北京酷萊博科技有限公司；LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，121 ℃滅菌；MP 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO43.0 g/L，CaCl230.0 mg/L，MnCl2·4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵30.0 mg/L，115 ℃滅菌，使用時(shí)添加甲醇至10 mL/L，得到MP 培養(yǎng)基，在MP 培養(yǎng)基中添加CaCl2或LaCl3的至終濃度為30 μmol/L，得到含各種金屬離子的培養(yǎng)基。

A-14 型常溫高速離心機(jī)、1-15K 型低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Sigma 公司；9080 型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技公司；BP211D 型分析天平（精度0.01 mg） 德國(guó)Sartorius 公司；DYY-Ⅲ-8B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀 北京六一儀器廠；WDP-160 型低溫振蕩搖床 北京沃德創(chuàng)新醫(yī)藥科技中心；Gel-pro 2020D 型凝膠成像儀 美國(guó)Pharmacia Biotech 公司；FLC-3 型超凈臺(tái) 哈爾濱東聯(lián)有限公司；PRO-2612433 型金屬浴 北京金銀杏生物科技有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩搖床 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CFX96TM 型熒光定量PCR 儀、MiniPROTEAN?3 Cell 型蛋白電泳儀 美國(guó)Bio-RAD 公司；T-1 型PCR 儀 德國(guó)Biometra 公司；UV-2100 型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)UNICO 公司；VC505 型超聲細(xì)胞破碎儀 美國(guó)Sonics 公司；Milropulser 型電轉(zhuǎn)化儀北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 利用J1-1 基因組序列和生物信息學(xué)分析篩選出基因組中甲醇脫氫酶基因，再通過(guò)BLAST 與扭脫甲基桿菌AM1 中的甲醇脫氫酶基因進(jìn)行比對(duì)分析?；蚝偷鞍仔蛄蝎@得及序列比對(duì)分析網(wǎng)址：http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，MP688登錄號(hào)為CP002252.1，AM1 登錄號(hào)為CP001510.1。

1.2.2 分子生物學(xué)操作 基因組提取、質(zhì)粒提取、PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學(xué)操作參照文獻(xiàn)[23]方法。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 文中所需引物序列如表1。

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.2.4 敲除菌J1-1Δmpq0771的構(gòu)建 以J1-1 基因組為模板，采用表1 引物UP-F、UP-R、DOWN-F、DOWN-R 分別擴(kuò)增上、下游同源臂基因片段（1500 bp），引物Gm-F 和Gm-R 擴(kuò)增Gm 抗性基因片段（789 bp），產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒純化。pTIG 質(zhì)粒用EcoRI、XhoI 內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37 ℃反應(yīng)2 h，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收。將上述回收產(chǎn)物利用2×Basic Assemble Mix 重組試劑盒進(jìn)行連接，獲得的產(chǎn)物通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后涂布至含有Amp 抗性的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)。挑取單克隆并活化，菌液PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果為陽(yáng)性的菌液進(jìn)行測(cè)序鑒定。鑒定結(jié)果正確后，提取質(zhì)粒pTIGUP-Gm-DOWN，以該質(zhì)粒為模板，使用引物UP-F、DOWN-R 擴(kuò)增片段UP-Gm-DOWN，片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，回收后電擊轉(zhuǎn)入J1-1 感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)Gm 抗性篩選得到敲除菌J1-1Δmpq0771。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線及PQQ 生物合成測(cè)定 將菌株接種至MP 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 進(jìn)行活化，活化后分別接種至含有不同金屬離子的培養(yǎng)基中，每隔12 h 測(cè)定OD600及PQQ 合成水平，繪制生長(zhǎng)曲線及PQQ 合成曲線圖，PQQ 測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[24]中的光譜法。

1.2.6 甲醇脫氫酶酶活測(cè)定 取1 mL 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的菌液，10000 r/min 離心10 min 后棄上清，重懸于1 mL 20 mmol/L 的Tris-HCl（pH7.0）緩沖液中，置于冰浴中超聲處理，4 ℃低溫10000 r/min 離心5 min，上清液用于酶活性檢測(cè)，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[20]。

1.2.7 甲醇脫氫酶蛋白表達(dá)測(cè)定 取1 mL 已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的菌液，12000 r/min 離心1 min 后棄上清，重懸于500 μL 1×TE（10 mmol/L pH8.0 Tris-HCl）緩沖液中，置于冰上進(jìn)行超聲破碎（工作3 s，間歇3 s，2 min）。破碎后的菌液在12000 r/min 下離心1 min，取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.2.8 質(zhì)譜鑒定 目的電泳條帶切下裝入無(wú)酶EP管中，封口膜封閉管口，送至北京華大基因有限公司進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將菌株J1-1 分別接種至甲醇/無(wú)、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，利用試劑盒提取RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下mpq0771、mpq2496基因相對(duì)表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Microsoft Excel 進(jìn)行繪圖；序列比對(duì)使用DNAMAN 軟件進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株J1-1 中甲醇脫氫酶基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)對(duì)J1-1 全基因組序列系統(tǒng)的比對(duì)，J1-1 中mpq0771基因與MxaF基因的核苷酸序列同源性為72%，氨基酸序列同源性為53%；mpq2496基因與XoxF基因的核苷酸序列同源性為66%，氨基酸序列同源性為53%；mpq0771基因與mpq2496基因的核苷酸序列同源性為61%，氨基酸序列同源性為48%。如圖1 所示，與MxaF 型MDH 的氨基酸序列的D303、E177 對(duì)應(yīng)mpq0771 的D323、E198，推測(cè)為催化反應(yīng)過(guò)程中所必需的，與Ca2+發(fā)生相互作用[25]；如圖2 所示，與XoxF 型MDH 的氨基酸序列的D320 對(duì)應(yīng)mpq2496 的D357，推測(cè)參與催化反應(yīng)并與La3+進(jìn)行配位[26]。綜上結(jié)果提示，在菌株J1-1 中可能也存在兩種類(lèi)型的甲醇脫氫酶。

圖1 mpq0771 中198、323 位氨基酸序列與MxaF 中177、303 位氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Alignment of amino acid sequences 198 and 323 in mpq0771 and 177 and 303 in MxaF

圖2 mpq2496 中357 位氨基酸序列與XoxF 中320 位氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of amino acid sequences 320 in mpq2496 and 357 in XoxF

2.2 Ca2+、La3+對(duì)菌株J1-1 生長(zhǎng)及PQQ 生物合成的影響

將菌株J1-1 分別在甲醇/無(wú)、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+4 種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔12 h取樣測(cè)定其OD600及PQQ 產(chǎn)量并繪制曲線（如圖3）。菌株J1-1 在含有Ca2+、La3+的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率均高于在無(wú)離子添加培養(yǎng)下的生長(zhǎng)速率。前期時(shí)，菌株J1-1 在添加Ca2+條件下的PQQ 合成量高于野生菌，后期時(shí)合成量低于野生菌；菌株J1-1 在兩種含La3+培養(yǎng)基中的PQQ 合成量一直低于野生菌。實(shí)驗(yàn)表明Ca2+、La3+均能夠促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但會(huì)顯著降低PQQ 合成量。

圖3 菌株J1-1 在不同培養(yǎng)條件下表型圖Fig.3 Phenotypic maps of J1-1 strain under different culture conditions

2.3 Ca2+、La3+對(duì)菌株J1-1 甲醇脫氫酶活力的影響

取1 mL 在甲醇/無(wú)、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+4 種培養(yǎng)基中的J1-1 菌液，測(cè)定甲醇脫氫酶總酶活。如圖4 所示，在甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+的培養(yǎng)條件下，菌株J1-1 的甲醇脫氫酶活性高于甲醇/Ca2+的培養(yǎng)條件。前期研究表明，菌株J1-1 的甲醇脫氫酶活性與PQQ 產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，MDH 氧化甲醇速率加快，導(dǎo)致生成的甲醛累積，菌體“中毒”，從而PQQ 產(chǎn)量下降[21]，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與J1-1在甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+中的PQQ 合成量低于甲醇/Ca2+的現(xiàn)象相符。

圖4 菌株J1-1 在不同培養(yǎng)條件下甲醇脫氫酶酶活測(cè)定Fig.4 Determination of methanol dehydrogenase activity of strain J1-1 under different culture conditions

2.4 Ca2+、La3+對(duì)菌株J1-1 甲醇脫氫酶蛋白表達(dá)的影響

取1 mL 在甲醇/無(wú)、甲醇/Ca2+、甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+4 種培養(yǎng)基中的J1-1 菌液，進(jìn)行超聲處理，取全菌進(jìn)行SDS-PAGE，蛋白電泳圖譜如圖5。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，65 kDa 處的蛋白條帶為mpq0771基因編碼的甲醇脫氫酶。mpq0771 在甲醇/無(wú)（泳道1 和2）、甲醇/Ca2+（泳道3 和4）條件下有明顯的表達(dá)；在甲醇/La3+（泳道5 和6）和甲醇/Ca2++La3+（泳道7 和8）的條件下無(wú)肉眼可見(jiàn)的條帶，但在其上方處出現(xiàn)一條蛋白表達(dá)量增加的條帶（蛋白分子量大約為68 kDa），膠內(nèi)酶切并進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。質(zhì)譜結(jié)果如表2 所示，該蛋白條帶與mpq2496基因編碼的甲醇脫氫酶匹配最佳，分值為4757，覆蓋率為46%，且分子量大小也相符。以上結(jié)果顯示mpq2496與文獻(xiàn)[27-28]報(bào)道中XoxF 的特征相似，La3+存在時(shí)XoxF 基因表達(dá)更強(qiáng)。

圖5 菌株J1-1 在不同培養(yǎng)條件下蛋白表達(dá)圖Fig.5 Protein expression map of J1-1 strain under different culture conditions

表2 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of mass spectrum detection

2.5 Ca2+、La3+對(duì)菌株J1-1 甲醇脫氫酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

以cDNA 為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，測(cè)定菌株J1-1 在不同條件下mpq0771、mpq2496基因相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果分別如圖6a 和圖6b 所示。mpq0771和mpq2496 參與甲醇代謝并發(fā)揮作用，且Ca2+、La3+對(duì)二者的表達(dá)水平均有影響。與甲醇/無(wú)條件相比，La3+存在時(shí)，mpq2496的表達(dá)水平均上調(diào)，mpq0771的表達(dá)水平均下調(diào)。與SDS-PAGE 電泳結(jié)果相符，無(wú)離子添加和只添加Ca2+時(shí)，mpq0771 表達(dá)水平較高，但在La3+存在時(shí)，mpq0771 表達(dá)受到阻遏，mpq2496 表達(dá)被激活。WANG 等[29]研究也表明La3+可能會(huì)阻遏Ca2+依賴型酶和其他蛋白表達(dá)。

圖6 不同基因在不同培養(yǎng)條件下相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relative expression of different genes under different culture conditions

2.6 Ca2+、La3+對(duì)敲除菌J1-1Δmpq0771 生長(zhǎng)及PQQ生物合成的影響

mpq0771所編碼的甲醇脫氫酶是菌株J1-1 能夠利用甲醇進(jìn)行生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因，在甲醇代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如圖7a 所示，菌株J1-1 在缺失mpq0771基因后，培養(yǎng)5 d 后其菌密度仍低于0.2，不能利用甲醇生長(zhǎng)。圖7b 為PQQ 合成量圖，結(jié)果顯示J1-1Δmpq0771菌株可在含La3+的培養(yǎng)基中利用甲醇生長(zhǎng)并能合成PQQ，說(shuō)明有除mpq0771基因編碼的甲醇脫氫酶在發(fā)揮作用，使菌株能夠正常生長(zhǎng)。

圖7 敲除菌J1-1Δmpq0771 在不同培養(yǎng)條件下表型圖Fig.7 Phenotypic maps of J1-1Δmpq0771 knockout strain under different culture conditions

2.7 Ca2+、La3+對(duì)敲除菌J1-1Δmpq0771 甲醇脫氫酶活力的影響

如圖8 所示，敲除菌J1-1Δmpq0771在Ca2+的培養(yǎng)基中不能利用甲醇進(jìn)行生長(zhǎng)，檢測(cè)不到甲醇脫氫酶的活性；在甲醇/La3+和甲醇/Ca2++La3+條件下的甲醇脫氫酶酶活，敲除菌J1-1Δmpq0771可以利用甲醇且能檢測(cè)到甲醇脫氫酶活性，說(shuō)明mpq2496 能夠發(fā)揮甲醇脫氫酶的作用，也進(jìn)一步反映了甲醇脫氫酶對(duì)于菌株利用和代謝甲醇的重要性。

圖8 敲除菌J1-1Δmpq0771 在不同培養(yǎng)條件下甲醇脫氫酶酶活測(cè)定Fig.8 Determination of methanol dehydrogenase activity of J1-1Δmpq0771 knockout strain under different culture conditions

2.8 Ca2+、La3+對(duì)敲除菌J1-1Δmpq0771 甲醇脫氫酶蛋白表達(dá)的影響

敲除菌J1-1Δmpq0771的SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖9 所示。J1-1Δmpq0771在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，但可在果糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在MP/果糖中J1-1Δmpq0771（泳道2）相較于野生菌J1-1（泳道1）的蛋白指紋圖譜缺失一條65 kDa 的甲醇脫氫酶蛋白條帶，說(shuō)明在J1-1Δmpq0771中mpq0771 編碼的甲醇脫氫酶不能正常表達(dá)，也印證了敲除基因mpq0771后菌株不能再利用甲醇。J1-1Δmpq0771菌株在La3+（泳道3）和Ca2++La3+（泳道4）的培養(yǎng)條件下，mpq2496編碼的甲醇脫氫酶蛋白表達(dá)量較野生菌高，說(shuō)明當(dāng)La3+存在時(shí)，mpq2496 能夠代替mpq0771 發(fā)揮甲醇脫氫酶的作用，即能夠利用甲醇進(jìn)行生長(zhǎng)。

圖9 敲除菌J1-1Δmpq0771 在不同培養(yǎng)條件下蛋白表達(dá)圖Fig.9 Protein expression profiles of J1-1Δmpq0771 knockout bacteria under different culture conditions

3 結(jié)論

在菌株J1-1 中存在著兩種類(lèi)型的甲醇脫氫酶，mpq0771基因編碼的是Ca2+依賴的MxaF 型MDH，mpq2496基因編碼的是La3+依賴的XoxF 型MDH，且均參與甲醇代謝。通過(guò)考察Ca2+、La3+對(duì)菌株J1-1生長(zhǎng)狀態(tài)、PQQ 合成、MDH 表達(dá)及酶活等的影響，發(fā)現(xiàn)敲除mpq0771基因會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)及對(duì)甲醇的利用產(chǎn)生較大影響，提示該基因在甲醇代謝中的重要性，且當(dāng)其表達(dá)量高時(shí)PQQ 合成水平較高。研究還發(fā)現(xiàn)，La3+能使敲除菌J1-1Δmpq0771利用并代謝甲醇，該結(jié)果反映了La3+存在時(shí)mpq2496 可以代替mpq0771 發(fā)揮甲醇脫氫酶的作用，維持菌體生長(zhǎng)，即La3+可使XoxF 型MDH 成為食甲基桿菌的主要甲醇脫氫酶[30]，mpq0771 與mpq2496 之間還具有分工作用。

綜上，菌株J1-1 中mpq0771及mpq2496基因編碼的甲醇脫氫酶在甲醇代謝中具有重要作用，也進(jìn)一步說(shuō)明了甲醇脫氫酶是甲醇代謝過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)[31]。菌株J1-1 中的兩種甲醇脫氫酶具有高表達(dá)的特性，提示可利用基因工程技術(shù)對(duì)此開(kāi)發(fā)一種表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)。甲基營(yíng)養(yǎng)菌具有特殊的一碳代謝網(wǎng)絡(luò)，可實(shí)現(xiàn)利用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，如化工產(chǎn)品、天然產(chǎn)物、食品添加劑等[32-33]，因此對(duì)甲醇脫氫酶作用的研究不僅可為后續(xù)深入研究甲基營(yíng)養(yǎng)菌甲醇利用途徑提供理論依據(jù)，還有利于生物發(fā)酵業(yè)的發(fā)展。

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